熒光光譜法研究分解后白術揮發(fā)油與β -環(huán)糊精和羥丙基-β -環(huán)糊精的包合作用

趙紅紅， 閻克里， 劉煥蓉*

(1.山西大學化學化工學院，山西太原 030006；2.山西省腫瘤研究所，山西太原 030013)

將不穩(wěn)定的白術揮發(fā)油進行徹底的氧化分解后，產(chǎn)物穩(wěn)定[1]。該穩(wěn)定的分解后白術揮發(fā)油(Decomposed Volatile Oil fromAtractylodesMacrocephalaKoidz，DVOA)可殺傷抑制及誘導人類卵巢癌細胞SKOV-3細胞凋亡，且在凋亡早期、晚期均可發(fā)揮作用[2]。為將分解后白術揮發(fā)油開發(fā)為抗腫瘤新藥，需對其進行制劑工藝的研究。

環(huán)糊精(CD)分子具有中空圓筒的立體環(huán)狀結構，外親水、內(nèi)疏水，其內(nèi)部疏水空腔可嵌入各種化合物。采用環(huán)糊精包合技術可使揮發(fā)油粉末化以減少藥效成分的揮發(fā)、掩蓋不良氣味，增加揮發(fā)油水溶性及其生物利用度[3,4]，而β-環(huán)糊精(β-CD)和羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD)因分子空洞適中，參與機體代謝，使用安全，被廣泛應用于醫(yī)藥領域。在包合反應中，熒光光譜法因選擇性好，靈敏度高，容易操作及經(jīng)濟實用等特點得到廣泛應用[5,6]。利用熒光光譜法研究一些單分子藥物在溶液中與β-CD和HP-β-CD的包合作用已有報道[7 - 11]。但熒光光譜法在β-CD和HP-β-CD與中藥多組分揮發(fā)油包合作用中的應用未見報道。

本文采用熒光光譜法研究了β-CD和HP-β-CD與分解后白術揮發(fā)油的包合特性，測定了包合物的包合比和包合常數(shù)，并對揮發(fā)油與HP-β-CD包合過程中的熱力學參數(shù)進行了研究，旨在為分解后白術揮發(fā)油包合物的制備提供可靠理論依據(jù)，為將分解后白術揮發(fā)油開發(fā)為抗腫瘤新藥奠定基礎。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Varian Cary Eclipse熒光光譜儀(美國，瓦里安(中國)有限公司)；THZ-82A型水浴恒溫振蕩器(江蘇省金壇榮華儀器制造有限公司)。

β-環(huán)糊精(β-CD)和羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD)購于郁南縣永光環(huán)狀糊精有限公司。分別精密稱取干燥的β-CD 1.135 g、HP-β-CD 2.354 g，用水溶解并定容至100 mL，配制成濃度為10 mmol/L的儲備溶液。分解后白術揮發(fā)油參考文獻方法[1]制備。實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 實驗方法

在10 mL具塞試管中，依次加入分解后白術揮發(fā)油10 mg，一定體積環(huán)糊精儲備溶液，加水至10 mL，充分振蕩后，靜置。取上清液經(jīng)0.22m濾膜過濾后，在激發(fā)波長范圍300～450 nm、發(fā)射波長范圍380～700 nm內(nèi)，進行熒光光譜掃描，激發(fā)和發(fā)射光譜通帶寬度均為5 nm，并同時進行空白水溶液的熒光光譜掃描。

2 結果與討論

2.1 揮發(fā)油的熒光光譜

按1.2中方法掃描空白水溶液無熒光發(fā)射，分解后白術揮發(fā)油在水溶液中的熒光光譜如圖1所示。由圖1可知，分解后白術揮發(fā)油的激發(fā)波長為375 nm，發(fā)射波長為460 nm，即揮發(fā)油在375 nm的紫外光下發(fā)射藍色熒光，其中熒光物質為揮發(fā)油的主要活性成分香豆素類的倍半萜內(nèi)酯。

2.2 包合時間對包合體系熒光強度的影響

按1.2中的方法，分別考察了溫度25 ℃下，β-CD和HP-β-CD濃度均為1 mmol/L時，包合時間對包合體系熒光強度的影響，結果見圖2。圖2顯示：包合體系熒光強度隨振蕩時間的增加而逐漸增大，24 h后趨于穩(wěn)定，表明β-CD和HP-β-CD與揮發(fā)油已充分包合且穩(wěn)定，因此24 h選為最佳包合時間。

圖1 分解后白術揮發(fā)油的熒光光譜Fig.1 Fluorescence spectrum of DOVA

圖2 包合時間對包合體系熒光強度的影響Fig.2 Effect of inclusion time on fluorescence intensity of the inclusion system

圖3 環(huán)糊精濃度對包合體系熒光強度的影響Fig.3 Effect of concentration of cyclodextrin on fluorescence intensity of the inclusion system 1-6：0，1，2，4，6，8 mmol/L,respectively.

