高效液相色譜-熒光法同時測定人體尿液中的酪氨酸和色氨酸

楊永麗，崔盼盼，譚 婷，劉 翻，郭 嵐，萬益群*，

(1.南昌大學(xué)化學(xué)學(xué)院，江西南昌 330031；2.南昌大學(xué)分析測試中心，江西南昌 330047)

氨基酸在人體新陳代謝過程中起著重要的作用，是人體健康狀況的重要參數(shù)。酪氨酸(Tyr )和色氨酸(Typ)是兩種人體必不可少的氨基酸，它們是合成許多神經(jīng)遞質(zhì)及其它多種重要化合物的前體物質(zhì)，其代謝狀況對人體有重要的病理及生理意義[1 - 4]。定量分析人體體液或組織中Tyr和Typ的含量不僅在蛋白質(zhì)化學(xué)及評價食物營養(yǎng)價值方面意義重大，而且在多種疾病的基礎(chǔ)研究和診斷治療方面有重要的作用。目前，分離檢測氨基酸含量的方法主要包括：離子交換色譜法[5,6]、衍生化氣相色譜法[7,8]、毛細管電泳法[9 - 11]和柱前衍生-反相高效液相色譜法[12 - 15]等。在上述方法中，高效液相色譜法的樣品前處理較為簡單、靈敏度高、特異性好且能同時測定幾種氨基酸，臨床應(yīng)用較為廣泛?，F(xiàn)有文獻所報道的有關(guān)血清中Tyr和Typ分析研究的報道較多，但對人體尿液中Tyr和Typ含量同時測定的報道相對較少。

本文根據(jù)Tyr和Typ具有較強的自然熒光的特性，建立了高效液相色譜-熒光檢測法測定健康人、普通病人及癌癥患者尿樣中Tyr和Typ的含量，取得了較為滿意的結(jié)果。該方法操作簡單，樣品分析時間短，滿足實際尿液分析要求，可為癌癥的臨床進一步研究提供一種新的技術(shù)手段。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1100高效液相色譜儀(美國,Agilent公司)，配有熒光檢測器；Ohaus A P210電子分析天平(精確到0.01 mg)；KQ-50DB型數(shù)控超聲波清洗器(江蘇昆山市超聲儀器有限公司)；TDL-5-A 型低速臺式離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)；Millipore-Q Gradient 超純水裝置(美國，Millipore公司)。

酪氨酸(Tyr)和色氨酸(Typ)標(biāo)準(zhǔn)品均購自于美國Sigma公司。分別準(zhǔn)確稱取適量的Tyr和Typ標(biāo)準(zhǔn)品，置于2個25 mL的棕色容量瓶中，加入數(shù)滴1.0 mol/L NaOH溶液溶解，并用超純水稀釋至刻度，搖勻，配成100.0 μg/mL Tyr和127.0 μg/mL Typ的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，置于冰箱內(nèi)4 ℃保存，使用時配成所需要的濃度。甲醇、乙腈為色譜純；其它試劑均為分析純。實驗用水為超純水。

1.2 色譜分析條件

色譜柱：Diamonsil C18柱(250×4.6 mm，5 μm)；柱溫為室溫；流動相：水-乙腈(80∶20,V/V)；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL；熒光檢測波長：λex=260 nm、λex=340 nm。

1.3 樣品采集及前處理

健康人尿樣由南昌大學(xué)志愿者提供；普通病人尿樣由江西省中醫(yī)院提供；癌癥病人尿樣由南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供。取供試者的晨尿2.0 mL左右，置于5 mL的塑料離心管中，然后以6 000 r/min離心10 min，取上清液過0.45 μm水相濾膜。取濾液1.0 mL定容于5 mL容量瓶中，進行色譜分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動相的組成及流速的選擇

分別采用甲醇-水、乙腈-水、乙腈-磷酸鹽緩沖溶液(pH=6.56、7.0、7.43)作為流動相，考察了不同配比和流速下流動相對Tyr和Typ液相色譜分離行為的影響。結(jié)果表明：甲醇-水體系作流動相時，Tyr和Typ的分離度高，但兩者保留時間顯著延長；乙腈-磷酸鹽緩沖液(pH=6.56、7.0、7.43)體系作流動相時，色譜峰保留時間有所縮短，但尿樣中的雜質(zhì)對測定產(chǎn)生一定干擾；當(dāng)以乙腈-水=20∶80為流動相，流速為1.0 mL/min，熒光檢測波長為λex=260 nm、λem=340 nm時，Tyr和Typ的色譜分離效果較好，具有較高的信號響應(yīng)和合適的分析時間。因此，確定乙腈-水為流動相體系。Tyr和Typ色譜圖見圖1。

