柱前衍生-高效液相色譜法測定蔬菜中甲醛含量

鄧立剛，李增梅，谷曉紅，趙善倉，苑學(xué)霞，王 磊，張樹秋

(山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，山東省食品質(zhì)量與安全檢測技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室,山東濟(jì)南 250100)

甲醛為較高毒性的物質(zhì)，在我國有毒化學(xué)品優(yōu)先控制名單上居第二位[1,2]?，F(xiàn)已發(fā)布的《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》(GB 2760-2014)沒有將甲醛列為食品添加劑，因此不能用于食品和農(nóng)產(chǎn)品中。目前國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)文獻(xiàn)均未發(fā)現(xiàn)蔬菜中甲醛含量測定的分析方法。因此，為完善蔬菜質(zhì)量監(jiān)測手段，確保農(nóng)產(chǎn)品安全，建立蔬菜中甲醛含量測定的方法勢在必行。

目前，甲醛的分析方法主要有分光光度法、色譜法等[3 - 8]。分光光度法盡管設(shè)備價廉、操作簡單，但因易受樣品中基質(zhì)干擾，易造成假陽性。高效液相色譜法具有靈敏高、準(zhǔn)確度好，分析時間短的優(yōu)點(diǎn)[9,10]，但蔬菜樣品多富含色素且基質(zhì)復(fù)雜，不利于色譜分離和色譜柱的保護(hù)。本方法以蔬菜為主要研究對象，以蔬菜中游離態(tài)的甲醛為目標(biāo)化合物，通過實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化，建立了蔬菜中甲醛含量的高效液相色譜(HPLC)測定方法。該方法簡單、精密度和準(zhǔn)確度良好，適用于蔬菜中甲醛含量的檢測。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Waters E2695高效液相色譜儀(美國，Waters公司)，配二極管陣列檢測器(DDA)和Empower 3工作站；Mili-Q Advantage A10超純水系統(tǒng)(美國，Milipore公司)；KQ-500E超聲波(昆山市超生儀器有限公司)；Laborata 4000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國，Heidolph公司)；MS3渦旋振蕩器(德國，IKA公司)。

甲醛標(biāo)準(zhǔn)儲備液(100 μg/mL，環(huán)境保護(hù)部標(biāo)準(zhǔn)樣品研究所)；乙腈、二氯甲烷(色譜純，美國Fisher公司)；鄰苯二甲酸氫鉀(優(yōu)級純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；2,4-二硝基苯肼(DNPH)(純度≥99.0%，德國Sigma公司)。0.01 mol/L鄰苯二甲酸氫鉀溶液：稱取2.04 g鄰苯二甲酸氫鉀，用水溶解并定容至1 000 mL;0.4 g/L DNPH衍生液：稱取2,4-二硝基苯肼0.040 g,加入乙腈溶解，并定容至100 mL。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 樣品處理

1.2.1樣品提取稱取約5 g試樣(精確至0.01 g)，置于50 mL容量瓶中，加入40 mL超純水，超聲提取30 min后取出，冷卻，加超純水至刻度，搖勻，用濾紙過濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液備用。

1.2.2衍生移取5 mL濾液置于50 mL具塞離心管中，依次加入10 mL鄰苯二甲酸氫鉀溶液和5 mL DNPH衍生液，渦旋振蕩混勻，50 ℃±5 ℃恒溫培養(yǎng)箱反應(yīng)60 min，取出冷卻至室溫。

1.2.3萃取凈化將衍生反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至150 mL分液漏斗中，加入20 mL二氯甲烷，振蕩萃取，靜置分層后收集下層有機(jī)相，再加入15 mL二氯甲烷，重復(fù)提取2次，合并有機(jī)相于150 mL圓底燒瓶中，40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約2 mL，轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，用少量乙腈洗滌圓底燒瓶，合并到5 mL容量瓶中并定容，混勻后過0.22 μm有機(jī)相微孔濾膜，濾液供HPLC測定。

1.3 色譜質(zhì)譜條件

色譜柱：Waters Sunfire C18色譜柱(250×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-水(1∶1,V/V)；流速：1.0 mL/min；檢測波長：355 nm；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：40 ℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的確定

2.1.1檢測波長的確定甲醛在酸性環(huán)境條件下能夠與2,4-二硝基苯肼衍生生成2,4-二硝基苯腙，使用二極管陣列檢測器對2,4-二硝基苯腙進(jìn)行了200～500 nm波長區(qū)間的掃描，該化合物在355 nm處有最大吸收。因此實(shí)驗(yàn)選擇355 nm為檢測波長。

2.1.2流動相條件的選擇衍生物2,4-二硝基苯腙為非極性化合物，由于甲醇和水比例接近1∶1時，混合溶液粘度大，色譜柱柱壓高，為降低柱壓，延長色譜柱使用壽命，故選擇乙腈和水作為流動相。探討了流動相的比例對分離度的影響，乙腈和水體積比例分別選用了60∶40、50∶50、45∶55。實(shí)驗(yàn)表明，乙腈和水的比例為50∶50，甲醛衍生物峰分離度最好，見圖1。

