不同鹽度海水對低鹽誘導長牡蠣三倍體的影響*

陳洪發(fā)， 王昭萍??， 于瑞海， 牟宗寶， 李　偉， 張　哲

(1.中國海洋大學海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室，山東 青島 266003；2.大連獐子島漁業(yè)股份有限公司，遼寧 大連 116000)

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不同鹽度海水對低鹽誘導長牡蠣三倍體的影響*

陳洪發(fā)1， 王昭萍1??， 于瑞海1， 牟宗寶2， 李偉1， 張哲1

(1.中國海洋大學海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室，山東 青島 266003；2.大連獐子島漁業(yè)股份有限公司，遼寧 大連 116000)

研究了環(huán)境鹽度對低鹽誘導長牡蠣(Crossotreagigas)三倍體的影響。在海水溫度為(25±2)℃條件下,長牡蠣親貝，經(jīng)過不同鹽度(22、26、30、34和38)海水培育，采取人工受精，在受精卵中出現(xiàn)40%～50%第一極體時，進行15min的低鹽(4、6、8、10、12和14)持續(xù)誘導，然后放入不同鹽度海水中進行孵化。研究表明：同一環(huán)境鹽度下，隨著低鹽逐漸升高至環(huán)境鹽度，卵裂率和孵化率均逐漸升高；與其他環(huán)境鹽度相比，環(huán)境鹽度為38時，卵裂率和孵化率均明顯較低。當環(huán)境鹽度為26、30、34和38時，在低鹽為時8三倍體率最高；當環(huán)境鹽度為22時，在低鹽為6時三倍體率最高。當環(huán)境鹽度為22、26、30、34和38時，在低鹽為8時綜合評價指數(shù)最高。通過雙因子方差分析發(fā)現(xiàn)，環(huán)境鹽度和低鹽均對卵裂率、孵化率及三倍體率有顯著影響(P<0.05)。

海水鹽度；低鹽；長牡蠣；三倍體

引用格式：陳洪發(fā)， 王昭萍， 于瑞海， 等. 不同鹽度海水對低鹽誘導長牡蠣三倍體的影響[J]. 中國海洋大學學報(自然科學版), 2016, 46(9): 24-28.

CHEN Hong-Fa, WANG Zhao-Ping, YU Rui-Hai, et al. Effect of salinity on the induction of triploid oyster (Crossotreagigas)[J]. Periodical of Ocean University of China, 2016, 46(9): 24-28.

環(huán)境鹽度是影響海水貝類正常生長代謝的一種重要環(huán)境因子。貝類是變壓動物，海水鹽度的改變會引起海洋貝類的一系列生理變化和代謝紊亂，甚至導致死亡[1]。但貝類可以在適應鹽度范圍內(nèi)正常生長和發(fā)育，根據(jù)貝類適應鹽度范圍的大小和強弱，可以將貝類分為狹鹽性和廣鹽性兩類[2]。由于胚胎期和幼蟲期的貝類是貝類生活史中最脆弱的2個重要時期，鹽度的變化對貝類早期受精卵的卵裂、孵化、生長及存活尤為重要。

低鹽誘導多倍體均已經(jīng)在長牡蠣(Crossotreagigas)[3-4]、近江牡蠣(C.rivularis)[5]、蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)[6]和櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)[7]中開展研究，并對低鹽的誘導機制進行了初步探討。以上研究均在同一環(huán)境鹽度下進行的，并未對環(huán)境鹽度對低鹽誘導三倍體的影響進行進一步探討。長牡蠣作為廣鹽、廣溫種，在全國各沿海地區(qū)均有養(yǎng)殖，且各海區(qū)的鹽度差異較大，相同海區(qū)的鹽度在不同季節(jié)也有差異，因此，有必要對環(huán)境鹽度對低鹽誘導長牡蠣三倍體的影響進行研究，以期獲得不同鹽度海水對低鹽誘導長牡蠣三倍體的影響規(guī)律。

本實驗以長牡蠣作為對象，研究不同鹽度海水和低鹽組合對誘導長牡蠣三倍體的交互影響，探索環(huán)境鹽度對低鹽誘導長牡蠣三倍體的影響規(guī)律。

1　材料方法

1.1 材料

本研究于2014年5—8月在獐子島萊州苗場(附近自然海水鹽度為30±1、溫度為(25±2)℃進行，所用的2齡長牡蠣，殼長為8～15cm，均來自萊州海鮮批發(fā)市場，洗刷干凈，挑選活力良好的長牡蠣進行培育。首先，置于250L的水槽中暫養(yǎng)4～5d，均勻分成5組，其中一組的培育海水鹽度為30，其余4組逐步降低和升高海水鹽度，幅度為1/1d，直至鹽度為22、26、34和38，置于各環(huán)境鹽度的70L海水實驗桶中培育10d。

