羅丹明B酶聯(lián)免疫分析方法的建立與應用

王　琳，王　雪，田靜秒

（北京普析通用儀器有限責任公司，北京 101200）

羅丹明B酶聯(lián)免疫分析方法的建立與應用

王琳，王雪，田靜秒

（北京普析通用儀器有限責任公司，北京 101200）

建立一種用于檢測羅丹明B的間接競爭酶聯(lián)免疫分析方法。該方法的IC50為1.3ng/mL，檢測限為0.786ng/g。該方法檢測豆瓣醬，加標濃度5ng/g，平均回收率為83%，加標濃度10ng/g，平均回收率為89%；檢測辣椒醬，加標濃度5ng/g，均回收率為88%，加標濃度10ng/g，平均回收率為104%；檢測辣椒油，加標濃度5ng/g，平均回收率為94%，加標濃度10ng/g，平均回收率為101%；檢測辣椒粉，添加濃度5ng/g，平均回收率為82%，加標濃度10ng/g，平均回收率為90%。該方法的平均批內(nèi)差為9.0%，批間差為10.5%，與其他常見染料未見交叉反應。該方法操作簡便，結果準確，適用于羅丹明B的現(xiàn)場大量樣品快速檢測。

酶聯(lián)免疫分析法；羅丹明B；豆瓣醬；辣椒醬；辣椒油；辣椒粉

0　引　言

羅丹明B（Rhodamine B，RhB）是一種鮮桃紅色人工合成染料，為致癌物質(zhì)［1］。2008年衛(wèi)生部發(fā)布《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑品種名單（第一批）》，明確規(guī)定禁止在食品中添加羅丹明B類工業(yè)染料。因此，建立一種快速靈敏的檢測食品中非法添加的羅丹明B的方法非常必要。

目前，羅丹明B的檢測主要是儀器分析，如高效液相-熒光檢測法［2-3］和高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用檢測法［4］，而免疫分析相關產(chǎn)品在市場上較少。但實驗室分析用儀器設備及其運行維護成本較高，對操作人員的專業(yè)要求也較高。酶聯(lián)免疫分析較儀器分析更具優(yōu)勢。

目前，已有蘇丹紅［5］、孔雀石綠［6］等染料的酶聯(lián)免疫分析方法，而采用酶聯(lián)免疫方法檢測羅丹明B的相關報道很少。宋姍姍等［7］建立了一種羅丹明B的酶聯(lián)免疫檢測方法，檢測辣椒粉中的羅丹明B，回收率為68.1%到89.3%。Michalina Oplatowska等［8］建立了羅丹明B與甲基黃的酶聯(lián)免疫檢測方法，檢測調(diào)味醬與香料中的羅丹明B與甲基黃，可以檢測出10 ng/g的羅丹明B與15 ng/g的甲基黃。本研究針對成分復雜、狀態(tài)粘稠的實際樣品，對樣品前處理方法進行研究與改進，建立了一種更加靈敏、便捷地檢測羅丹明B含量的酶聯(lián)免疫方法，驗證了該方法在檢測豆瓣醬等調(diào)味品中的羅丹明B含量方面的應用。

1　試劑與材料

1.1試劑

羅丹明B單克隆抗體，與羅丹明B合成抗原購于廣州優(yōu)抗多生物技術有限公司；酶標羊抗鼠二抗購于Jackson公司；顯色液A、顯色液B與終止液購于北京普析通用儀器有限責任公司；牛血清白蛋白購于北京阿匹斯生物技術有限公司；其他化學試劑購于西隴化工股份有限公司。

1.2材料與設備

96孔可拆卸酶標板購于中生華美（北京）科技有限公司。酶標儀，Thermo Scientific。

2　方　法

1）包被：羅丹明B合成抗原包被96孔板，包被量為每孔100μL，4℃過夜；用洗滌液洗滌3次，每次300μL/孔，拍干。2）封閉：每孔加入200μL封閉液，37℃溫育3h；用洗滌液洗滌3次，每次300 μL/孔，拍干。3）加樣：每孔依次加入樣品，酶標二抗，與羅丹明B單克隆抗體，各50μL；4）孵育：室溫孵育30min后，用洗滌液洗滌5次。5）顯色：每孔加入顯色液A與顯色液B各50μL，室溫避光作用15min。6）每孔加入50 μL終止液，用酶標儀檢測其450 nm處的OD值。

