低溫條件對(duì)高效液相色譜手性拆分柱效和選擇性的影響

徐麗芳， 陳 怡， 陶建偉， 夏寅寅， 宋 巍， 許 旭*

(上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院,上海 201418)

高效液相色譜(HPLC)是手性分離分析的主要方法，目前有關(guān)HPLC手性拆分的研究比較多的集中在新消旋樣品的拆分方法、新拆分固定相研究與應(yīng)用、相互作用機(jī)理等方面[1]。對(duì)于一個(gè)新的手性樣品，盡快獲得簡(jiǎn)單有效的拆分方法仍然是需要研究的課題。

根據(jù)熱力學(xué)方程推導(dǎo)出的色譜手性拆分分離因子(α)與熱力學(xué)函數(shù)之間的關(guān)系式[2]，手性拆分可以分為焓驅(qū)動(dòng)與熵驅(qū)動(dòng)的分離，降低溫度有利于焓驅(qū)動(dòng)拆分，現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果也顯示，多數(shù)手性拆分實(shí)驗(yàn)在低溫條件下具有更好的手性選擇性[2 - 12]。但根據(jù)范氏方程，在HPLC的高流速條件下，柱效主要受傳質(zhì)阻力的影響，降低溫度會(huì)降低擴(kuò)散系數(shù)、降低柱效。Herbut等[13]和Li等[14]的實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了這點(diǎn)。這樣，低溫條件下手性分離的效果就受到選擇性和柱效兩方面的不同影響而可能出現(xiàn)不同的結(jié)果。在通常的HPLC柱溫下，Lipka等[8]發(fā)現(xiàn)其實(shí)驗(yàn)中分離度(RS)、選擇因子a和容量因子k′隨著溫度的降低而增大。我們[6]用手性冠醚柱拆分丙氨酸、正纈氨酸和犬尿氨酸時(shí)的實(shí)驗(yàn)也顯示，降低溫度有利于對(duì)映體的分離。

通常HPLC手性拆分實(shí)驗(yàn)的低溫實(shí)驗(yàn)多數(shù)在5 ℃以上，也有一些0 ℃到-6 ℃的報(bào)道[6，7]。最近，溫度對(duì)拆分的影響再度引起關(guān)注。Ilisz等[15 - 17]在-5 ℃到55 ℃的較寬溫度范圍內(nèi)研究了溫度對(duì)氨基酸類似物的手性選擇性的影響。Sabia等[18]用Whelk-O1手性柱在-66 ℃分離了藥物安定及其類似物的互變對(duì)映體。本文以消旋安息香為樣品，在低至-40 ℃的更寬溫度范圍考察了溫度對(duì)HPLC手性拆分時(shí)柱效、保留和選擇性的影響，為進(jìn)一步研究低溫條件下的手性拆分方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Waters高效液相色譜儀由515泵和2487紫外檢測(cè)器(美國，Waters公司)和英譜色譜工作站(杭州英譜公司)組成；DC-4006型節(jié)能型智能恒溫槽(寧波新芝生物科技有限公司)。

所用試劑均為國產(chǎn)分析純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 色譜條件

不同粒徑的色譜柱：柱1(Chiralcel OD，250×4.6 mm，10 μm)；柱2(Chiralcel OD-H，250×4.6 mm，5 μm)；柱3(Chiralcel OD-3，250×4.6 mm，3 μm)。流動(dòng)相為正己烷∶乙醇=70∶30(V/V)。流速根據(jù)柱壓大小分別選擇在0.05～1.2 mL/min之間。檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm。柱溫為：-40 ℃、-25 ℃、-10 ℃、5 ℃、20 ℃、35 ℃，控溫精度：±0.1 ℃。樣品為安息香(濃度0.3 mg/mL)，進(jìn)樣量均為20 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 柱溫對(duì)柱效的影響

根據(jù)10 μm、5 μm和3 μm粒徑Chiralcel OD柱分別拆分安息香樣品的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，用Oringe7.5軟件擬合van Deemter方程的曲線分別如圖1。隨著溫度的降低，高流速時(shí)的柱效明顯降低，實(shí)驗(yàn)中柱壓也逐漸增大。3 μm粒徑Chiralcel OD柱因?yàn)橹鶋狠^高，沒有進(jìn)行-40 ℃的實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同粒徑Chralcel OD手性柱在不同溫度下的流速u與塔板高度H關(guān)系曲線Fig.1 The van Deemter curves at different temperatures using Chiralcel OD columns with particle diameter of 10 μm (a),5 μm (b) and 3 μm (c)

