用CIA模型探討壯醫(yī)滾克陽證與陰證動物模型的建立

梁江洪　李鳳珍　龍朝陽　鐘麗雁　柏春暉　梁　艷　蔣桂江　王苑儷

廣西壯族自治區(qū)民族醫(yī)藥研究院,廣西　南寧　530001

?

實(shí)驗(yàn)研究

用CIA模型探討壯醫(yī)滾克陽證與陰證動物模型的建立

梁江洪李鳳珍*龍朝陽鐘麗雁柏春暉梁艷蔣桂江王苑儷

廣西壯族自治區(qū)民族醫(yī)藥研究院,廣西南寧530001

目的:以膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(CIA)模型為基礎(chǔ)，附加模擬的風(fēng)、寒、濕、熱環(huán)境，建立符合壯醫(yī)病因理論的動物模型。方法:將40只雌性Wistar大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、陽證組與陰證組每組各10只，除空白外均采用弗氏不完全佐劑和牛II型膠原蛋白誘導(dǎo)大鼠CAI模型，陽證組在每天附加風(fēng)、濕、熱刺激持續(xù)1h，條件控制：風(fēng)速5m/s，相對濕度90%，溫度(37±1)℃；陰證組每天附加風(fēng)、寒、濕刺激持續(xù)1h，條件控制：風(fēng)速5m/s，相對濕度90%，溫度(8±1)℃。比較各組大鼠關(guān)節(jié)炎-體長溫度差值、計(jì)算關(guān)節(jié)炎癥積分以及ELISA只測定TNF-α、IL-1β水平的差異結(jié)果:陰證組關(guān)節(jié)-體表溫度差值、炎癥指數(shù)方面均低于陽證組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；陰證組大鼠血清TNF-α、IL-1β水平均低于陽證組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論:通過風(fēng)、寒、濕刺激的CIA大鼠可做為陰證模型的參考，通過風(fēng)、濕、熱刺激的CIA大鼠可做為陽證模型的參考。同時(shí)也存在造模復(fù)雜化、大鼠死亡率增的缺點(diǎn)，有待進(jìn)一步完善。

動物模型；滾克；類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；陽證與陰證；壯醫(yī)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是臨床常見的自身免疫性疾病，其發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，主要的病理表現(xiàn)為滑膜增生、炎癥細(xì)胞浸潤、血管翳形成并造成軟骨和骨質(zhì)破壞[1-2]。目前常用CIA模型來研究類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制，但該模型的發(fā)生機(jī)制目前尚無定論，可以肯定：免疫系統(tǒng)對CⅡ的高度敏感性是該模型建立的主要原因[3]，細(xì)胞和體液免疫均參與了病理過程[4-5]。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎在壯醫(yī)的病名為滾克，緣由風(fēng)、寒、濕、熱毒侵襲人體，阻滯三道兩路而致病，臨床辨證分為陽證、陰證。本研究嘗試以CIA模型為基礎(chǔ)，附加模擬的風(fēng)、寒、濕、熱環(huán)境，建立符合壯醫(yī)病因理論的動物模型，為后續(xù)相關(guān)動物實(shí)驗(yàn)提供參考。

1　材料和造模

1.1實(shí)驗(yàn)材料SPF級雌性Wistar大鼠(生產(chǎn)許可證：SCXK2014-0002)，體重(110±20)g，購自廣西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。牛Ⅱ型膠原蛋白(批號：150230)、弗氏不完全佐劑(批號：150207)、IL-1β(批號：1006-63)、TNF-α試劑盒(批號：1100-86)購于北京博蕾德生物科技有限公司。

1.2造模箱制作參考文獻(xiàn)[6]自制造模箱，以自行改裝的空調(diào)系統(tǒng)控制箱內(nèi)溫度，以超聲霧化器霧化滅菌水控制箱內(nèi)濕度，以鼓風(fēng)機(jī)提供風(fēng)源。1.3CIA大鼠造模方法在無菌條件下，用0.1mol/L冰醋酸充分溶解牛II型膠原蛋白，制成濃度為4mg/L溶液，再按1∶1體積與弗氏不完全佐劑混合、震蕩并充分乳化，制成CII乳劑，保存于4℃冰箱備用。試驗(yàn)時(shí)每只大鼠CII乳劑0.25mL于頸、背、尾部分多點(diǎn)皮內(nèi)注射致炎(初次免疫)，于7d后按上述方法再次免疫。

2　實(shí)驗(yàn)分組及方法

40只大鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)7d后，隨機(jī)選30只按上述方法造模，造模成功后再隨機(jī)分為模型組、陽證組、陰證組，每組10只；余下10只未造模大鼠為空白組。均于室溫(恒溫(20±2)℃，相對濕度50%～60%)下正常喂養(yǎng)。陽證組在首次接受膠原蛋白注射開始同時(shí)每天給予風(fēng)、濕、熱刺激持續(xù)1h，條件控制：風(fēng)速5m/s，相對濕度90%，溫度(37±1)℃；陰證組在首次接受膠原蛋白注射開始同時(shí)每天給予風(fēng)、寒、濕刺激持續(xù)1h，條件控制：風(fēng)速5m/s，相對濕度90%，溫度(8±1)℃。

3　觀察和指標(biāo)

3.1關(guān)節(jié)-體表溫度差值各組大鼠以最腫脹關(guān)節(jié)體表溫度與腹部體表溫度差值進(jìn)行比較。體表溫度測量方法，于室溫下，相同時(shí)間點(diǎn)用非接觸式紅外測溫儀在相同的距離內(nèi)測量。

