高效液相色譜法測定藥品中的二硫蘇糖醇和氧化型二硫蘇糖醇

羅 寧， 劉平懷*， 吳曉娜， 陳 晨， 張 玲， 何沂飛， 李 昂

(熱帶作物種質(zhì)資源保護(hù)與開發(fā)利用教育部重點實驗實，海南大學(xué)材料與化工學(xué)院，海南海口 570228)

二硫蘇糖醇(DTT)屬于常用的巰基試劑，其揮發(fā)性低、難聞氣味較少，而且氧化電位低。DTT的氧化態(tài)(DTTox)為環(huán)狀結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，所以具有較高的還原性。在DNA提取實驗中常常添加DTT打斷蛋白質(zhì)之間的二硫鍵，使DNA充分游離，提高DNA的提取效率[1,2]。DTT也常常被用于蛋白質(zhì)中二硫鍵的還原，可用于阻止蛋白質(zhì)中的半胱氨酸之間所形成的蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間二硫鍵，因此，在蛋白質(zhì)提取中添加DTT可以保護(hù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)不被破壞[3,4]。

試驗藥品有效成分為工程菌的代謝產(chǎn)物，是一種活性蛋白。在生產(chǎn)過程中添加DTT用來保護(hù)目標(biāo)蛋白結(jié)構(gòu)，維持藥物活性。DTT屬于巰基化合物，還原性較強(qiáng)，在體內(nèi)可能會破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，從而引起酶失活等現(xiàn)象，目前常用凝膠過濾[5]和透析[6]去除DTT。DTTox會使肌酸激酶結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，達(dá)到一定濃度時甚至?xí)辜∷峒っ竿耆Щ頪7]。因此必需對該藥品中的DTT和DTTox進(jìn)行檢測。目前有報道用二硫蘇糖醇分光光度計測定鈷離子含量[8]，但DTT極容易被氧化，且滴定法靈敏度不高，所以不能采用鈷離子來反滴定DTT。DTTox也沒有有效檢測方法。高效液相色譜法在藥品檢測中應(yīng)用較廣[9,10]。因此，本文采用高效液相色譜法同時對藥品中DTT和DTTox進(jìn)行檢測，確保藥品的安全性。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

大連依利特高效液相色譜儀，包括DAD230+二極管陣列檢測器，P230高壓恒流泵，EC2000工作站，柱溫箱，在線脫氣機(jī)；BT224S/BT25S電子天平(賽多利斯公司)；超聲清洗器(深圳潔盟)；pH計(上海雷磁)。

DTT對照品(Amresco，2934C515，Purity(-SH Content)：99.5%，Loss on Drying：0.4%，美國)；DTTox對照品(SIGMA-ALDRICH，D3511，Purity(TLC)≥99%，美國)。甲醇為色譜純(美國TEDIA)；三氟乙酸為分析純；水為娃哈哈(純凈水)。

試驗藥品由本實驗室生產(chǎn)，四批藥品批號為：S20140507、S20140509、S20140607和S20140609。

1.2 實驗方法

1.2.1色譜條件色譜柱：Waters X-Bridge C18(250×4.6 mm,5 μm)；流動相:體積比30∶70的甲醇-水(含0.02%三氟乙酸)；流速：1.0 mL/min；柱溫：40 ℃；檢測波長：210 nm；進(jìn)樣量：100 μL。

1.2.2溶液的制備分別稱取DTT和DTTox對照品1.26 mg ，置于25 mL容量瓶中，純凈水稀釋至刻度，配制成50 μg/mL的單對照品儲備溶液。各取DTT和DTTox對照品溶液0.5 mL，置于10 mL容量瓶中，純凈水稀釋到刻度，配制成2.5 μg/mL的混合對照品溶液，搖勻，過濾。

精密稱取藥品100.00 mg，置于10 mL容量瓶中，用純凈水稀釋至刻度，搖勻，過濾，配制成10 mg/mL的樣品溶液。以過濾后的純凈水為空白溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測波長的選擇

從DAD光譜圖可以看出DTTox在波長283 nm處有吸收峰，但在200 nm附近也有較強(qiáng)吸收且高于283 nm處的吸收峰值，DTT在210 nm附近有較強(qiáng)吸收,這與之前報道的巰基化合物最大吸收基本一致[11,12]。為了提高方法的靈敏度，選擇波長210 nm作為DTT和DTTox的檢測波長。在此檢測波長下吸收較大，同時峰的純度較高，能較好滿足分析檢測要求。

