HPLC法測定藏藥二十五味珊瑚丸中β-細辛醚的含量

蘭　鈞　阿　萍

西藏自治區(qū)食品藥品檢驗所，西藏　拉薩　850000

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藥物研究

HPLC法測定藏藥二十五味珊瑚丸中β-細辛醚的含量

蘭鈞阿萍

西藏自治區(qū)食品藥品檢驗所，西藏拉薩850000

目的：建立藏藥二十五味珊瑚丸中β-細辛醚的HPLC含量測定方法。方法：采用Waters XSELECT CSH C18色譜柱，以甲醇-水(56∶44)為流動相，流速為1.0mL/min，檢測波長為254nm，柱溫為35℃。結果：β-細辛醚在0.9926～2.9778μg范圍內線性良好(r=0.9999)，平均回收率為99.27%，RSD為1.1%。結論：該方法準確、可靠、快速、靈敏，可用于藏藥二十五味珊瑚丸的質量控制。

二十五味珊瑚丸；β-細辛醚；高效液相色譜法；含量測定

二十五味珊瑚丸是傳統(tǒng)藏藥，由珊瑚、珍珠、青金石、珍珠母、訶子、木香、紅花、丁香、沉香、朱砂、龍骨等二十五味藥材制成，具有清熱定驚、開竅通絡、止痛的功效，用于治療“白脈病”，即中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如神志不清，身體麻木，頭昏目眩，腦部疼痛，血壓不調，頭痛，癲癇及各種神經(jīng)性疼痛[1-2]。首次收載于1995《中國藥典》標本版，1997年被國家衛(wèi)生部批準為國家中藥保護品種，目前被《中國藥典》2010年版收載?，F(xiàn)行檢驗標準包含簡單的化學反應和西紅花、紅花主要成分的薄層色譜鑒別以及烏頭堿的限量測定。涉及的藥材少，代表性不足，缺乏組方藥材的質控指標及定量標準，難以保證產(chǎn)品質量的穩(wěn)定和用藥安全有效。

二十五味珊瑚丸治療癲癇等神經(jīng)性疼痛，藏菖蒲中有效成分β-細辛醚起重要作用，采用UPLC-DAD/Q-TOF-MS對二十五味珊瑚丸全方進行了系統(tǒng)的成分分析，鑒定出6大類61個成分，其中苯丙素類β-細辛醚和α-細辛醚來自藏菖蒲，且二十五味珊瑚丸成藥中β-細辛醚含量較高[3-4]。研究表明，β-細辛醚能降低小鼠癲癇發(fā)作級別，延長癲癇發(fā)作潛伏期，減少濕狗樣抖動次數(shù)[3,5]。而β-細辛醚是主要入血入腦的成分，既是有效成分，但在高濃度下又是潛在的毒性成分，因此控制β-細辛醚的含量關系到全方的安全性和有效性[4]。本研究擬采用HPLC建立了二十五味珊瑚丸中β-細辛醚的含量測定方法，為藏藥二十五味珊瑚丸的質量控制提供參考方法。

1　儀器與材料

1.1儀器Waters高效液相色譜儀(Waters2695泵自動進樣器，2998二極管陣列紫外檢測器，Waters自帶數(shù)據(jù)處理器)；超聲儀；旋轉蒸發(fā)儀；十萬分之一電子天平。

1.2材料β-細辛醚(批號：C10301000，Dr.Ehrenstorfer GmbH)；二十五味珊瑚丸(抽自青海金訶、西藏神猴、昌都光于利民、西藏甘露、西藏藏醫(yī)學院等9個生產(chǎn)企業(yè)，占全國生產(chǎn)企業(yè)的73%)。配制陰性樣品的藥材由西藏自治區(qū)食品藥品檢驗所標本室提供。甲醇為色譜純(美國Fisher公司)，水為超純水。

2　方法與結果

2.1色譜條件色譜柱：Waters Xselect CSH C18(4.6mm×250mm，5μm)；柱溫：35℃；流動相：甲醇-水(56∶44)；流速：1mL/min；檢測波長：254nm；進樣量：10μL。

2.2空白試驗按處方中藥味比例，配制不含藏菖蒲的群藥，按其工藝制成陰性樣品，再按供試品溶液的制備方法制備并測定，色譜圖見圖1。表明陰性樣品溶液在與β-細辛醚對照品相同保留時間處未現(xiàn)色譜峰，故認為無干擾。

2.3對照品溶液的制備精密稱取β-細辛醚對照品適量，加甲醇制成1mL含0.25mg的溶液，作為對照品溶液。

2.4供試品溶液的制備[4，6，7]取本品2g，研細，精密稱定，加甲醇20mL，加熱回流提取1h，過濾后，藥渣再用20mL甲醇加熱回流提取1h。合并兩次提取液，用旋轉蒸發(fā)儀在30℃下減壓干燥完全，加入少量甲醇洗滌，用甲醇定容至10mL量瓶中，搖勻，用0.45μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液即得。

2.5線性關系的考察精密稱取β-細辛醚對照品適量，制得濃度溶液為0.24815mg/mL，分別進樣2、4、6、8、10、12μl，按上述色譜條件，測定峰面積。以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，并進行線性回歸，回歸方程：Y=2.23e+006X-8.85e+004(r=0.9999)，結果表明，β-細辛醚在0.4963～2.9778μg范圍內線性關系良好。

