UPLC-MS/MS同時測定水質中諾氟沙星和氧氟沙星

周桂萍

（廣東產品質量監(jiān)督檢驗研究院，廣東 廣州 510330）

UPLC-MS/MS同時測定水質中諾氟沙星和氧氟沙星

周桂萍

（廣東產品質量監(jiān)督檢驗研究院，廣東 廣州 510330）

建立了超高效液相色譜―串聯(lián)質譜/質譜法（HPLC-MS/MS）同時測定水質中諾氟沙星和氧氟沙星的分析方法。試樣經(jīng)HLB柱凈化和C18柱分離，采用電噴霧離子源（ESI），正離子掃描，多反應監(jiān)測（MRM）模式進行檢測，外標法定量。結果表明，諾氟沙星和氧氟沙星在2～100 μg/L 濃度范圍內線性關系良好，空白樣品加標回收率均大于85%，相對標準偏差小于10%，諾氟沙星和氧氟沙星方法檢出限（LOD）均為0.5 ng/mL，定量限為2 ng/mL。該方法準確、靈敏、操作相對簡便，適用于同時測定水質中諾氟沙星和氧氟沙星。

超高效液相色譜―串聯(lián)質譜/質譜法；水質；諾氟沙星；氧氟沙星

因此，本文建立固相萃取―超高效液相色譜―串聯(lián)質譜法同時測定水質中氧氟沙星和諾氟沙星，具有靈敏度高、定性能力強等優(yōu)點，應用于實際樣品檢測，結果令人滿意。

1　實驗

1.1試劑與儀器

諾氟沙星標準品，純度大于99%，德國Dr. Ehrenstorfer公司；氧氟沙星標準品，純度大于99%，德國Dr. Ehrenstorfer公司；甲酸，優(yōu)級純，德國CNW公司；氮氣，純度大于99.999 %；超純水，18.2 M?。ACQUITYTM超高效液相色譜和Waters XevoTMTQ MS 三重四極桿串聯(lián)質譜儀，美國Waters公司；Milli-Q去離子水發(fā)生器，美國Millipore公司；Oasis HLB固相萃取柱，60 mg/3 mL，Waters公司；HLB固相萃取柱活化使用前均依次用6 mL甲醇、6 mL水活化。

1.2標準溶液配制

稱取氧氟沙星和諾氟沙星標準品于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解配制成濃度為100 mg/L的儲備液。再用初始流動相逐級稀釋配制2、10、25、50、75、100 μg/L標準工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3HPLC-MS/MS檢測條件

色譜柱Shim-pack XR-ODS3 C18（75×2.0 mm，1.6 μm），柱溫40℃，流速0.2 mL/min，樣品室溫度15℃，流動相A：0.1%甲酸―乙腈，流動相B：0.1%甲酸―水，進樣體積10 μL。

梯度洗脫程序：0～6 min，10%～60%A；6～11 min，60%A，保持5 min；11～11.1 min，60%～10%A。質譜條件：電噴霧離子源（ESI），源溫度150℃，正離子掃描模和多反應監(jiān)測（MRM）模式，脫溶劑氣溫度350℃，脫溶劑氣流量550 L/h，碰撞氣流量0.13 mL/min，毛細管電壓2.82 kV。

1.4樣品前處理

取水樣50 mL，過HLB柱凈化，樣品全部過柱后，抽干，用5 mL甲醇洗脫，35℃水浴氮氣吹至近干，加入1.0 mL0.2%甲酸―水溶液溶解，過0.45 μm濾膜，供液相色譜―串聯(lián)質譜檢測。