1.2 精卵的獲得和受精

選取符合實驗要求的長牡蠣，解剖取其精卵，對不同實驗鹽度處理的長牡蠣，取其卵細胞和精子，精卵的清洗、浸泡、受精和孵化均在各自環(huán)境鹽度中進行。具體精卵獲取的實驗步驟：使用牙簽取出少量性腺組織，點于載玻片上的水滴上，把載玻片置于顯微鏡下辨雌雄以及檢查卵子的質(zhì)量和精子的活力；選取性腺發(fā)育良好的牡蠣，使用250目篩絹清洗卵細胞，置于盛有4L海水的15L實驗桶中浸泡促熟1h，受精前棄去上清液；精液用500目篩絹網(wǎng)除去雜質(zhì)；向卵液中按卵子∶精子=1∶5～6的比例加入精液，防止精子過多引起胚胎發(fā)育的畸形，迅速攪拌均勻，進行人工授精。在受精過程中，務必避免精卵的污染和不同實驗鹽度下的交叉污染。

1.3 低鹽誘導

精卵混合5min后，使用300目篩絹網(wǎng)洗卵。對受精卵顯微觀察，當受精卵出現(xiàn)40%～50%的第一極體時，在500mL實驗燒杯中，對其按照最終鹽度為4、6、8、10、12和14進行低鹽處理，持續(xù)處理15min，處理結(jié)束后，置于70L的各自環(huán)境鹽度海水中進行孵化。

1.4 胚胎發(fā)育

保持充氣，定時使用攪扒攪桶防止沉底，且及時測定卵裂率，等受精卵發(fā)育至D形幼蟲時，測定孵化率，用300目篩絹篩選出D形幼蟲，并取樣測量幼蟲的倍性。

1.5 倍性檢測

以二倍體長牡蠣作對照，在樣品管中加入1×10-5g/mL DAPI熒光染料1mL，經(jīng)振動器震蕩1～2min，制成細胞懸液，通過300目篩絹過濾置于2mL的測量管中，30min后采用Partec PAⅡ流式細胞儀(FCM)對幼蟲進行倍性檢測，如果濃度過大，可加入適量的DAPI進行稀釋。實驗藥品DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)為美國Sigma公司產(chǎn)品。

1.6 數(shù)據(jù)處理

卵裂率=分裂的卵數(shù)/總卵數(shù)×100%。

孵化率=D形幼蟲數(shù)/受精卵數(shù)×100%。

三倍體誘導率=三倍體比例/(三倍體比例+二倍體比例)×100%。

綜合評價指數(shù)(Evaluation index)=孵化率×三倍體誘導率×100%。

實驗數(shù)據(jù)采用平均值±標準差(Mean±SD)表示，采用Sigmaplot 10.0軟件作圖，采用IBM SPSS Statistics 19.0軟件進行分析統(tǒng)計，對實驗數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析(ANOVA)和交互作用的雙因子方差分析，差異顯著性定為P<0.05。

2　結(jié)果與分析

2.1 卵裂率和孵化率

環(huán)境鹽度和低鹽誘導對長牡蠣胚胎發(fā)育的影響可以通過卵裂率和孵化率反應。卵裂率(見圖1a)和孵化率(見圖1b)的實驗結(jié)果表明，環(huán)境鹽度為22、26、30、34和38對照組的卵裂率和孵化率分別為(91.6±5.7)%、(92.7±3.7)%、(92.2±4.7)%、(85.9±7.4)%、(69.3±6.9)%和(82.8±4.3)%、(92.0±6.4)%、(91.3±6.2)%、(89.4±6.9)%、(69.2±11.0)%；同一環(huán)境鹽度下，隨低鹽逐漸升高至環(huán)境鹽度，卵裂率和孵化率均逐漸升高，且低鹽≥6，卵裂率和孵化率均增速減緩；同一低鹽環(huán)境下，環(huán)境鹽度≤30時，卵裂率和孵化率差異不明顯，但環(huán)境鹽度>30時，卵裂率和孵化率隨著環(huán)境鹽度的升高而顯著下降；與其他環(huán)境鹽度相比，環(huán)境鹽度為38時，卵裂率和孵化率均顯著降低。本實驗卵裂率和孵化率的范圍分別為(17.3±4.1)%～(92.7±3.7)%和(9.3±4.4)%～(92.0±6.4)%，在環(huán)境鹽度和低鹽都為26，卵裂率和孵化率均最高，在環(huán)境鹽度為38、低鹽為4時，卵裂率和孵化率均最低。環(huán)境鹽度和低鹽對長牡蠣卵裂率的方差分析表明，環(huán)境鹽度、低鹽和兩者的交互作用對卵裂率和孵化率均有顯著的影響(P<0.05)。

