L-半胱氨酸/納米金/DNA/殼聚糖修飾金電極測定布洛芬

李 玲，王 娟，劉計(jì)敏，張 燕，鄭 晶，郭滿棟

(山西師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院,山西臨汾 041004)

布洛芬(Ibuprofen)化學(xué)名為2-甲基-4-(2-甲基丙基)苯乙酸，它是一種非甾酮類藥物，具有抗炎、鎮(zhèn)痛及解熱作用，可用于治療牙疼、小兒發(fā)熱頭疼等癥狀，其對(duì)小兒退熱效果比同類藥物更好更快更安全，常用于兒童退熱首選藥[1]。因此，對(duì)布洛芬的準(zhǔn)確測定對(duì)于相關(guān)藥物的質(zhì)量控制起著十分重要的作用[2]。常用于測定布洛芬的分析方法有高效液相色譜法[3]、液-質(zhì)聯(lián)用法[4]、氣-質(zhì)聯(lián)用法[5]、紫外-可見分光光度法[6]、電化學(xué)方法[7]。其中，電化學(xué)方法具有操作簡便，成本低、靈敏度高、重現(xiàn)性好、具有良好的選擇性等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用[8,9]。

貴金屬納米材料如納米金、納米銀、納米鉑等納米粒子具有一些共同的性質(zhì)，如高的比表面積、強(qiáng)的吸附能力、良好的導(dǎo)電能力以及特殊的光學(xué)性質(zhì)，作為修飾材料廣泛應(yīng)用于化學(xué)修飾電極,并常用作催化劑[10]。特別是Au納米材料在生物領(lǐng)域不但可以固定蛋白質(zhì)還能保證其電化學(xué)活性[11]，這一優(yōu)良特性廣泛應(yīng)用于電化學(xué)生物傳感器[12]和電化學(xué)分析[13]。DNA是生命物遺傳的基本物質(zhì)，其具有大量的磷酸骨架，可以增加納米金結(jié)合位點(diǎn)而被引入到電化學(xué)檢測領(lǐng)域。核酸功能化的金納米顆粒也逐漸成為了一種新穎的電化學(xué)信號(hào)放大裝置，此類修飾電極具有快速、高效、靈敏、無污染、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)。例如DNA電化學(xué)生物傳感器可用于測定各類能與DNA相作用的藥物如：抗生素、抗病毒、抗腫瘤抗癌等藥物[14,15]。

本文采用了電聚合方法和簡便快捷的滴涂法，先將L-半胱氨酸電聚合在裸金電極表面，再將納米金、DNA、殼聚糖混合液滴涂在L-半胱氨酸聚合后的金電極表面上，制備了一種新型的L-半胱氨酸/納米金/DNA/殼聚糖(L-Cys/Au colloid/DNA/CS/Au/CME)化學(xué)修飾電極，此修飾電極具有成本低，制備簡單，靈敏度高，穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好等特點(diǎn)。實(shí)現(xiàn)了對(duì)布洛芬快速、準(zhǔn)確的測定，并研究了布洛芬在該修飾電極上的電化學(xué)行為。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

LK2005A型電化學(xué)工作站(天津市蘭力科化學(xué)電子高技術(shù)有限公司)，電化學(xué)實(shí)驗(yàn)采用三電極體系：Ag/AgCl(飽和KCl)電極為參比電極；鉑絲電極為輔助電極；裸金電極(d=2 mm)和修飾金電極為工作電極。雷磁PXSJ-216型離子計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；微型進(jìn)樣器(上海醫(yī)學(xué)激光儀器廠)；電子天平(北京賽多利新型儀器系統(tǒng)有限公司)；JB-2定時(shí)雙向磁力加熱攪拌器(江蘇金壇市金城國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠)；KQ-250B超聲波清洗器(昆山市超聲波儀器制造廠)。

K3[Fe(CN)6](天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司)，配制濃度為2.5×10-3mol/L。FeCl3(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，配制濃度為2.5×10-3mol/L。K4[Fe(CN)6](天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)，配制濃度為2.5×10-3mol/L 。HAuCl4·4H2O、DNA、L-半胱氨酸均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，儲(chǔ)備液均為1.5×10-3mol/L，布洛芬(IB，博美生物技術(shù)有限公司)，儲(chǔ)備液濃度為1.0×10-3mol/L。其余實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水；所有電分析實(shí)驗(yàn)均在室溫下進(jìn)行。