2.2 色譜分離條件的優(yōu)化

流動相首先采用了水與甲醇，采用等度洗脫，調(diào)整比例發(fā)現(xiàn)當(dāng)比例為70∶30時DTT的峰形較好，但DTTox的峰不對稱，有拖尾現(xiàn)象。在流動相中添加0.02%三氟乙酸及采用40 ℃柱溫后得到較對稱的DTTox峰。在選定流動相下DTT在5 min左右出峰，DTTox在7 min左右出峰，且都能達(dá)到較好的分離。精密吸取空白溶液、混合對照品溶液、藥品溶液及藥品與混合對照品的混合液各100 μL，分別注入色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果表明，主峰的理論塔板數(shù)N均大于20 000，拖尾因子在1.0左右，藥品中其他成分不干擾DTT和DTTox的檢測，分離度良好，能夠滿足DTT和DTTox定量檢測的要求。結(jié)果見圖1。

圖1 系統(tǒng)適用性考察色譜圖Fig.1 Chromatograms of system suitability investigation A.Blank;B.Rererence substance;C.Sample;D.Sample+Reference substance.1.DTT；2.DTTox.

2.3 專屬性試驗

將空白溶劑和藥品經(jīng)高溫、強(qiáng)光、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、氧化和水浴等條件破壞，依次進(jìn)樣。結(jié)果表明，藥品經(jīng)高溫、強(qiáng)光、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、氧化、水浴條件破壞后有一定的降解，且降解產(chǎn)物與主峰能夠較好分離，說明藥品中降解產(chǎn)物對DTT和DTTox的檢測沒有干擾，方法的專屬性較好。

2.4 定量限和檢出限

分別取DTT和DTTox對照品溶液，用純凈水逐級稀釋，進(jìn)樣并記錄色譜圖。以信噪比(S/N)=3及10來確定DTT和DTTox檢出限與定量限[13]。結(jié)果表明，DTT和DTTox的檢出限均為0.02 μg/mL，定量限均為0.07 μg/mL。

2.5 線性關(guān)系

精密移取DTT和DTTox標(biāo)準(zhǔn)儲備各0.5、1.0、2.5、5.0、10、20 mL，分別置于100 mL容量瓶中，用純凈水稀釋至刻度配制成不同質(zhì)量濃度的混合對照溶液，依次進(jìn)樣，以濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。DTT在0.22～8.68 μg/mL范圍內(nèi)線性良好，線性方程為：Y=54501X-2731.8(r=0.9999)；DTTox在0.23～9.20 μg/mL范圍內(nèi)線性良好，其線性方程為：Y=70939X-3578.4(r=0.9998)。

2.6 溶液的穩(wěn)定性

取同一份混合對照品溶液，分別在室溫和5 ℃冰箱冷藏下放置 0、2、4、6、8 h 后進(jìn)樣測定，比較峰面積的變化情況。結(jié)果表明，室溫下DTT和DTTox 2 h內(nèi)峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)大于15%，說明混合對照溶液在室溫下不穩(wěn)定；而5 ℃冰箱冷藏下DTT和DTTox 4 h內(nèi)峰面積RSD分別為2.26%、1.17%，說明混合對照溶液在5 ℃冷藏下4 h是穩(wěn)定的。

2.7 精密度和回收率

精密移取同一混合對照品溶液100 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果DTT峰面積RSD為0.51%，DTTox峰面積RSD為0.78%，表明方法精密度良好。

精密稱量100 mg藥品，置于10 mL量瓶中(稱取6份，分成3組)。每組分別精密稱取適量DTT和DTTox對照品，配置高、中、低3個濃度的混合對照溶液進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗，結(jié)果見表1。DTT和DTTox的平均回收率分別為99.32%和99.49%，RSD(n=6)分別為2.34%和2.23%，能滿足藥品中DTT和DTTox含量的檢測。

表1 DTT和DTTox加標(biāo)回收率(n=6)

2.8 樣品測定

在選定色譜條件下檢測4批藥品，取每批次藥品平行測定兩次。結(jié)果均未在藥品中檢測出DTT和DTTox。試驗所選藥品濃度為10 mg/mL，檢出限均為0.02 μg/mL，說明藥品中DTT和DTTox的含量均小于2 mg/kg。

3 小結(jié)

本文建立了一種高效液相色譜測定藥品中DTT和DTTox含量的方法，并通過方法學(xué)考察驗證該方法的可靠性。該方法具有操作簡便、分離度好、靈敏度高、重復(fù)性好、回收率高等優(yōu)點，為DTT和DTTox提供了一種有效檢測方法。