2.3 環(huán)糊精濃度對包合體系熒光強度的影響

按1.2中方法，分別考察了溫度25 ℃下，β-CD和HP-β-CD濃度對包合體系熒光強度的影響，熒光光譜如圖3所示。圖3結果顯示：460 nm波長處，隨著β-CD和HP-β-CD濃度的增加，分解后白術揮發(fā)油的發(fā)射波長不變，而熒光強度均逐漸增大。這是由于β-CD和HP-β-CD與揮發(fā)油發(fā)生了包合作用，二者的疏水空腔保護了分解后白術揮發(fā)油分子，減少了熒光猝滅，并使其運動的自由度降低，分子間的去活性碰撞減少，從而使量子產(chǎn)率提高，熒光強度增大[8,12]。

熒光增強效應為：HP-β-CD>β-CD。這是由于HP-β-CD分子中羥基少于β-CD，分子柔性大，腔口易擴大，疏水區(qū)域深度增加，故顯示出更加優(yōu)良的包合性能[13]。

2.4 包合物包合比和包合常數(shù)的測定

假設環(huán)糊精與分解后白術揮發(fā)油以1∶1包合，根據(jù)改進的Benesi-Hildebrand方程：

(1)

假設環(huán)糊精與分解后白術揮發(fā)油以2∶1包合，且[CD]>>[V]，則有：

(2)

式中：[V]表示揮發(fā)油的濃度(mg/mL)；[CD]表示環(huán)糊精的濃度(mg/mL)；F、F0分別表示有無環(huán)糊精存在時體系的熒光強度；k表示儀器常數(shù)；Q表示包合物的熒光量子產(chǎn)率；K表示包合物的包合常數(shù)。

以1/(F-F0)對1/[CD]及1/(F-F0)對1/[CD]2分別做雙倒數(shù)曲線回歸分析，若為線性，則由截距與斜率的比值可以得到包合物的K值。溫度25 ℃下，β-CD和HP-β-CD與揮發(fā)油形成包合物的熒光雙倒數(shù)曲線見圖4。

圖4 包合物的雙倒數(shù)曲線Fig.4 Double reciprocal plots for the inclusion complex

由圖4可知：1/(F-F0)與1/[β-CD]和1/[HP-β-CD]均呈良好的線性關系，而與1/[β-CD]2和1/[HP-β-CD]2則無線性關系，表明β-CD和HP-β-CD均以1∶1的包合比與揮發(fā)油形成包合物。

按相同的方法得到溫度35 ℃和45 ℃下?lián)]發(fā)油與β-CD及HP-β-CD包合物的線性回歸方程及包合常數(shù)K值見表1。

表1 不同溫度下包合物的包合常數(shù)

由表1可知，隨著溫度的升高，分解后白術揮發(fā)油與β-CD及HP-β-CD包合物的K值均明顯減小，表明包合穩(wěn)定性隨溫度的升高而降低；不同溫度下，分解后白術揮發(fā)油/HP-β-CD包合物的包合常數(shù)均大于分解后白術揮發(fā)油/β-CD包合物的包合常數(shù)，表明分解后白術揮發(fā)油與HP-β-CD形成的包合物更穩(wěn)定。

2.5 分解后白術揮發(fā)油/HP-β -CD包合物的熱力學參數(shù)

圖5 分解后白術揮發(fā)油/HP-β -CD包合物的范特霍夫方程擬合直線Fig.5 Van’t Hoff plot for DVOA/HP-β -CD inclusion complex

根據(jù)Van’t Hoff方程：

lnK=-△H/T+△S/R

(3)

將25 ℃、35 ℃和45 ℃下，分解后白術揮發(fā)油/HP-β-CD包合物的K值以lnK對l/T進行線性回歸，如圖5所示。由回歸方程的斜率與截距求得分解后白術揮發(fā)油與HP-β-CD包合過程中的△H為-22.3 kJ/mol，而△S為-31.67 J/(mol·K)，由△G=△H-T△S可得到25 ℃、35 ℃和45 ℃下包合過程的吉布斯自由能變△G分別為-12.8、12.5、12.2 kJ/mol。

由上述結果可知，25 ℃、35 ℃和45 ℃下，揮發(fā)油與HP-β-CD包合過程中的△G均為負值，表明包合反應均可自發(fā)進行。包合過程中的△H和△S也均為負值，表明包合反應為焓驅動過程[16]，并為放熱反應。由此可預測，若升高溫度，包合反應將向相反方向進行，表現(xiàn)為包合物的K值隨溫度的升高而減小，這與表1中實驗計算的K值結果相一致。包合過程負的△S值亦表明，分解后白術揮發(fā)油分子進入HP-β-CD的剛性疏水空腔后，自由度下降，從而使包合體系熵值減小[15]。另外，揮發(fā)油與HP-β-CD包合反應的焓變小于一般化學反應熱，說明該包合反應是一種物理過程，沒有共價鍵的形成，是揮發(fā)油成分分子與HP-β-CD分子間氫鍵、范德華力作用的結果[16]。

3 結論

本文采用熒光光譜法研究了中藥多組分分解后白術揮發(fā)油與β-CD和HP-β-CD形成包合物的作用過程。在水溶液中，β-CD和HP-β-CD均以1∶1的包合比與揮發(fā)油形成包合物，且形成包合物的穩(wěn)定性為HP-β-CD>β-CD；升高溫度，揮發(fā)油與HP-β-CD的包合穩(wěn)定性降低，包合反應可自發(fā)進行，且為放熱反應，包合過程是揮發(fā)油分子與HP-β-CD分子間氫鍵和范德華力作用的結果。