1.2 L-Cys/Au colloid/DNA/CS/Au/CME的制備過程

1.2.1裸金電極的預(yù)處理將裸金電極(d=2 mm)用鹿茸皮打磨拋光，依次用水、HNO3(1+1)、無水乙醇、水各超聲5 min。然后將電極置于0.5 mol/L的H2SO4中用循環(huán)伏安法(電位區(qū)間：-0.2～1.6 V，掃速：0.1 V/s)掃描10圈進(jìn)行活化。然后用水沖洗干凈，高純氮?dú)獯蹈蓚溆谩?/p>

1.2.2Aucolloid的制備納米金溶膠的制備[16]:準(zhǔn)確稱取0.0160 g HAuCl4·4H2O于50 mL的燒杯溶解，用加熱攪拌器快速攪拌并將溶液加熱至沸騰，接著迅速向其中滴加6滴1%的檸檬酸鈉溶液，2 min后再連續(xù)滴加至2.0 mL，繼續(xù)加熱攪拌。當(dāng)溶液沸騰5 min以后，關(guān)掉加熱檔，余溫加熱，繼續(xù)攪拌20 min后，放在室溫下冷卻后出現(xiàn)酒紅色溶液，即為納米金膠體，置于冰箱4 ℃避光保存。

1.2.3殼聚糖(CS)儲(chǔ)備液的制備將4 mg CS溶于0.2 mL冰乙酸，稀釋至1 mL，超聲至完全溶解，置于冰箱4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4L-Cys/Aucolloid/DNA/CS/Au/CME的制備將經(jīng)預(yù)處理后的裸金電極浸入到盛有10 mL L-Cys溶液(1.0×10-3mol/L)的電解池中，進(jìn)行循環(huán)伏安法掃描(電位區(qū)間：-0.2～1.6 V，掃速：0.01 V/s，掃描次數(shù)：10次)，使L-Cys沉積在裸金電極表面，在室溫下避光、晾干24 h后使用。于新配制的CS溶液中加入200.0 μL新制備的納米金溶膠，之后加入300.0 μL 0.0004 g/mL的DNA儲(chǔ)備液，繼續(xù)超聲至三者混合均勻。用微型進(jìn)樣器將5.0 μL混合液滴涂在L-Cys修飾的金電極上，在室溫下避光、晾干24 h后使用。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)采用三電極系統(tǒng)，室溫下以Ag/AgCl(飽和KCl)電極為參比電極，鉑絲電極為輔助電極，修飾電極和裸金電極為工作電極。以pH=7.35的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)為底液，對(duì)布洛芬進(jìn)行循環(huán)伏安和差分脈沖伏安測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 L-Cys/Au colloid/DNA/CS/Au/CME的電化學(xué)表征

用循環(huán)伏安法在掃速為0.1 V/s的條件下，以[Fe(CN)6]3-/4-作為分子探針對(duì)修飾過程中電極表面的變化進(jìn)行表征。圖1是裸金電極與各種修飾電極在含2.5×10-3mol/L [Fe(CN)6]3-/4-液溶中的循環(huán)伏安圖。裸金電極在[Fe(CN)6]3-/4-溶液中出現(xiàn)一對(duì)較弱的氧化還原峰(曲線a)。當(dāng)在裸金電極表面電聚合一層L-Cys薄膜后(曲線c)，氧化峰電流和還原峰電流均明顯增大，峰間距縮小。當(dāng)在L-Cys修飾電極表面滴涂CS薄膜后(曲線b)，由于CS薄膜較厚并且導(dǎo)電能力差使得氧化峰電流和還原峰電流均有所降低，將Au colloid、CS混合物滴涂于L-Cys修飾電極表面后(曲線d)，納米金粒子增大了電極的比表面積，促進(jìn)了電子在電極表面的傳遞速度,氧化峰電流和還原峰電流均明顯增大。將DNA、Au colloid、CS混合物滴涂于L-Cys修飾的電極表面后(曲線e)，由于DNA的磷酸骨架增加了納米金的結(jié)合位點(diǎn)，加快了電子的傳遞速度，使得氧化峰電流和還原峰電流均明顯增大，峰間距縮小。