2.2ELISA方法的建立與優(yōu)化

1）用碳酸鹽緩沖液（CB）將RhB合成抗原分別稀釋5000，10000，20000倍，用于包被，按照表1進行操作，以確定抗原的最佳包被濃度。2）用磷酸鹽緩沖液（PBS）將RhB單克隆抗體分別稀釋5 000，10 000和20000倍，用于反應，按照表1進行操作，以確定抗體的最佳反應濃度。3）用PBS將酶標二抗分別稀釋1 000和2 000倍，用于反應，按照表1進行操作，以確定酶標二抗的最佳反應濃度。將IC50作為評價ELISA參數(shù)優(yōu)化的標準，IC50越低說明靈敏度越高［9］，IC50為使抑制率達到50%時的RhB濃度。

2.3方法靈敏度

該方法的靈敏度由檢測限表示，根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附法試劑（盒）的檢驗標準［10］，檢測限的檢測方法為：用樣品稀釋液重復檢測20次，計算吸光度平均值（M）和標準差（SD），以及M-2SD所對應的吸光度值；將M-2SD所對應的吸光度值帶入標準曲線方程，計算得到的結果即為方法檢測限。

通路分析是通過對選定的基因按照公共數(shù)據(jù)庫KEGG（https://www.genome.jp/kegg/）進行分類，通過離散分布的顯著性分析，得到與實驗目的有顯著相關的通路分類，本研究利用通路在線分析平臺Omicshare（http://www.omicshare. com）以P＜0.5、FDR＜0.05為參數(shù)獲得鉤藤散治療AD相關基因的通路富集信息，并使用Cytoscape-v3.6.1構建靶點-通路（T-P）網(wǎng)絡圖。

2.4樣品前處理方法優(yōu)化

豆瓣醬樣品采用3種方法進行前處理：1）豆瓣醬樣品均質(zhì)后，加入乙腈提取，振蕩，離心后取上清液，氮氣吹干，再加入樣品稀釋液復溶，取50μL復溶后的溶液檢測。2）豆瓣醬樣品均質(zhì)后，加入乙腈與正己烷提取，振蕩，離心后取乙腈相，氮氣吹干，再加入樣品稀釋液復溶，取50μL復溶后的溶液檢測。3）豆瓣醬樣品均質(zhì)后，依次加入水、乙腈與正己烷提取，振蕩，離心后取乙腈相，氮氣吹干，再加入樣品稀釋液復溶，取50μL復溶后的溶液檢測。

取1g豆瓣醬，分別添加5ng與10ng羅丹明B，按照上述3種方法進行前處理，計算加標回收率，回收率越接近100%，檢測結果越準確。

2.5方法加標回收率

取1g豆瓣醬或辣椒醬，分別添加5，10 ng羅丹明B，均質(zhì)，加入1mL水，劇烈振蕩混勻；再加入4mL乙腈，劇烈振蕩30 s；再加入5 mL正己烷，劇烈振蕩5 min；離心后取1 mL乙腈相；氮氣吹干；再加入1mL樣品稀釋液復溶；取50μL復溶后的溶液檢測。每個樣品重復檢測6次，計算加標回收率與回收率的變異系數(shù)。

取1g辣椒油，分別添加5，10ng羅丹明B，均質(zhì)；加入4mL乙腈，劇烈振蕩30s；再加入5mL正己烷，劇烈振蕩5 min；離心后取1 mL乙腈相；氮氣吹干；再加入1mL樣品稀釋液復溶；取50μL復溶后的溶液檢測。每個樣品重復檢測6次，計算加標回收率與回收率的變異系數(shù)。

