磁固相萃取與膠體金免疫層析試紙條聯(lián)用檢測(cè)食品中氯霉素

許勝男， 余瓊衛(wèi)， 袁必鋒， 馮鈺锜

(生物醫(yī)學(xué)分析化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院，湖北武漢 430072)

氯霉素(Chloramphenicol,CAP) 是一種廣譜抗菌素，被廣泛用于治療傷寒等疾病。研究發(fā)現(xiàn)，如果人們長(zhǎng)期食用含有 CAP 殘留的動(dòng)物源性食品，將對(duì)健康構(gòu)成直接或潛在的威脅[1]。許多國(guó)家對(duì)食品中CAP 殘留的最大允許檢出限量(MRPLs) 低至0.3 ng/g[2]。因此，快速準(zhǔn)確篩查食品中CAP十分重要。目前已報(bào)道的用于分析檢測(cè)CAP的方法主要是高效液相色譜法(HPLC)[3 - 6]和氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[7 - 9]。這些方法需要較長(zhǎng)的操作時(shí)間和昂貴的儀器，不能滿(mǎn)足大批量樣品的快速篩查和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的需要。膠體金免疫層析(GICA)試紙條(簡(jiǎn)稱(chēng)試紙條)正好滿(mǎn)足了這個(gè)要求，它具有操作簡(jiǎn)單，短時(shí)間內(nèi)可得到檢測(cè)結(jié)果，生產(chǎn)成本和檢測(cè)成本較低等特點(diǎn)。目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)出檢測(cè)多種食品中CAP的試紙條[10]。由于牛奶樣品呈液態(tài)，可以不經(jīng)過(guò)前處理直接用試紙條檢測(cè)，而蜂蜜和雞蛋等樣品是粘稠狀態(tài)，無(wú)法像牛奶樣品一樣直接進(jìn)行檢測(cè)，因此市場(chǎng)上多數(shù)是用于檢測(cè)牛奶樣品的試紙條，少有的用于檢測(cè)蜂蜜和雞蛋樣品的試紙條的價(jià)格要比檢測(cè)牛奶樣品的試紙條價(jià)格高一倍。在試紙條檢測(cè)前對(duì)蜂蜜和雞蛋樣品進(jìn)行前處理，有望拓展檢測(cè)牛奶中CAP試紙條的應(yīng)用范圍。

磁固相萃取(MSPE)是以磁性納米顆粒為吸附劑的一種分散固相萃取技術(shù)。MSPE與常規(guī)固相萃取(SPE)相比，具有操作簡(jiǎn)單、萃取時(shí)間短、有機(jī)溶劑用量少、易于自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)[11]。本研究制備了一種聚苯胺(Polyaniline,PANI)包裹磁性納米Fe3O4的復(fù)合材料(MNPs)，將食品中CAP先采用聚苯胺磁性材料進(jìn)行MSPE，然后再進(jìn)行試紙條檢測(cè)。結(jié)果表明該聯(lián)用方法在擴(kuò)大試紙條應(yīng)用范圍的同時(shí)降低了檢測(cè)成本。該聯(lián)用模式由于操作簡(jiǎn)單、快速，具有廣泛的應(yīng)用前景。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 液相色譜-質(zhì)譜條件

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)是由日本島津LC-MS 2010EV 系列組成，包括二元泵、在線(xiàn)脫氣裝置、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器及電噴霧-單重四極桿質(zhì)譜儀。

色譜條件：色譜柱：XTerra C18柱(150×2.1 mm,i.d.,3.5 μm,美國(guó)Waters公司)；流動(dòng)相：A相為水，B相為甲醇。梯度洗脫條件：0～5 min，30%B；5～8 min，70%B；8～15 min，30%B；柱溫：40 ℃，流速為 0.2 mL/min。

質(zhì)譜條件:電噴霧-負(fù)離子源模式(ESI-)，選擇離子監(jiān)測(cè)(SIM)；載氣:氮?dú)猓籆AP 的準(zhǔn)分子離子(m/z)為 321，內(nèi)標(biāo)THAP 的準(zhǔn)分子離子(m/z)為354。

1.2 試劑與材料

FeCl3·6H2O、乙二醇(EG)、NaAc、乙二胺(ED)、乙腈、乙醇、丙酮、苯胺、過(guò)硫酸胺均為分析純，均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。氯霉素(CAP) 購(gòu)于中國(guó)生物藥品檢定所；CAP快速檢測(cè)試紙條購(gòu)買(mǎi)于北京維德維康生物技術(shù)有限公司。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