2.2 布洛芬的循環(huán)伏安研究

圖2中a、b分別為裸金電極和L-Cys/Au colloid/DNA/CS/Au/CME在PBS中的循環(huán)伏安圖，由圖可知L-Cys/Au colloid/DNA/CS/Au/CME在PBS(b)中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描時(shí)，在0.3879 V處出現(xiàn)一個(gè)靈敏的還原峰ip=56.4493 μA，在0.9980 V處有一個(gè)不太靈敏的氧化峰ip=-14.0964 μA，當(dāng)把修飾電極置于含1.0×10-6mol/L布洛芬的pH=7.35的PBS(c)中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描時(shí)，在0.4560 V處出現(xiàn)還原峰，峰電流明顯下降(ip=34.7889 μA)，峰位置發(fā)生偏移，在1.1320 V處出現(xiàn)不太靈敏的氧化峰(ip=-13.1025 μA)。可知布洛芬在L-Cys/Au colloid/DNA/CS/Au/CME上的反應(yīng)為不可逆反應(yīng)。在加入布洛芬后還原峰和氧化峰電流均降低，峰形未發(fā)生變化，說明布洛芬的加入抑制了電極的活性，使得電極表面?zhèn)鲗?dǎo)電子的能力降低，從而峰電流降低。

2.3 L-Cys/Au colloid/DNA/CS/Au/CME測定條件的優(yōu)化

2.3.1緩沖溶液的選擇實(shí)驗(yàn)分別在PBS(pH=6.3)、HAc-NaAc(pH=3.98)、KH2PO4-硼砂(pH=7.35)、硼砂-NaOH(pH=11.2)、檸檬酸-檸檬酸鈉(pH=7.5)等緩沖溶液中，用循環(huán)伏安法考察布洛芬在L-Cys/Au colloid/DNA/CS/Au/CME上的電化學(xué)行為。結(jié)果表明，選用PBS，背景電流顯著減小，電子轉(zhuǎn)移速度加快，峰形尖銳且峰電流高。

2.3.2pH的選擇配制一系列不同pH 值(5.43、6.73、7.35、7.89、8.15)的PBS，分別測定布洛芬(1.0×10-6mol/L)在L-Cys/Au colloid/DNA/CS/Au/CME上的循環(huán)伏安曲線(圖3)，B、C曲線分別為pH對(duì)還原峰和氧化峰的影響。當(dāng)pH≤7.35時(shí)，還原峰和氧化峰電流隨著pH值增加而增加；當(dāng)pH>7.35時(shí)，隨著pH的增加還原峰和氧化峰電流反而減小。在pH=7.35的PBS中峰電流最大且峰形最好。因此實(shí)驗(yàn)選擇pH=7.35的PBS 緩沖溶液作為底液。

圖4為還原峰電位E與pH值的關(guān)系圖，圖中還原峰電位E與pH值呈線性關(guān)系，且隨著pH的增大還原峰電位負(fù)移，表明該電極反應(yīng)有質(zhì)子參與。其線性回歸方程為：E(V)=-0.08112pH+1.0017(相關(guān)系數(shù)R2=0.9920)。根據(jù)線性回歸方程可知，斜率為-0.08112，將其代入公式dEp/dpH=0.0592x/n(x為質(zhì)子數(shù)，n為電子數(shù))中，可求得x(P1)=1.3，即轉(zhuǎn)移的質(zhì)子數(shù)為1個(gè)。

2.3.3掃描速率的影響在選定的實(shí)驗(yàn)條件下，改變掃描速率(50、100、150、200、250 mV/s)，結(jié)果表明隨著掃描速率的增加，還原峰電流IP也逐漸增加，還原峰電位EP發(fā)生負(fù)移。在掃速50～250 mV/s范圍內(nèi)，還原峰電流IP與掃速v成正比，掃速和峰電流呈線性關(guān)系，其線性回歸方程為：IP=310.3v(V/s)+30.95(相關(guān)系數(shù)R2=0.9861)，說明布洛芬在L-Cys/Au colloid/DNA/CS/Au/CME上是受表面吸附控制的反應(yīng)過程。