3.2關(guān)節(jié)炎癥積分采用關(guān)節(jié)炎指數(shù)積分法評定，評定依據(jù)為關(guān)節(jié)紅腫程度和范圍以及關(guān)節(jié)腫大和變形情況[7]。0分：無關(guān)節(jié)炎；1分：有紅色斑點(diǎn)或輕度腫脹；2分：關(guān)節(jié)部位中度腫脹；3分：關(guān)節(jié)嚴(yán)重腫脹；4分：關(guān)節(jié)嚴(yán)重腫脹且不能負(fù)重。每個(gè)肢體最高積分為4分，每只鼠最高積分為16分。3.3血清TNF-α、IL-1β含量于第1次膠原蛋白注射后的第22天，水合氯醛麻醉各組大鼠，腹主動脈采血，分離血清待測，未測的血清放入-4℃低溫冰箱保存。IL-1β、TNF-α均采用ELISA法，按照試劑盒說明書進(jìn)行。

4　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

5　結(jié)果

5.1關(guān)節(jié)表面-體表溫差關(guān)節(jié)表面-體表溫差(簡稱差值)比較，空白組大鼠膝關(guān)節(jié)表面溫度均低于體表溫度，與模型組比較，差值明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。陰證組差值小于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，表明陰證組關(guān)節(jié)表面溫差低于模型組；陽證組差值與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明陽證組關(guān)節(jié)表面溫差與模型組相當(dāng)；陰證組差值與陽證組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明陰證組關(guān)節(jié)表面溫差低于陽證組。見表1。5.2關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)空白組炎癥指數(shù)為0，與模型組比較，炎癥指數(shù)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，陽證組關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，陰證組關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)小于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明陰證組關(guān)節(jié)炎癥程度低于模型組。與陽證組比較，陰證組關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)小于陽證組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明陰證組關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)小于陽證組。見表1。

表1　關(guān)節(jié)表面-體表溫度差、炎癥指數(shù)　±s)

注：與空白組比較，*P<0.01；與模型組比較，△P<0.01，#P<0.05；與陽證組比較，△△P<0.05。

5.3炎癥因子與空白組比較，模型組TNF-α、IL-1β值均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，陽證組TNF-α、IL-1β統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，陰證組TNF-α、IL-1β值小于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明陰證組TNF-α、IL-1β水平低于模型組。與陽證組比較，陰證組TNF-α、IL-1β值小于陽證組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，表明陰證組TNF-α、IL-1β水平明顯低于陽證組。見表2。

表2　血清中TNF-α、IL-1β含量

注：與空白組比較，*P<0.01；與模型組比較，△P<0.05；與陽證組比較，##P<0.01。

6　結(jié)論

本研究結(jié)果表明，陰證組關(guān)節(jié)-體表溫度差值、炎癥指數(shù)方面均低于陽證組(P<0.05)，陰證組大鼠血清TNF-α、IL-1β水平均低于陽證組(P<0.05)。表明在比較成熟的CIA模型基礎(chǔ)上，附加風(fēng)、寒、濕、熱等外界刺激，會對模型大鼠產(chǎn)生影響：通過風(fēng)、寒、濕刺激的模型大鼠可做為陰證模型的參考；通過風(fēng)、濕、熱刺激的模型大鼠可做為陽證模型的參考。同時(shí)，結(jié)果表明，陽證組與模型組在表溫度差值、炎癥指數(shù)、血清TNF-α和IL-1β水平方面無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，可說明CIA急性期多表現(xiàn)為陽證。本研究探索在CIA模型基礎(chǔ)上建立壯醫(yī)滾克病因?qū)W說中的陰、陽兩證模型取得初步成效，同時(shí)也存在造模復(fù)雜化、大鼠死亡率增高的缺點(diǎn)，有待進(jìn)一步完善。

[1]ScottDL, Wolfe F, Huizinga TW, et al. Rheumatoid arthritis[J].Lancet， 2010，376(9746),1094-1108.

[2]Kourilovitch M, Galarza-Maldonado C, Ortiz-Prado E3.Diagnosis and classification of rheumatoid arthritis[J]. Journal of Autoimmunity， 2014,48-49:26-30.

[3]Trentham D E,Townes A S,Kang A H.Autoimmunity to typeⅡcolla-gen:an experimental model of arthritis[J].J Exp Med,1977,146:857-866.

[4]湯文璐,李俊,徐叔云.Ⅱ型膠原性關(guān)節(jié)炎動物模型的研究概況[J].中國藥理學(xué)通報(bào),1998,14(6):495-498.

[5]陳柏松,徐玉東,鐘淑琦,等.大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎模型的建立與評價(jià)[J].哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2005,39(6):489-491.

[6]肖長虹,顧為望,李留洋,等.類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎風(fēng)寒濕痹與風(fēng)濕熱痹動物模型的研究[J].中醫(yī)雜志,1996,37(8):492-496.

[7]張鈞用.現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)方法[M].北京：北京大學(xué)，中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，1998:1383.

(編輯：梁志慶)

2016-06-23

廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃課題(桂科攻13349006)。

梁江洪(1962-)，女，壯族，大學(xué)本科，副主任醫(yī)師，從事風(fēng)濕病的壯醫(yī)診治研究，E-mail:gxzyyyfsk2006@163.com

李鳳珍(1967-)，女，壯族，大學(xué)本科，主任醫(yī)師，從事風(fēng)濕病的壯醫(yī)診治研究，E-mail:lifengzhen2005@163.com

R965.1

A

1007-8517(2016)17-0025-02