蜂蜜和雞蛋均購(gòu)買(mǎi)于武漢大學(xué)菜市場(chǎng)。

1.3 樣品處理

稱(chēng)取1.0 g蜂蜜或雞蛋樣品于樣品瓶中，加入10 mL水，手搖均勻，作為上樣液。

1.4 聚苯胺包裹磁性納米Fe3O4材料的制備

萃取材料的制備參照文獻(xiàn)方法[12]，以溶劑熱法合成磁性納米Fe3O4：稱(chēng)取5.0 g FeCl3·6H2O,溶于100 mL EG中，加入15.0 g NaAc固體，攪拌使其溶解后，加入50 mL ED，繼續(xù)攪拌30 min，使其成為均一的溶液，將溶液轉(zhuǎn)移至200 mL反應(yīng)釜中，于烘箱中200 ℃反應(yīng)8 h。然后用水和乙醇將得到的磁顆粒清洗至上清液澄清，于真空干燥箱中60 ℃烘干，備用。聚苯胺包裹磁性納米Fe3O4材料的合成：4.56 g過(guò)硫酸銨溶于250 mL 1 mol·L-1HCl，7.45 g苯胺溶于250 mL 1 mol·L-1HCl。將過(guò)硫酸銨溶液快速加入聚苯胺溶液中，劇烈攪拌30 s后靜置24 h，然后用水和乙醇依次將得到的聚苯胺材料清洗至上清液澄清，于真空干燥箱中60 ℃烘干，備用。將240 mg聚苯胺，60 mg磁性Fe3O4置于研缽中，研磨混合均勻，即得到聚苯胺包裹磁性Fe3O4復(fù)合材料。

1.5 磁固相萃取及試紙條檢測(cè)

1.5.1磁固相萃取過(guò)程磁固相萃取過(guò)程見(jiàn)圖1。具體步驟如下：上樣：稱(chēng)取50 mg聚苯胺包裹磁性納米Fe3O4材料于15 mL樣品瓶?jī)?nèi)，加入上樣液，手動(dòng)振蕩1 min，在外磁場(chǎng)作用下分離棄去上清液；清洗：加入2 mL水，手動(dòng)振蕩30 s，在外磁場(chǎng)作用下分離棄去上清液；解吸：加入1 mL乙腈解吸，手動(dòng)振蕩2 min，在外磁場(chǎng)作用下，倒出上清液于1.5 mL離心管內(nèi)，滴加溶液于點(diǎn)樣板，用洗耳球或吹風(fēng)機(jī)吹干，隨后進(jìn)行檢測(cè)。

1.5.2試紙條檢測(cè)檢測(cè)步驟參照說(shuō)明書(shū)，打開(kāi)試紙條筒，取所需金標(biāo)微孔，吸取200 μL樣品溶液于金標(biāo)微孔中，吹打至孔底的紫紅色顆粒完全溶解，置于一定溫度下，溫育3 min；從對(duì)應(yīng)的試紙條筒中，取出適量的試紙條，將試紙條插入溫育后的金標(biāo)微孔中，反應(yīng)6～8 min；從金標(biāo)微孔中取出試紙條，棄去試紙條下端的樣品墊，然后判讀結(jié)果。

結(jié)果判定(圖1)：T線(xiàn)比C線(xiàn)的顏色深或T線(xiàn)與C線(xiàn)顏色一致，表示樣品中不含有CAP(-)；T線(xiàn)比C線(xiàn)的顏色淺很多或沒(méi)有顏色，表示樣品中含有CAP(+)；若 C線(xiàn)不顯色，表示存在不正確的操作或檢測(cè)卡已失效(NE)，用新的試紙條重新檢測(cè)。

圖1 樣品中氯霉素的磁固相萃取與試紙條檢測(cè)示意圖Fig.1 Schematic diagram for CAP determination

2 結(jié)果與討論

2.1 試紙條直接檢測(cè)樣品中氯霉素

由于蜂蜜粘度太大，無(wú)法直接用試紙條檢測(cè)。取1.0 g蜂蜜，用10 mL水稀釋后用試紙條檢測(cè)。如表1所示，在蜂蜜中加入的CAP濃度為0、5和10 ng/g時(shí)，檢測(cè)均顯示陰性。表明即使將蜂蜜稀釋后檢測(cè)，但試紙條的檢出限太高，不適用于蜂蜜中CAP的檢測(cè)。