在50～250 mV/s范圍內(nèi)，還原峰電位EP隨著掃描速率對(duì)數(shù)值的增加而增加，且二者呈良好的線性關(guān)系，EP-logv的線性方程為：EP(V)=-0.5115logv+0.3388(相關(guān)系數(shù)R2=0.9810)。根據(jù)線性方程可知，直線斜率為-0.5115，截距為0.3388。由其直線斜率為[0.5×2.303RT×(anF)-1],可得an=0.59,由于0

2.4 L-Cys/Au colloid/DNA/CS/Au/CME的響應(yīng)性能

2.4.1線性范圍和檢出限配制了一系列不同濃度的布洛芬標(biāo)準(zhǔn)溶液，在0.6～1.4 V范圍內(nèi)，掃速為100 mV/s條件下在PBS中采用差分脈沖伏安法對(duì)其電化學(xué)響應(yīng)進(jìn)行測定。如圖5所示，隨著布洛芬濃度的不斷增大，電子轉(zhuǎn)移越困難，氧化峰電流下降記作I。將制備的L-Cys/Au colloid/DNA/Au/CME置于PBS中氧化峰電流為I0,△I=I0-I,實(shí)驗(yàn)表明布洛芬的峰電流變化值△I與其濃度在1.0×10-7～1.0×10-4mol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程如下：I=-51.56logc+5.594(R2=0.9732)，檢出限(S/N=3)可達(dá)2.3×10-8mol/L，說明該方法靈敏度較高。

2.4.2共存離子的干擾在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，用L-Cys/Au colloid/DNA/CS/Au/CME測定1.0×10-6mol/L的布洛芬，100倍的尿嘧啶、尿酸、β-環(huán)糊精、抗壞血酸、葡萄糖、鳥嘌呤、L-半胱氨酸，50倍的葡萄糖、巴比妥、腎上腺素、多巴胺時(shí),30倍的Fe3 +、Ca2 +、Al3 +、Cu2 +、Mg2 +、Zn2 +、Mn2 +對(duì)布洛芬的電化學(xué)響應(yīng)干擾很小，此時(shí)布洛芬的最大峰電流變化值平均為1.9%，結(jié)果表明這些物質(zhì)不干擾布洛芬的測定。

2.4.3重現(xiàn)性和穩(wěn)定性新制備7根L-Cys/Au colloid/DNA/CS/Au/CME，在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，分別對(duì)同濃度的布洛芬測定3次，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.31%，室溫保存一星期后，用同一根電極對(duì)布洛芬進(jìn)行測定，電流響應(yīng)基本保持不變，說明該修飾電極很穩(wěn)定并且重現(xiàn)性良好。

2.5 樣品分析

取布洛芬(合肥博美生物科技有限責(zé)任公司，標(biāo)準(zhǔn)量：25 克/瓶，純度≥99%)，用水配制濃度為1.0×10-5mol/L溶液。然后用其與緩沖溶液配制一系列的標(biāo)準(zhǔn)溶液，測其峰電流，制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。最后在中間的標(biāo)準(zhǔn)溶液中分別加入不同體積的布洛芬溶液，測其峰電流，利用工作曲線法得其濃度，求得樣品的回收率。結(jié)果見表1。

表1 樣品測定及回收率

3 結(jié)論

本文采用電聚合和滴涂的方法制得了L-Cys/Au colloid/DNA/CS/Au/CME，并用循環(huán)伏安法表征各種修飾電極在修飾過程中的變化。研究了布洛芬在該修飾電極上的電化學(xué)行為，結(jié)果表明在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，該修飾電極對(duì)布洛芬有明顯的響應(yīng)，檢出限(S/N=3)達(dá)2.3×10-8mol/L。方法用于實(shí)際樣品中布洛芬的測定，其回收率范圍在96.73%～103.54%。