基于Pt-Ni合金納米管修飾免疫傳感器的研制

常艷兵， 馮亞娟， 楊曉麗， 何 瓊

(曲靖師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，云南曲靖 655011)

甲胎蛋白(AFP)是胚胎發(fā)育早期的一種主要血清蛋白[1]，它在機(jī)體內(nèi)具有許多重要的生理功能，如運輸、作為生長調(diào)節(jié)因子等。在病理狀態(tài)下,甲胎蛋白與原發(fā)性肝癌、肺癌、睪丸腫瘤等相關(guān)，因此，臨床上AFP常被用作胎兒缺陷和腫瘤的血清標(biāo)志物,對于輔助診斷及疾病監(jiān)測有重要的價值[2,3]。目前AFP的檢測方法主要有色譜分析法、酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)[4]、熒光分析法[5]、放射免疫測定法(RIA)、間接血凝法及瓊脂雙擴(kuò)散法等。這些方法靈敏高、可靠性強(qiáng)，但大部分需要對抗原或抗體進(jìn)行放射性標(biāo)記，具有放射性危害，且操作復(fù)雜，所用儀器設(shè)備昂貴。利用電化學(xué)方法檢測免疫反應(yīng)具有檢出限低、靈敏度高、操作簡便、儀器設(shè)備價廉等優(yōu)點而逐漸成為研究的熱點[6 - 9]。

Pt納米材料因具有較高的催化活性、較強(qiáng)的吸附能力和生物相容性，且容易修飾等特性，因而被廣泛用于生物分子的固載和電極的修飾；Ni納米材料能夠增加酶的活性，實現(xiàn)酶的直接電化學(xué)檢測，結(jié)合Pt、Ni雙金屬納米材料各自的優(yōu)點可極大地提高免疫傳感器的靈敏度[10 - 12]。本文利用恒電位沉積法制得Pt-Ni合金納米管，將其修飾到玻碳電極上制成免疫傳感器。用該免疫傳感器來測定甲胎蛋白，結(jié)果表明具有電流響應(yīng)高、靈敏度好、性能穩(wěn)定等優(yōu)點。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

CHI660C電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司)；XL30ESEM-TMP掃描電鏡(荷蘭，飛利浦有限公司)；GenesisXMX X射線能譜儀(美國,伊達(dá)克斯有限公司)；pHS-3C型pH計(上海虹益儀器儀表有限公司)；SK2200H超聲波清洗器(上海科導(dǎo)超聲波儀器有限公司)；工作電極為Pt-Ni合金納米管修飾的玻碳電極。

甲胎蛋白測定診斷試劑盒(Diagnostic kit for Alpha-feto-protein，AFP，北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；多孔聚碳酸酯模板(PC，0.2 mm，美國沃特曼公司)；H2O2(上?；瘜W(xué)試劑公司)；Ni(NO3)2·6H2O(廣東光華化學(xué)廠有限公司)；H2PtCl6·6H2O)(上海精細(xì)化工材料研究所)；0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH=6.8)由Na2HPO4和KH2PO4配制。實驗所用試劑均為分析純，水為二次重蒸水。

1.2 實驗方法

1.2.1玻碳電極的預(yù)處理玻碳電極先用金相砂紙打磨，然后在毛皮上用不同粒度的Al2O3粉末進(jìn)行拋光，用水洗凈后，依次用HNO3(1+1)、丙酮和水各超聲洗滌5 min，在空氣中晾干，待用。

1.2.2工作電極的制作為了使模板具有良好的導(dǎo)電性，在聚碳酸酯(PC)模板的一面濺射上約50 nm厚的金層。取一塊已噴金的PC模板，用導(dǎo)電膠將銅絲與PC模板噴金的一面粘在一起，作為工作電極。為了排除模板孔內(nèi)的空氣和雜質(zhì)，制得排列整齊有序的納米管，使用前需將粘有噴金PC模板的工作電極超聲清洗3 min。

1.2.3電沉積法制備Pt-Ni合金納米管先用王水洗凈實驗用的玻璃器皿，取5 mL 2.0×10-3mol/L Ni(NO3)2溶液，0.5 mL 3.862×10-2mol/L H2PtCl6·6H2O溶液和1 mL 1 mol/L KCl溶液于小燒杯中，混合均勻。將制作好的工作電極、飽和甘汞電極和鉑電極置于燒杯混合液中浸泡20 min，使PC膜板充分浸泡，電解液進(jìn)入孔內(nèi)，潤濕內(nèi)壁。然后接通電源，在-0.30 V的恒電位下沉積30 min。取出沉積模板依次用乙醇、水進(jìn)行清洗，自然晾干。

1.2.4Pt-Ni合金納米管修飾的免疫傳感器的制備取10 μL殼聚糖乙酸溶液(m/V=0.5%)滴于預(yù)處理好的玻碳電極上，剪一塊沉積有Pt-Ni合金的圓形PC模板(Φ=3 mm)貼于其表面。用氯仿和乙醇(體積比為1∶1)的混合液溶解模板后，用水清洗晾干。取5 μL甲胎蛋白抗體(AFP Ab)滴于修飾好的電極上，干燥后用0.5 mol/L NaCl溶液和水洗滌3次，在0.1 mol/L甘氨酸中于25 ℃恒溫封閉30 min，封閉未結(jié)合抗體的Pt-Ni合金納米管的活性位點。每次檢測前先在一定量的AFP抗原(AFP Ag)溶液中于25 ℃ 恒溫培育30 min，然后在酶標(biāo)抗體(AFP Ab/HRP)中于25 ℃恒溫培育30 min，即制得無試劑型酶膜修飾的免疫傳感器。每次培育完均用0.5 mol/L NaCl溶液和水清洗，即可用于檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 Pt-Ni合金納米管的表征