圖1　環(huán)境鹽度和低鹽對卵裂率和孵化率的影響

2.2 三倍體率

使用流式細胞儀對長牡蠣D形幼蟲的倍性檢測結(jié)果如圖2所示。圖2a為2n對照組倍性檢測結(jié)果，圖2b為經(jīng)過低鹽處理幼蟲的倍性檢測結(jié)果，其三倍體率為76.92%；不同環(huán)境鹽度和低鹽與三倍體率的關(guān)系如圖3所示。實驗結(jié)果表明，環(huán)境鹽度為22時，在低鹽為6時三倍體率最高，為(76.49±7.45)%；在環(huán)境鹽度為26、30、34、38時，三倍體率均是在8最高，分別為(76.92±8.16)%、(81.27±4.68)%、(70.63±0.55)%、(63.78±5.88)%；在環(huán)境鹽度為30和低鹽為8時，三倍體誘導率最高，為(81.27±4.68)%。相同環(huán)境鹽度下，隨著低鹽升高，三倍體誘導率先升高后降低，均高于各自環(huán)境鹽度下的對照組(三倍體率均為0)。

(a：2n對照組；b：環(huán)境鹽度和低鹽分別26和8，幼蟲的三倍體率為76.92%。a:2n control; b: Salinity of environment and low are 26 and 8 respectively, triploid rate of D shape larvae is 76.92%.)

圖2流式細胞儀倍性檢測結(jié)果

Fig.2Ploidy level revealed by flow cytometry

圖3　環(huán)境鹽度和低鹽對三倍體率的影響

通過對環(huán)境鹽度和低鹽與三倍體率關(guān)系的方差分析，結(jié)果表明，環(huán)境鹽度、低鹽誘導以及交互作用對三倍體率均有顯著影響(P<0.05)。

2.3 綜合評價指數(shù)

在不同環(huán)境鹽度與低鹽誘導下，綜合評價指數(shù)如圖4所示，實驗結(jié)果表明，環(huán)境鹽度為22、26、30、34和38的綜合評價指數(shù)均在低鹽為8時最高，分別為52.68%、62.38%、63.23%、51.35%和30.47%；低鹽<8時，綜合評價指數(shù)分別隨著低鹽的增加而升高，低鹽>8時，綜合評價指數(shù)分別隨著低鹽的增加而降低；綜合評價指數(shù)均高于各自環(huán)境鹽度對照組(對照組的綜合評價指數(shù)均為0)，其中，在本實驗中，綜合評價指數(shù)在環(huán)境鹽度為30、低鹽為8最高，為63.23%。

圖4　環(huán)境鹽度和低鹽對綜合評價指數(shù)的影響

3　討論

許多學者在同一環(huán)境鹽度下對低鹽誘導三倍體進行了研究，但長牡蠣作為廣溫性、廣鹽性生物，可養(yǎng)殖的區(qū)域較廣，遍布全國沿海各地。各海區(qū)的環(huán)境鹽度不盡相同，也隨季節(jié)的變化而不同，因此應該探索不同環(huán)境鹽度對低鹽誘導三倍體長牡蠣的影響及其影響規(guī)律。

3.1 環(huán)境鹽度對低鹽誘導三倍體的卵裂率、孵化率影響

在諸多影響因素中，鹽度是影響海洋貝類受精及孵化的比較直接和關(guān)鍵的一個因子。鹽度對胚胎發(fā)育的影響，國內(nèi)外學者已在海灣扇貝(Argopectenirra-dians)[8]、櫛孔扇貝[9]、薄片鏡蛤(Dosiniacorrugate)[10]、菲律賓蛤仔(Ruditapesplilippinarum)[11]、文蛤(Meretrixmeretrix)[12]和青蛤(Cyclinasinensis)[13]等中進行了研究，發(fā)現(xiàn)不同的貝類種類，最適鹽度范圍是不同的。本研究結(jié)果表明，與較低環(huán)境鹽度相比，較高環(huán)境鹽度會引起長牡蠣的卵裂率和孵化率明顯降低，說明在發(fā)育過程中長牡蠣胚胎耐高鹽的能力較差；從實驗結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，長牡蠣受精階段和孵化階段的適宜鹽度范圍約為22～34，這與吳寶鈴等[1]的研究結(jié)果有一定差異，其原因可能是長牡蠣經(jīng)過10d的訓化，增加了其對鹽度的耐受性。本實驗誘導所獲得的幼蟲并未進行繼續(xù)培養(yǎng)，這些幼蟲在各自環(huán)境鹽度下的存活及生長狀況需要進一步研究。