2　結果與討論

2.1色譜條件優(yōu)化

諾氟沙星和氧氟沙星屬于氟喹諾酮類抗生素，分子結構式中含有哌嗪基和羧基，屬于酸堿兩性化合物，結構中的羧基團和叔胺基能在水中發(fā)生解離，液相色譜分析時易發(fā)生色譜峰拖尾現(xiàn)象，因固定相表面的活性位點（游離的硅醇基）可通過氫鍵等強烈吸附氧氟沙星和諾氟沙星。為保證待測物在流動相中的穩(wěn)定溶解狀態(tài)，本研究比較了在乙腈與3 mmol/L 乙酸銨、0.1%甲酸、0.2%甲酸、0.3%甲酸等揮發(fā)性酸或揮發(fā)性鹽對待測物色譜行為的影響。結果表明，以0.1%甲酸水溶液―0.1%甲酸―乙腈為流動相，采用梯度洗脫方式可獲得最優(yōu)的質譜信號響應，待測物雖然沒有完全分離，但并不影響定性定量。

2.2流量條件的選擇

對流量的選擇，對比了在0.2 mL/min～0.5 mL/min 流量范圍內，諾氟沙星和氧氟沙星的質譜信號響應及色譜分離效果。結果表明，UPLC 在0.2 mL/min 流量下，分離效果、質譜響應值、色譜柱的柱壓以及分析時間均比較理想。

2.3質譜測定條件的優(yōu)化

首先以流動注射的方式將1 mg/L 的諾氟沙星標準溶液在質譜正離子模式下進行母離子全掃描，確定分子離子，然后分別以分子離子為母離子，對其子離子進行全掃描。由于諾氟沙星含有羧基和哌嗪結構，在0.1%甲酸水溶液―0.1%甲酸―乙腈流動相條件下，容易獲得[M+H]+準分子離子，通過改變碰撞能力和錐孔電壓，對準分子離子碰撞，獲取子離子，定量離子選擇為豐度最強的碎片離子，定性離子選擇為次強碎片離子，獲得的最佳質譜條件如表1所示。

表1　氧氟沙星和諾氟沙星保留時間及質譜檢測參數(shù)

2.4凈化條件的優(yōu)化

諾氟沙星和氧氟沙星屬于酸堿兩性化合物，具有較高的極性，能在水中發(fā)生解離。SPE柱中 HLB柱反相吸附劑具有親水親脂性且水可浸潤，是中性、酸性及堿性化合物的通用型小柱；WAX柱反相吸附劑為混合型弱陰離子，對強酸性化合物選擇性好。對比分析了 HLB柱和 WAX柱萃取效率，結果發(fā)現(xiàn)，HLB柱萃取效率較好，對諾氟沙星和氧氟沙星回收率為85.2%～89.4%，而 WAX柱平均回收率為55.2%～65.0%。實驗結果如表2所示，因此，本實驗采用HLB固相萃取柱作為樣品凈化柱。

表2　諾氟沙星和氧氟沙星回收率和相對標準偏差（RSD）（n＝6）

2.5線性范圍和檢出限

基質效應表現(xiàn)為對待測物的信號起抑制或增強作用，直接影響檢測結果的準確性。按照Matuszew ski等建立的數(shù)學模型，采用空白基質提取后添加標準品的方法，考察基質效應的影響。實驗結果表明，經(jīng)HLB柱凈化后，諾氟沙星和氧氟沙星未受到基質抑制影響。

諾氟沙星和氧氟沙星在2～100 μg/L濃度范圍內線性相關性好，相關系數(shù)0.998。以陰性水質樣品作為本底，采用加標的方式考察方法的定量限（LOQ）和檢出限（LOD）。結果表明，諾氟沙星和氧氟沙星在水質中的檢出限（S/N≥3）為0.5 ng/mL，定量限（S/N≥10）為2 ng/mL。

2.6方法回收率與精密度

選擇不含待測物的水質樣品分別添加2、5、10 μg/L標準品，按照“1.4”方法進行測定，分別平行測定6次，回收率及相對標準偏差列于表3。諾氟沙星和氧氟沙星的回收率84.8%～94.1%，相對標準偏差RSD為5.8%～7.9%，準確度和精密度好。