2.6精密度試驗取同一供試品溶液，連續(xù)進樣6次，RSD值為 0.5%。表明儀器的精密度良好。

2.7穩(wěn)定性試驗取同一供試品溶液，按上述色譜條件，分別在室溫下放置0、2、4、8、12h進樣測定，結果峰面積基本不變，RSD值為0.73%，表明供試品溶液在12h內基本穩(wěn)定。

2.8重復性試驗取本品1批，按照上述方法制備成6份供試品溶液，測得β-細辛醚平均含量為2.04mg/g，RSD值為1.1%。

2.9回收率試驗精密稱取來自7個不同生產(chǎn)企業(yè)已知含量的樣品約1g，分別精密加入濃度的β-細辛醚對照品，進樣測定，平均回收率及RSD值見表1。

表1　回收率試驗結果

2.10樣品的測定取7個生產(chǎn)企業(yè)樣品，按上述方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下，進行含量測定。計算樣品中β-細辛醚的含量，結果見表2。

表27家生產(chǎn)企業(yè)樣品含量測定數(shù)據(jù)(n=4)

生產(chǎn)企業(yè)批號β-細辛醚(mg·g-1)RSD/%西藏神猴201503070.66060.24西藏藏諾1403040.56470.39西藏光宇利民201302041.24700.56青海金訶201504070.45050.45西藏甘露14125A1.97131.42西藏藏醫(yī)學院1407010.33431.57西藏金珠雅礱1412020.72381.32

3　討論

3.1用甲醇、水超聲提取，結果雜質峰干擾嚴重，分離度較差。而采用甲醇加熱回流提取后用旋轉蒸發(fā)儀回收溶劑，可除去較多雜質峰，各組分能夠良好分離。

3.2采用不同流動相進行考察，乙腈和0.05%磷酸溶液梯度洗脫，結果出峰時間推遲且峰拖尾，甲醇和水比例為(65∶35)，結果峰分離差。用甲醇和水比例(46∶44)結果峰形對稱，分離好且分析時間縮短。

3.3二十五味珊瑚丸中同時含β-細辛醚和α-細辛醚，是藏菖蒲發(fā)揮藥效的重要指標成分。目前國內無β-細辛醚和α-細辛醚標準品，國外購進的純度較低[8]，β-細辛醚對照品色譜圖顯示含β-細辛醚和α-細辛醚兩種成分，但是樣品中α-細辛醚的含量低，故未建立α-細辛醚的含量測定方法。

3.4由于藏菖蒲藥材產(chǎn)地、年限、采收季節(jié)等因素不同，β-細辛醚含量明顯不同。同時結合78批次樣品含量測定結果，考慮該藥品存放時間、生產(chǎn)工藝穩(wěn)定對β-細辛醚含量影響等因素，暫訂本品每1g含藏菖蒲以β-細辛醚計，應為0.40～2.20mg。

3.5對全國8家生產(chǎn)企業(yè)涉及的78批次的二十五味珊瑚丸進行了β-細辛醚的含量測定，范圍在0.30～2.20 mg/g之間，表2可以看出西藏甘露生產(chǎn)(批號：14125A)的二十五味珊瑚丸中β-細辛醚的含量最高，比由西藏藏醫(yī)學院生產(chǎn)(140701)的高6倍，說明不同生產(chǎn)企業(yè)的該藥品β-細辛醚含量差異較大，含量較低難以保證藥效，故建議現(xiàn)行標準增加β-細辛醚的含量測定以便控制該藥品質量。

綜上，本實驗采用HPLC法對藏藥二十五味珊瑚丸的質量進行了評價，并對建立的方法進行了詳盡的方法學考察，為二十五味珊瑚丸質量標準的提高提供了實驗依據(jù)，可作為二十五味珊瑚丸的質量控制方法。

[1]占堆，趙軍寧. 藏醫(yī)成方制劑現(xiàn)代研究與臨床應用[M]. 成都：四川科學技術出版社，2009:173-185.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:409-410.

[3]傅思瑩，楊國柱，李翎，等.對致癇大鼠氨基酸遞質受體及即早基因表達的影響[J].中藥材，2014,37(6):1053-1056.

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(編輯：程鵬飛)

Content Determination of β-asarone in Tibet Traditional Medicine Ershiwuwei Shanhu Pills by HPLC

LAN JunA Ping

Tibet Institute for Food and Drug Control, Lhasa 850000, China

Objective To establish a UPLC determination method for β-asarone in Ershiwuwei Shanhu Pills. Methods The chromatogram column was Waters Xselect CSH C18(4.6mm×250mm,5μm), the mobile phase consisted of methanol-water (20∶80) and the flow rate was 1mL/min. The detection wavelength was 254nm and the column temperature was 35℃. Results The linear range of β-asarone was 0.4963～2.9778μg,r=0.9999. The average recovery rate was 99.27%,RSD%=1.1%. Conclusion The method is accurate, reliable, fast, sensitive, and suitable for quality control of Tibet traditional medicine Ershiwuwei Shanhu Pills.

Ershiwuwei Shanhu Pills; β-Asarone;HPLC;Content Determination

2016-06-15

蘭鈞(1984-)，女，漢族，本科學歷，主管藥師，主要從事藥品檢驗和質量標準修訂工作。E-mail:623793676@qq.com

R291.408

A

1007-8517(2016)17-0008-03