圖2 3種解吸液的解吸效果Fig.2 Extraction efficiency with different elution solvents

2.2 經(jīng)過(guò)磁固相萃取后試紙條檢測(cè)樣品中氯霉素

2.2.1磁固相萃取解吸液的選擇分別考察了甲醇、乙腈、丙酮三種解吸液對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，結(jié)果表明乙腈和丙酮的解吸效率相當(dāng)，見(jiàn)圖2?？紤]到丙酮更容易吹干，所以選用丙酮作為解吸液。由于解吸液要完全吹干后才能進(jìn)行檢測(cè)，考慮到此方法應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)，不能用氮吹儀等特殊設(shè)備，本研究提供的方法是用吹風(fēng)機(jī)或洗耳球等易攜帶的小工具吹干。為了縮短吹干時(shí)間，需要較少體積的解吸液， 但解吸液體積越少， 檢出限越高。綜合考慮， 解吸液的體積定為1 mL。

2.2.2磁固相萃取材料中MNPs和PANI質(zhì)量比的選擇分別考察了不同質(zhì)量比的MNPs和PANI組裝的萃取材料的萃取結(jié)果。如表1所示，MNPs和PANI的質(zhì)量比由4∶1減小至1∶4，試紙條的檢出限逐漸降低，由高于2 ng/g降至0.2 ng/g。繼續(xù)減小比例，試紙條的檢出限不變，仍為0.2 ng/g。所以選用質(zhì)量比1∶4的比例組裝磁固相萃取材料。

綜合考慮材料成本及檢出限兩方面，選用萃取材料用量為50 mg MNPs∶PANI(1∶4)和1 mL丙酮解吸液為最優(yōu)條件，在此條件下試紙條的檢出限可降至0.2 ng/g，見(jiàn)表1。

表1 未經(jīng)過(guò)MSPE處理和經(jīng)過(guò)MSPE處理后試紙條的檢測(cè)結(jié)果(n=3)

+:positive result;nd:not detected.

2.2.3不同批次萃取材料的萃取重現(xiàn)性為了考察萃取材料的重現(xiàn)性，采用不同批次的萃取材料進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。分別采用50 mg不同批次制備的萃取材料對(duì)蜂蜜中氯霉素進(jìn)行磁固相萃取。三批材料結(jié)果表明氯霉素在蜂蜜中濃度0.2 ng/g以上均顯示陽(yáng)性，表明材料具有較好的重現(xiàn)性。

2.2.4方法對(duì)不同基質(zhì)樣品分析的可行性為了擴(kuò)大試紙條的應(yīng)用范圍，本研究除了選用不同的蜂蜜樣品，也將磁固相萃取應(yīng)用于雞蛋基質(zhì)中。由表2可知，CAP在不同蜂蜜樣品中濃度高于0.2 ng/g時(shí)，均顯示陽(yáng)性，而且在雞蛋基質(zhì)中得到相同結(jié)果，表明該方法拓展了試紙條的應(yīng)用范圍，使其不僅可用于牛奶樣品，也可以用于蜂蜜和雞蛋等樣品。

表2 不同基質(zhì)中的氯霉素檢測(cè)結(jié)果(n=3)

+:positive result;nd:not detected.

圖3 (A)蜂蜜樣品和加標(biāo)蜂蜜樣品(0.2 ng/g)的色譜圖；(B)雞蛋樣品和加標(biāo)雞蛋樣品(0.2 ng/g)的色譜圖Fig.3 (A) Chromatograms of honey sample and spiked honey sample(0.2 ng/g);(B) Chromatograms egg sample and spiked egg sample(0.2 ng/g)

2.2.5方法的準(zhǔn)確性試驗(yàn)為了確認(rèn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，采用液-質(zhì)聯(lián)用對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè)。如圖3所示，在蜂蜜樣品和雞蛋樣品中均未檢測(cè)到CAP，而加標(biāo)樣品(0.2 ng/g)均檢測(cè)到CAP，結(jié)果與試紙條檢測(cè)結(jié)果一致，表明方法的準(zhǔn)確性好。

3 結(jié)論

本文結(jié)合磁固相萃取樣品前處理和快速篩查的試紙條檢測(cè)，建立了一種快速篩查氯霉素的方法。方法操作快速簡(jiǎn)單，用時(shí)約5 min，溶劑用量少，適用于氯霉素的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。該聯(lián)用方法擴(kuò)大了氯霉素試紙條的應(yīng)用范圍同時(shí)降低了檢測(cè)成本。磁固相萃取與試紙條檢測(cè)結(jié)合在現(xiàn)場(chǎng)快速篩查分析領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。