表3　諾氟沙星和氧氟沙星添加回收率和精密度（n＝6）

圖1a、圖1b分別為諾氟沙星空白樣品與空白樣品加標（5 μg/L）的提取離子色譜圖，圖2a、圖2b分別為氧氟沙星空白樣品與空白樣品加標（5 μg/L）的提取離子色譜圖，由圖1、圖2可見目標物未受到雜質干擾。

圖1　諾氟沙星空白樣品（a）和樣品加標5 ng/mL（b）的MRM色譜圖

圖2　氧氟沙星空白樣品（a）和樣品加標5 ng/mL（b）的MRM色譜圖

2.7實際樣品檢測

采用本方法對抽取的不同河涌各20份水質樣品進行檢測，同時作質控樣品。質控樣品的回收率等指標均達到分析要求，13份水質樣品均檢出諾氟沙星和氧氟沙星，諾氟沙星含量在15～64 ng/L，氧氟沙星含量在10～97 ng/L。

3　結論

建立了固相萃取―高效液相色譜―串聯(lián)質譜法同時測定水質中諾氟沙星和氧氟沙星的分析方法，方法靈敏度高、重現(xiàn)性好。樣品前處理簡單快速，凈化除雜效果好，有效降低基質干擾，回收率高，適用于水質中諾氟沙星和氧氟沙星的定量檢測與定性確證。

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Determination of Norfloxacin and Ofloxacin in Water Using UPLC-MS/MS

ZHOUgui-ping
（Guangdong Testing Institute for Product Quality Supervision,guangzhou 510330, China）

An solid phase extraction and ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) method was established for the determination of Norfloxacin and Ofloxacin in water. The sample purified by HLB SPE column, and was separated on a reversed phase column by acetonitrile (containing 0.1% formic acid) and 0.1% formic acid solution and then detected by positive electrospray ionization under multiple reaction monitoring (MRM) mode and liquid chromatography tandem mass spectrometry and then detected by UPLC-MS/MS under electrospray ionization, positive ion scan, multiple reaction monitoring (MRM) mode, fixed quantity with external standard. The results showed that Norfloxacin and Ofloxacin at 2～100 μg/L concentration ranged agood linear relationship, blank samples spike drecoveries weregreater than 85%, the relative standard deviation was less than 10%. Norfloxacin and Ofloxacin method detection limits (LOD) were all 0.5 ng/mL and 2 ng/mL, respectively. The method wasaccurate, sensitive, and the operation was relatively simple and effective to reduce matrix interference, suitable for determination of Norfloxacin and Ofloxacin in water.

UPLC-MS/MS; water; Norfloxacin; Ofloxacin

O657.71; O657.8

A

1009-220X(2016)02-0037-06 DOI: 10.16560/j.cnki.gzhx.20160218諾氟沙星（Norfloxacin）和氧氟沙星（Ofloxacin）屬于氟喹諾酮類藥物。近年來，氟喹諾酮類藥物因有吸收好、血液濃度高、抗菌譜廣、半衰期長、能迅速分解到各組織等特點，在臨床和畜牧業(yè)中得到迅速推廣，成為用途廣泛、十分重要的抗生素[1]。據(jù)報道，僅2005年，我國生產抗生素約21萬噸，其中作為獸藥使用就有9萬噸[2]。這些藥物使用后經(jīng)不同途徑進入環(huán)境，從而可能引發(fā)一系列問題，如細菌耐藥性等。目前在生活污水[3-4]、飲用水[5-6]、河流底泥、污泥[7-10]和土壤等多種環(huán)境中檢出了抗生素類藥物殘留[11]。國內外對氧氟沙星和諾氟沙星的檢測方法主要有免疫法、分光光度法、熒光分析法、化學發(fā)光分析法、高效液相色譜法、毛細管電泳法、電化學分析法等[12-19]。這些方法存在一定的優(yōu)點，但都有定性能力差，檢出限高等不足，難以滿足水體中痕量抗生素的定性定量檢測。

2016-02-29

周桂萍（1984～），女，碩士學位，工程師；主要從事質量管理與檢測技術研發(fā)。274257802 @qq.com