3.2 低鹽對誘導三倍體的影響

低鹽誘導長牡蠣三倍體具有成本低、易操作、效果好、無毒害等優(yōu)勢[4]，適合進行牡蠣三倍體的產(chǎn)業(yè)化培育。王昭萍等[6]誘導蝦夷扇貝三倍體時，最佳低鹽為12，孔靜等[3]在自然海水溫度為25℃時誘導長牡蠣三倍體，在低鹽為8的綜合評價指數(shù)效果最佳；張晨晨等[7]誘導櫛孔扇貝三倍體在低鹽為14時，三倍體率最高，因此，誘導貝類三倍體的最佳低鹽隨物種種類而變化。目前，對低鹽誘導三倍體的作用機理和機制尚不清晰和明確，可能與低鹽引起細胞能量代謝紊亂，抑制或影響微絲和微管的形成有關(guān)[6]，導致細胞第一極體(PB1)、第二極體(PB2)的正常排出和正常分裂受阻，從而形成多倍體貝類。本研究結(jié)果表明，無論環(huán)境鹽度如何改變，綜合評價指數(shù)均在低鹽為8時最佳，因此，在本實驗的環(huán)境鹽度下，綜合評價指數(shù)的最佳低鹽基本不受環(huán)境影響；除環(huán)境鹽度為22，在低鹽為6時三倍體率最佳之外，其余實驗環(huán)境鹽度均在低鹽為8時，三倍體率最佳，因此，三倍體率的最佳低鹽在一定程度上受環(huán)境影響。以上實驗結(jié)果說明，環(huán)境鹽度對卵裂率、孵化率以及三倍體率均會產(chǎn)生影響，但對最佳綜合評價指數(shù)所對應的最佳低鹽沒有影響，這些實驗結(jié)果的原因可能與細胞內(nèi)滲壓的調(diào)節(jié)有關(guān)[14-18]。

4　結(jié)語

本研究發(fā)現(xiàn)環(huán)境鹽度對低鹽誘導長牡蠣三倍體的影響是有規(guī)律的，環(huán)境鹽度>26時，三倍體率均是在低鹽為8最高，但環(huán)境鹽度為22時，在低鹽為6下三倍體率最高；不同環(huán)境鹽度下的綜合評價指數(shù)均在低鹽為8最高。本研究確定了不同環(huán)境鹽度下低鹽誘導長牡蠣三倍體的規(guī)律,為在不同的養(yǎng)殖海區(qū)開展低鹽誘導長牡蠣三倍體提供了理論和實踐參考。

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責任編輯朱寶象

Effect of Salinity on the Induction of Triploid Oyster (Crossotrea gigas)

CHEN Hong-Fa1, WANG Zhao-Ping1, YU Rui-Hai1, MU Zong-Bao2, LI Wei1, ZHANG Zhe1

(1.The Key Laboratory of Mariculture, Ministry of Education, Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 2.Dalian Zhangzidao Fisheries Group Limited Company, Dalian 116000, China)

Due to the change of sea area and seasons, the difference of seawater salinity was very large. Thus it is necessary to study the effect of seawater salinity on the induction of triploidCrassostreagigas.C.gigaswere cultured at (25±2)℃ and salinities (22, 26, 30, 34 and 38). The fertilized eggs by artificial insemination were induced at low salinities (4, 6, 8, 10, 12 and 14) for 15 min when 40%～50% of PB1 appeared. . The result showed that along with the increase of salinity, both the cleavage rate and the hatching rate increased. Compared with the other environmental salinity, at 38, both the cleavage rate and the hatching rate were significantly lower. When the environment salinity was 26, 30, 34 and 38, the triploid rate was the highest at 8. But when the environment salinity was 22, the triploid rate peaked at 6. When the environmental salinity was 22, 26, 30, 34 and 38, theIewas the highest if salinity was 8. And the environmental salinity was 30 and inducing salinity was 8, both the triploid rate and theIewere the highest 81.27%± 4.68% and 63. 23%, respectively. Through the factor analysis of variance, both the environmental salinity and the inducing salinity had a remarkable influence on the cleavage, the hatching and the triploid rates (P< 0.05). These findings can provide a reference to the production of triploidC.gigas.

seawater salinity; low salinity;Crassostreagigas; triploidy

國家自然科學基金項目(31172403)資助

2015-06-12；

2016-01-15

陳洪發(fā)(1988-)，男，碩士生。E-mail：chenhongfa2008@163.com

??通訊作者：E-mail：zpwang@ouc.edu.cn

S968.31

A

1672-5174(2016)09-024-05

10.16441/j.cnki.hdxb.20150212

Supported by the National Natural Science Foundation of China(31172403)