小球藻生長及關(guān)鍵營養(yǎng)元素代謝規(guī)律的研究

紀(jì)旭艷 李榮貴 郭欣 黃青山

摘要[目的]探索小球藻生長過程中關(guān)鍵營養(yǎng)元素代謝的基本規(guī)律，優(yōu)化小球藻大規(guī)模培養(yǎng)工藝。[方法]以新型、高效的平板氣升環(huán)流式光生物反應(yīng)器為模式反應(yīng)器培養(yǎng)小球藻，定時(shí)檢測均勻鼓泡流下小球藻的生長狀況和培養(yǎng)液中氮、磷、鉀、鈣、鎂、鐵等關(guān)鍵營養(yǎng)元素的濃度。[結(jié)果]小球藻在264 h內(nèi)的干重濃度接近線性增加趨勢；鐵元素在48 h后幾乎消耗殆盡；氮和磷元素在168 h后降至較低水平；鎂和鈣元素在96 h降至較低水平后不再明顯下降；鉀元素雖然是小球藻生長的重要組成元素，但其濃度始終處于波動(dòng)狀態(tài)，變化并不顯著。[結(jié)論]小球藻的元素代謝主要發(fā)生在168 h前，各種元素的代謝速率有顯著差異；生長后期雖然大多數(shù)營養(yǎng)元素比較缺乏，但在持續(xù)光照和通入足夠二氧化碳的條件下小球藻仍然可以繼續(xù)生長一段時(shí)間。

關(guān)鍵詞 二氧化碳；小球藻；元素代謝；平板氣升環(huán)流式光生物反應(yīng)器；均勻鼓泡流

中圖分類號(hào) S968.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2016）09-001-04

Abstract[Objective]The aim was to explore the basic law of key elements metabolism in the growth process of Chlorella vulgaris， and optimize the largesclae cultivation process.[Method]A new and highefficient rectangular airlift loop photobioreactor was employed to produce Chlorella vulgaris， and the concentration curves of the key elements in the culture including N， P， K， Ca， Mg and Fe were measured every day during the cultivation to investigate the metabolic laws under the bubbly flow condition.[Result]The results indicated that the concentration of biomass based on the dry weight increases nearly linearly. The concentration of iron was depleted within 48 hours； Nitrogen and phosphorus dropped to a very low concentration after 168 hours. The concentration of magnesium and calcium were no longer declining after 96 hours， while the concentration of potassium kept unchanged. Nitrogen， phosphorus， magnesium， calcium and iron were essential elements for the growth of Chlorella vulgaris， but potassium was not necessary to be kept with a high concentration.[Conclusion]Most of the key elements are depleted in 168 h， and different element consumption rates are obtained. Although the lack of nutrients at last， the Chlorella vulgaris keeps growing by adding gas with sufficient CO2 and keeping illumination continuously in a limited period.

Key words Carbon dioxide； Chlorella vulgaris； Element metabolism； Rectangular airlift loop photobioreactor； Bubbly flow

小球藻是一類水生單細(xì)胞微藻，生長迅速，易于養(yǎng)殖，具有含油率高、蛋白質(zhì)含量豐富、可凈化水質(zhì)和空氣等優(yōu)點(diǎn)[1]，因此被廣泛應(yīng)用于污水凈化[2-3]、生物燃料[4]、醫(yī)藥保健、飼料等領(lǐng)域[5]，可進(jìn)行異養(yǎng)生長和自養(yǎng)生長。異養(yǎng)培養(yǎng)的小球藻雖然可以達(dá)到較高的生長密度[6-7]，但其缺點(diǎn)也較多，如成本過高、容易染菌等[8]。自養(yǎng)培養(yǎng)的小球藻雖然生長濃度較低，但通過改變光照、溫度、培養(yǎng)液組分等條件[9-12]，也能達(dá)到較高的生物量濃度。隨著小球藻的生長，培養(yǎng)液中的關(guān)鍵營養(yǎng)元素會(huì)被逐漸消耗掉，而這些元素對(duì)小球藻的生長有不同的生理作用。Gorain等[13]研究表明鈣元素的缺乏和鎂元素的增加，有助于小球藻脂質(zhì)的積累。Griffiths等[14]和Chu等[15]研究也發(fā)現(xiàn)氮元素的缺乏雖然會(huì)降低小球藻的生長速率，但可以增加脂質(zhì)的含量。Concas等[16]研究表明適量增加鐵元素濃度對(duì)小球藻的生長速率和脂質(zhì)含量均有增大的作用。Xu等[17]報(bào)道改變培養(yǎng)液中的碳氮元素比例可以影響磷元素的吸收，當(dāng)碳氮比為6∶1時(shí)小球藻對(duì)磷元素的吸收率最高。總體而言，已有大量研究注重于部分營養(yǎng)元素對(duì)最終產(chǎn)物的調(diào)控，而關(guān)于關(guān)鍵營養(yǎng)元素代謝對(duì)小球藻生長的影響研究缺少全面、系統(tǒng)性的研究，而這是目前大幅度提高小球藻生物量產(chǎn)率的關(guān)鍵。