2.2 樣品前處理方法的選擇

人體尿液成分復(fù)雜，必須除去干擾Tyr和Typ檢測的雜質(zhì)，以保證分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。本文分別考察了以下三種尿樣前處理方法：(1)取晨尿2.0 mL置于5 mL的塑料離心管中，以6 000 r/min離心10 min，取上清液過0.45 μm的水相濾膜。取濾液1.0 mL定容于5 mL容量瓶中，進行色譜分析。(2) 將采集的晨尿按體積比為10∶1的比例加入HCl，避光放置10 min，常溫下以5 000 r/min離心5 min。取上清液6.0 mL，加入2.0 mL的30 g/L三氯乙酸充分混勻，以6 000 r/min離心10 min，取上清液1.34 mL，加入1.0 mL的堿中和，加水至5 mL后過0.45 μm的水相濾膜，進行色譜分析。(3)取晨尿1.0 mL置于5 mL的塑料離心管中，加2.0 mL乙腈，以6 000 r/min離心10 min，靜置15 min，過0.45 μm的水相濾膜，定容至5 mL容量瓶中，進行色譜分析。

將空白尿樣和添加Tyr和Typ標(biāo)準(zhǔn)溶液的尿樣按上述三種方法處理，在已選定的色譜條件下進行分析，每個水平重復(fù)實驗3次。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：三種方法的平均回收率在83.7%～120.2%之間，均可滿足實際樣品的分析要求。但采用方法(3)處理測得的Tyr和Typ峰面積響應(yīng)值均較低，這可能是由于采用乙腈作沉淀劑導(dǎo)致Tyr和Typ與蛋白質(zhì)共沉淀；采用方法(2)測定的酪氨酸峰面積響應(yīng)值較低，色氨酸的峰形較差且方法較為繁瑣；而方法(1)操作簡便，且Tyr和Typ的熒光響應(yīng)強度較高，所以本實驗采用方法(1)對尿樣進行前處理。

2.3 干擾試驗

實驗考察了尿樣中主要共存的無機物和有機物對1.0 μg/mL Tyr及Typ分析的影響。當(dāng)相對誤差在±5%范圍內(nèi)，共存物質(zhì)的允許量(μg/mL)為：Mg2+(30)，Ca2+(20)，Cu2+(0.1)，F(xiàn)e3+(0.40)，Mn2+(0.75)，Zn2+(10)，尿素(1 500)，尿酸(15.1)，葡萄糖、果糖、乳糖(108)，肌酸(50)，肌酐(100)，尿卟啉(5.0)，糞卟啉(6.0)，5-羥色胺(4.0)，5-羥吲哚乙酸(5.0)，苯丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蘇氨酸、組氨酸、賴氨酸、精氨酸、絲氨酸、脯氨酸(160)，膽紅素(5.0)。可見尿樣中上述共存物質(zhì)基本不會影響Tyr和Typ的測定。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢測限

取適量的Tyr和Typ標(biāo)準(zhǔn)儲備液，配制成系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在選定的色譜條件下進行測定，以峰面積對濃度作圖。Tyr和Typ的含量分別在0.10～6.0 μg/mL及0.05～6.0 μg/mL范圍內(nèi)與色譜峰面積呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程分別為:y=12.219x+0.6694(r=0.9991)和y=83.612x+6.7351(r=0.9993)，以三倍信噪比計算，Tyr和Typ檢測限分別是0.05 μg/mL和0.02 μg/mL。

2.5 回收率與精密度試驗

取健康人和癌癥患者尿樣進行加標(biāo)回收實驗。分別添加三個不同水平的Tyr和Typ標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個水平測定5次，結(jié)果見表1及表2。兩種氨基酸的平均回收率在86.3%～122.3%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)值小于8.51%，該方法可以滿足實際樣品的分析要求。

表1 健康人尿樣加標(biāo)回收率(n=5)

表2 癌癥病人尿樣加標(biāo)回收率(n=5)

2.6 尿樣分析

分別取一定量的健康人、普通病人和癌癥患者的晨尿，按選定的樣品前處理方法和色譜分析條件進行檢測，每個尿樣平行測定6次，尿樣分析結(jié)果見表3。由表3可知：Tyr的水平在健康人、普通病人和癌癥患者尿樣中沒有明顯差異；Typ在健康人尿樣中含量為4.774±0.093～30.532±0.061μg/mL，普通病人尿樣中含量為8.122±0.486～27.504±0.298μg/mL；而癌癥患者尿樣中Typ水平各不相同，其中胃癌、皮膚癌、肺癌、乳腺癌和食管癌患者尿樣中Typ的含量與健康人和普通病人相比總體偏低，其含量范圍為2.188±0.071～5.289±0.998μg/mL，其他類型的癌癥患者Typ的含量沒有明顯差異，這說明不同類型的癌癥，Typ的代謝情況也會不同。

表3 尿樣分析結(jié)果(n=6)

(續(xù)表3)

3 結(jié)論

本文建立了高效液相色譜-熒光檢測法測定人體尿樣中Tyr和Typ的分析方法，該方法樣品前處理簡便，應(yīng)用于健康人、普通病人及癌癥患者尿樣分析，取得了較好效果。從樣品分析結(jié)果可知，不同類型癌癥患者尿樣中Typ的水平會有差異，其中胃癌、皮膚癌、肺癌、乳腺癌和食管癌患者尿樣中Typ的含量與健康人和普通病人相比總體偏低，Typ有可能是這些癌癥的特異性標(biāo)志物，有關(guān)這方面的研究將進一步報道。