根據(jù)擬合得到的數(shù)據(jù)，得不同粒徑色譜柱A、B和C項(xiàng)與溫度的關(guān)系圖如圖2所示。從圖2可以看出，隨著溫度的降低，系數(shù)A基本不變，理論上A項(xiàng)也應(yīng)是近似不變的值。對(duì)于系數(shù)B，實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果在-25 ℃以上時(shí)變化不大，各柱的實(shí)驗(yàn)值與變化趨勢(shì)均相近，但當(dāng)溫度降為-25 ℃以下時(shí)，兩柱B值的結(jié)果有差異，有待進(jìn)一步研究。對(duì)于系數(shù)C，實(shí)驗(yàn)得到的變化趨勢(shì)均是隨著溫度的逐漸降低，C值越來越大。與理論推測(cè)相符(降低溫度會(huì)減小擴(kuò)散系數(shù)，從而使C項(xiàng)系數(shù)增大)。

圖2 10 μm、5 μm、3 μm Chiralcel OD柱在不同溫度下A(a)、B(b)、C(c)三項(xiàng)與溫度(T)的關(guān)系圖Fig.2 The relationship between A(a),B(b),C(c) terms and temperature using 10 μm,5 μm,and 3 μm Chiralcel OD columns

2.2 柱溫對(duì)選擇性和容量因子的影響

表1 安息香在10 μm、5 μm和3 μm 粒徑Chiralcel OD柱分離時(shí)lgα -1/T與lgk′-1/T線性關(guān)系

2.3 柱溫對(duì)分離度的影響

比較消旋安息香在10 μm、5 μm和3 μm手性Chiralcel OD柱不同溫度、不同流速下的分離度RS，見圖3?？梢姡S著溫度的降低，三根手性柱的分離度呈現(xiàn)不同的變化。

圖3 使用不同粒徑Chiralcel OD柱分離時(shí)分離度(RS)與溫度(T)的關(guān)系曲線Fig.3 The relationship between resolution(RS) and column temperature (T) using 10 μm(a),5 μm(b),and 3 μm(c) Chiralcel OD column

2.4 討論

從熱力學(xué)的角度，降低溫度有利于大多數(shù)的焓驅(qū)動(dòng)拆分。這種低溫條件下的手性識(shí)別能力增強(qiáng)的現(xiàn)象，可能與固定相與手性分子在低溫下都更加趨于穩(wěn)定狀態(tài)且剛性增加、從而提高了手性固定相的識(shí)別能力有關(guān)。文獻(xiàn)[18]提供了一個(gè)特殊的例子。另一方面，即使在室溫下降低溫度會(huì)降低熵驅(qū)動(dòng)的分離選擇性，如果繼續(xù)降低溫度，只要分離機(jī)理不變，在兩組分出峰順序顛倒后也會(huì)出現(xiàn)選擇性提高的焓驅(qū)動(dòng)現(xiàn)象。因此可以推測(cè)，在足夠低的溫度條件下，可能絕大部分拆分都是焓驅(qū)動(dòng)的，即降低溫度選擇性提高。這可能為我們改進(jìn)色譜手性拆分方法提供思路。

根據(jù)van Deemter方程，低溫會(huì)降低柱效，這可能是影響低溫條件下手性拆分效果(分離度)的主要問題。實(shí)驗(yàn)顯示，在0.5～3 cm/min的低流速條件下降低溫度對(duì)柱效的影響比高流速時(shí)小很多。這為改善柱效提供了一條思路。

3 結(jié)論

根據(jù)安息香在較寬的溫度范圍內(nèi)不同柱溫下(-40 ℃～35 ℃)的色譜保留和拆分的結(jié)果，得到了高效液相色譜在低溫條件下的理論塔板高度H與流速u的H-u曲線，對(duì)范式方程擬合得到的A、B、C三項(xiàng)系數(shù)考察了它們與溫度的關(guān)系，顯示隨著溫度降低系數(shù)A變化不大，系數(shù)C隨著溫度降低逐漸升高，與理論相符。而B項(xiàng)在低溫的情況則有待進(jìn)一步研究。

隨著溫度的降低，手性選擇性提高。1gk′和1gα對(duì)1/T均有良好的線性關(guān)系，表明保留機(jī)理在溫度的變化過程中沒有發(fā)生變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示進(jìn)一步降低溫度可能獲得更好的選擇性，但要獲得好的分離度還需改善柱效。

致謝:大賽璐藥物手性技術(shù)(上海)有限公司提供了本實(shí)驗(yàn)所用的手性色譜柱。