2.2 2,4-二硝基苯肼(DNPH)衍生液濃度的確定

取100 μg/mL的甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL，依次加入4.9 mL水和10 mL 0.01 mol/L鄰苯二甲酸氫鉀溶液，再分別加入0.04～2.0 mg/mL DNPH衍生液各5 mL，同時做空白對照，衍生溫度和時間分別為50 ℃、60 min，上機(jī)測定。結(jié)果表明，當(dāng)DNPH衍生液濃度為0.2～2.0 mg/mL時，甲醛衍生物的峰面積趨于穩(wěn)定且達(dá)到峰值，見圖2-a。結(jié)合樣品間差異及降低2,4-二硝基苯肼對色譜柱的污染等方面的綜合考慮，確定衍生液DNPH濃度為0.4 mg/mL。

2.3 衍生pH 條件的確定

使用稀HCl和NaOH溶液調(diào)節(jié)0.01 mol/L鄰苯二甲酸氫鉀溶液的pH值分別為2、3、4、5、6、7，各取10 mL，依次加入100 μL 100 μg/mL甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液、4.9 mL水和5 mL 0.4 mg/mL DNPH衍生液，同時做空白對照，衍生溫度和時間分別為50 ℃、60 min，上機(jī)測定。結(jié)果表明，當(dāng)0.01 mol/L鄰苯二甲酸氫鉀溶液的pH范圍為2～5時，甲醛衍生物峰面積趨于穩(wěn)定，且在pH=4～5間峰值最高，見圖2-b。新配制的0.01 mol/L鄰苯二甲酸氫鉀溶液的pH在4.3～5.0范圍內(nèi)，符合甲醛衍生所需的pH環(huán)境。

2.4 衍生溫度的探討

取100 μg/mL甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL，依次加入4.9 mL水、10 mL 0.01mol/L鄰苯二甲酸氫鉀溶液和5 mL 0.4 mg/mL DNPH衍生液，衍生溫度分別設(shè)為30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃，衍生時間均為60 min,上機(jī)測定。結(jié)果見圖2-c，當(dāng)衍生溫度為50 ℃時，甲醛衍生物峰面積為最高值。因此，確定該實(shí)驗(yàn)衍生溫度為50 ℃。

2.5 衍生時間的確定

取100 μg/mL甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL，依次加入4.9 mL水、10 mL 0.01 mol/L鄰苯二甲酸氫鉀溶液和5 mL 0.4 mg/mL DNPH衍生液，衍生溫度50 ℃，衍生時間分別為10、20、30、40、50、60、70、80、90 min，反應(yīng)液過0.22 μm微孔濾膜，上機(jī)測定。見圖2-d，當(dāng)衍生時間為50～90 min時，甲醛衍生物峰面積趨于穩(wěn)定。考慮到衍生物生成量的穩(wěn)定性，本方法選擇的實(shí)驗(yàn)衍生時間為60 min。

2.6 線性方程

分別移取0、5 μL、10 μL、25 μL、50 μL、100 μL甲醛標(biāo)準(zhǔn)儲備液(相當(dāng)于0、0.5 μg、1.0 μg、2.5 μg、5.0 μg、10.0 μg)各置于50 mL具塞離心管中，加入5 mL水，其它步驟同1.2，得到甲醛的濃度分別為0、0.1、0.2 、0.5 、1.0、2.0 mg/L系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。分別注入高效液相色譜儀中，以測定相應(yīng)的峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度(X)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在0～2 μg/mL濃度范圍內(nèi)獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線為:Y=355787X+33060，相關(guān)系數(shù)r為0.9989，線性關(guān)系良好。

2.7 方法的回收率、精密度和靈敏度

方法的準(zhǔn)確度和精密度通過回收率試驗(yàn)進(jìn)行考察。在白菜、芹菜、山藥、洋蔥、韭菜、青椒中分別添加甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加量分別為2.0、5.0、10.0 mg/kg，每個濃度做5個平行。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。添加平均回收率在78.1%～114.2%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.8%～9.5%。以信噪比(S/N)≥3計(jì)算檢出限，該方法的檢出限為 1 mg/kg，方法的線性范圍為1.0～20.0 mg/kg。

表1 不同蔬菜中甲醛添加回收率(n=5)

2.8 實(shí)際樣品的測定

按照本方法對10份白菜樣品、5份香菇樣品進(jìn)行測定，10份白菜均未檢出甲醛，而3份鮮香菇均檢出，含量平均為30.5 mg/kg，這與文獻(xiàn)報(bào)道[11]基本一致，甲醛來源于其自身生理代謝。

3 結(jié)論

本文以水為提取劑，以2,4-二硝基苯肼為衍生劑，采用二氯甲烷萃取凈化、濃縮，建立了高效液相色譜法測定蔬菜中的甲醛的分析方法。該方法簡單、準(zhǔn)確、易操作，適用于蔬菜中甲醛含量的測定。