制得Pt-Ni合金的掃描電鏡(SEM)見圖1，可以看出Pt-Ni合金成管狀，排列整齊、均勻，直徑和長度均在納米范圍內(nèi)。通過能譜分析儀對Pt-Ni合金進(jìn)行分析(圖2)，從圖中可以看出，合金由Pt和Ni兩種主要元素組成，且含量固定，合金中含Pt量高于Ni。

圖1 Pt-Ni合金納米管的掃描電鏡(SEM)圖Fig.1 SEM images of the Pt-Ni alloy nanotubes

圖2 Pt-Ni合金納米管的X射線能譜(EDS)圖Fig.2 EDS of the Pt-Ni alloy nanotubes

2.2 免疫傳感器的循環(huán)伏安行為

圖3為免疫傳感器在-0.6～+0.6 V之間，掃描速度為100 mV/s時的循環(huán)伏安行為。在0.1 mol/L pH值為6.8的PBS中，未加入H2O2時，傳感器產(chǎn)生一個較低的背景電流(圖3-a)；當(dāng)加入H2O2(9.9×10-3mol/L)時，其氧化峰電流急劇增加(圖3-b)，證實了標(biāo)記在抗體上的HRP酶的催化作用。

同時，通過實驗比較了裸玻碳電極與Pt-Ni合金納米管修飾的免疫傳感器對H2O2的電流響應(yīng)，裸玻碳電極對H2O2幾乎沒有電流響應(yīng)，而Pt-Ni合金納米管修飾的免疫傳感器對H2O2的電流響應(yīng)急劇增加，證明Pt-Ni合金納米管提高了甲胎蛋白抗體在電極上的固定量，具有很強(qiáng)的吸附能力及催化和直接電子傳遞作用。

2.3 實驗條件的優(yōu)化

2.3.1pH值對免疫傳感器的影響pH值對該免疫傳感器的影響如圖4所示。實驗發(fā)現(xiàn):該傳感器在不同pH值的PBS中有不同的響應(yīng)電流信號，當(dāng)pH值從5.6增加至6.8時，響應(yīng)電流信號不斷增強(qiáng)，但從6.8以后隨著pH的增大響應(yīng)電流信號反而逐漸減小。因此，本實驗選擇pH值為6.8的PBS作為檢測底液。

圖3 免疫傳感器在不同溶液中的循環(huán)伏安圖Fig.3 Cyclic voltammogram of immunosensor at different solusion a:0.1 mol/L PBS(pH=6.8)；b:PBS(pH=6.8) containing 9.9 mmol/L H2O2.

圖4 pH對免疫傳感器的影響Fig.4 Effect of pH on the immunosensor

2.3.2培育時間對免疫傳感器的影響考察了培育時間對該傳感器的影響。將修飾有抗體的免疫傳感器置于60 ng/mL抗原溶液中，分別培育5、10、30和50 min后，在含有H2O2(9.9×10-3mol/L)的PBS(pH=6.8)中，用計時電流法測定其響應(yīng)電流。實驗發(fā)現(xiàn)，隨著培育時間的增加，響應(yīng)電流不斷增大，當(dāng)培育時間為30 min時，響應(yīng)電流值最大，之后隨著培育時間的增長響應(yīng)電流基本趨于穩(wěn)定，說明此時免疫反應(yīng)已基本完成，傳感器上結(jié)合的抗原量達(dá)到飽和。因此，本實驗選擇30 min為最佳培育時間。

2.4 免疫傳感器的響應(yīng)特性

在最優(yōu)實驗條件下，采用計時電流法測定免疫傳感器對AFP的計時響應(yīng)電流和校正曲線。實驗表明，當(dāng)AFP的濃度范圍為20～100 ng/mL時，其響應(yīng)電流與抗原濃度成線性關(guān)系(圖5)，線性回歸方程為：i(μA)=0.216+7.375×10-3c，檢出限為0.38 ng/mL，低于文獻(xiàn)報道的0.5 ng/mL[6]。在PBS(pH=6.8)中加入100 μL(1.0 mol/L)H2O2時，隨著抗原濃度的增大，計時電流響應(yīng)也隨著增大，原因是隨著抗原濃度的增大，結(jié)合的酶標(biāo)抗體的量增大，進(jìn)而使催化H2O2，產(chǎn)生的還原電流增大。

圖5 免疫傳感器在不同抗原濃度下的校正曲線Fig.5 The calibration curve of immunosensor in different AFP concentration

2.5 樣品測定

向所采集的健康者新鮮血清中加入AFP配制成不同濃度的測試樣品，將該免疫傳感器置于3個濃度的測試樣品中培育30 min 后，按實驗方法進(jìn)行檢測，結(jié)果列于表1。結(jié)果表明，回收率較好，說明本傳感器可用于血清樣品中AFP的測定。

用該免疫傳感器對7份血清樣品(由曲靖市第一人民醫(yī)院提供)進(jìn)行檢測，并將檢測結(jié)果與該院用放射免疫測定法(RIA)結(jié)果進(jìn)行了比較，兩種方法的結(jié)果基本一致，符合率為 91.5%，表明該免疫傳感器能用于臨床上血樣中AFP的檢測。

表1 AFP免疫傳感器的回收結(jié)果

3 結(jié)論

本文利用恒電位沉積法制得Pt-Ni合金納米管，結(jié)合Pt和Ni兩種納米材料具有較高的催化活性、較強(qiáng)的吸附能力和生物相容性，將其修飾到玻碳電極上制成免疫傳感器。用該免疫傳感器來測定甲胎蛋白，結(jié)果表明具有電流響應(yīng)高、靈敏度好、性能穩(wěn)定等優(yōu)點。