取1g辣椒粉，分別添加5，10ng羅丹明B，均質(zhì)；加入5mL乙腈，劇烈振蕩30s；再加入5mL正己烷，劇烈振蕩5 min；離心后取1 mL乙腈相；氮氣吹干；再加入1mL樣品稀釋液復溶；取50μL復溶后的溶液檢測。每個樣品重復檢測6次，計算加標回收率與回收率的變異系數(shù)。

2.6方法批內(nèi)差與批間差

制備3批羅丹明B的酶聯(lián)免疫分析試劑，用于檢測豆瓣醬中的羅丹明B，樣品分別使用3批試劑檢測，每批試劑檢測10次，計算批內(nèi)差與批間差。

2.7方法特異性

選擇5種常用染料：蘇丹紅，酸性橙II，堿性橙2，堿性橙21，堿性橙22，配制成不同質(zhì)量濃度（1000，2000，5000，10000ng/mL）的溶液，檢測其與羅丹明B的交叉反應率。

3　結果與分析

3.1ELISA方法的建立與優(yōu)化

檢測不同包被條件與反應條件下的標準曲線，得到標準曲線的IC50如表1所示。可以確定，抗原的最佳包被濃度為稀釋10000倍（終濃度為1μg/mL），單克隆抗體的最佳反應濃度為稀釋20 000倍（終濃度為0.5 μg/mL），酶標二抗的最佳反應濃度為稀釋1 000倍（終濃度為1μg/mL）。

表1　不同條件下的IC50值

根據(jù)最佳條件檢測得到的標準曲線如圖1所示，線性范圍為0.3～8.1ng/mL，IC50為1.3ng/mL。

圖1　標準曲線

3.2方法靈敏度

檢測樣品稀釋液的吸光度值，計算吸光度值的M-2SD所對應的吸光度值為1.996，根據(jù)標準曲線，計算得到對應的濃度為0.786ng/g，因此該方法的檢測限為0.786ng/g。進出口食品中羅丹明B的檢測行業(yè)標準規(guī)定，液相色譜-熒光法及液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法的檢測限均為0.005mg/kg［11］，可見該方法的檢測限可以滿足檢測羅丹明B的要求。

3.3前處理方法優(yōu)化

豆瓣醬按照2.4的3種方法進行前處理，加標回收率如表2所示。由表可知，依次加入水、乙腈、正己烷提取是最優(yōu)的前處理方法，檢測結果最準確。羅丹明B易溶于甲醇、乙腈等極性較強的溶劑、在正己烷、氯仿等極性較弱的溶劑中溶解度較小，因此采用乙腈提取。豆瓣醬中含有脂類雜質(zhì)，可能會干擾檢測，因此在樣品前處理時加入正己烷，除去脂類雜質(zhì)，會使檢測結果更準確。豆瓣醬樣品比較粘稠，在乙腈中不易分散，因此在樣品前處理時加入水，增加分散性，會使檢測結果更準確。

表2　不同前處理方法的加標回收率

3.4方法加標回收率

不同樣品的加標回收率與回收率的變異系數(shù)見表3。豆瓣醬的加標回收率在73%～106%之間，變異系數(shù)在9.2%～9.9%之間。辣椒醬的加標回收率在76%～110%之間，回收率的變異系數(shù)在4.8%～14.1%之間。辣椒油的加標回收率在74%～106%之間，回收率的變異系數(shù)在6.9%～8.2%之間。辣椒粉的添加回收率在73%～106%之間，回收率的變異系數(shù)在9.1%～11.3%之間。說明該方法檢測豆瓣醬等調(diào)味料的準確性與重復性較好。

表3　樣品加標回收率與變異系數(shù)

3.5方法批內(nèi)差與批間差

樣品分別使用3批試劑檢測，每批試劑檢測10次，批內(nèi)差與批間差見表4。由表可知，批內(nèi)差在8.4%～9.4%之間，小于10%，批間差10.5%，小于15%，說明該方法的批內(nèi)差異與批間差異較小。

表4　批內(nèi)差與批間差

3.6方法特異性

羅丹明B與蘇丹紅，酸性橙II，堿性橙2，堿性橙21，堿性橙22的交叉反應見表5。由表可見，上述染料與羅丹明B均沒有交叉反應，說明該方法檢測羅丹明B的特異性良好。

表5　羅丹明B與常見染料的交叉反應

4　結束語

本研究通過優(yōu)化羅丹明B酶聯(lián)免疫分析試劑的反應參數(shù)，包括抗原包被條件，抗體與酶標二抗的工作濃度，建立了羅丹明B的酶聯(lián)免疫分析方法，檢測限為0.786ng/g，靈敏度較高。本研究通過優(yōu)化樣品前處理方法，建立了以水、乙腈、正己烷3種提取液為基礎的樣品前處理方法，檢測豆瓣醬等調(diào)味品中的羅丹明B，平均回收率在82%～104%之間，平均批內(nèi)差為9.0%，平均批間差為10.5%，準確度較高。該方法操作簡便，結果準確，適用于羅丹明B的現(xiàn)場大量樣品快速檢測。

在上述研究成果的基礎上，可將研究化學發(fā)光免疫分析技術應用于羅丹明B的檢測［12］，在基底上包被羅丹明B合成抗原，依次加入樣品，酶標二抗，羅丹明B單克隆抗體，形成抗原-抗體-酶免疫復合物，洗滌后加入發(fā)光底物，酶催化底物發(fā)光，通過檢測發(fā)光強度計算樣品中羅丹明B的濃度，與現(xiàn)有的酶聯(lián)免疫分析方法相比，該方法可以提高靈敏度，擴展線性范圍。

也可應用磁微粒偶聯(lián)免疫分析技術［13］，在磁微粒表面連接羅丹明B合成抗原，將磁微粒偶聯(lián)物，樣品，羅丹明B單克隆抗體，酶標二抗混合，形成磁微粒-抗原-抗體-酶免疫復合物，磁分離后加入底物，酶催化底物顯色或發(fā)光，通過檢測信號計算樣品中羅丹明B的濃度，與現(xiàn)有的酶聯(lián)免疫分析方法相比，該方法可以減少操作步驟，縮短檢測時間。

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（編輯：莫婕）

Establishment and application of enzyme-linked immuno sorbent assay（ELISA）for Rhodamine B

WANG Lin，WANG Xue，TIAN Jingmiao
（Beijing Purkinje General Instrument Co.，Ltd.，Beijing 101200，China）

A fast assay method of enzyme-linked immuno sorbent assay（ELISA）for Rhodamine B（RhB）is established.The method is characterized into that IC50 is 1.3 ng/mL and the limit of detection is 0.786 ng/g.For the detected bean sauce by the method，its average recovery rate is 83%at the fortified concentration of 5 ng/g and 89%at the fortified concentration of 10 ng/g.For the detected chili sauce，its average recovery rate is 88%at the fortified concentration of 5 ng/g and 104%at the fortified concentration of 10ng/g.For the detected chili oil，its average recovery rate is 94%at the fortified concentration of 5 ng/g and 101%at the fortified concentration of 10 ng/g.For the detected chili powder，its average recovery rate is 82%at the fortified concentration of 5ng/g and 90%at the fortified concentration of 10ng/g.The intra assay CV of the ELISA method is 9.0%，and the inter assay CV is 10.5%.The ELISA method has no cross reaction with other common dyes.The method is featured with simple and convenient operation and accurate result，and it is applicable to rapid detection of a great number of Rhodamine B samples on site.

enzyme-linked immuno sorbent assay（ELISA）；Rhodamine B；bean sauce；chili sauce；chili oil；chili powder

A

1674-5124（2016）06-0060-05

10.11857/j.issn.1674-5124.2016.06.014

2015-12-23；

2016-01-18

王琳（1980-），男，遼寧海城市人，工程師，碩士，研究方向為快速診斷檢測技術的開發(fā)與應用。