在實(shí)際的小球藻培養(yǎng)中，如果起初加入太多的營養(yǎng)元素，則會(huì)因?yàn)榕囵B(yǎng)液鹽度過高而抑制小球藻的生長；在生長過程中，隨著培養(yǎng)液中關(guān)鍵營養(yǎng)元素的不斷消耗，小球藻的生長會(huì)由于某些元素的缺乏而生長變緩。因此，總結(jié)出小球藻的關(guān)鍵營養(yǎng)元素代謝規(guī)律，以此來對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行適時(shí)補(bǔ)充或改變，對(duì)于實(shí)現(xiàn)小球藻高密度培養(yǎng)、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的積累具有重要意義，也是最簡單易行的辦法。筆者在一種高效的平板氣升環(huán)流式光生物反應(yīng)器中培養(yǎng)小球藻[18]，探索小球藻生長過程中一些關(guān)鍵營養(yǎng)元素的代謝規(guī)律，旨在優(yōu)化小球藻的培養(yǎng)工藝，從而提高其產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑。硝酸鈉、碳酸鈉、氯化鈣、七水硫酸鎂、乙二胺四乙酸二鈉、磷酸氫二鉀、硼酸、五水硫酸銅、二水合鉬酸鈉、四水合氯化錳、七水硫酸鋅、六水硝酸鈷、硝酸鉀、磷酸二氫鉀、七水硫酸亞鐵、鉬酸銨、六水氯化鈷、過硫酸鉀、氫氧化鈉、硫酸亞鐵銨、氯化銨、檸檬酸、檸檬酸鐵銨、鹽酸、剛果紅、鹽酸羥胺、冰乙酸、乙酸銨、鄰菲啰啉、硫酸、鈣指示劑、鉻黑T、無水乙醇、25%氨水、抗壞血酸、酒石酸銻鉀、四苯硼鈉、酚酞、5%次氯酸鈉溶液；2%二氧化碳和空氣的混合氣。

1.1.2 藻種。小球藻來自中國科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫。

1.1.3 培養(yǎng)基。試驗(yàn)使用2種培養(yǎng)基，小球藻藻種的培養(yǎng)使用BG11培養(yǎng)基[18]，擴(kuò)大培養(yǎng)和平板氣升環(huán)流式光生物反應(yīng)器中的培養(yǎng)使用改良的培養(yǎng)基，其配方如下：1 g/L 硝酸鉀、66.45 mg/L 氯化鈣、237 mg/L磷酸二氫鉀、30 mg/L七水硫酸亞鐵、40 mg/L乙二胺四乙酸二鈉、204 mg/L七水硫酸鎂、1 mL/L重金屬離子溶液。重金屬離子溶液配方為：083 g/L 硼酸、0.95 g/L五水硫酸銅、0.17 g/L 鉬酸銨、3.3 g/L 四水合氯化錳、2.7 g/L 七水硫酸鋅、0.51 g/L六水氯化鈷。

1.1.4 儀器與耗材。1 L錐形瓶培養(yǎng)；1 L的管式反應(yīng)器；14 L的柱式反應(yīng)器；45 L的平板氣升環(huán)流式光生物反應(yīng)器；36 W日光燈[18]。

1.2 方法

1.2.1 小球藻的培養(yǎng)。小球藻的培養(yǎng)過程包括藻種培養(yǎng)、擴(kuò)大培養(yǎng)和在平板氣升環(huán)流式光生物反應(yīng)器內(nèi)的培養(yǎng)。所有的試驗(yàn)裝置均使用次氯酸鈉浸泡殺菌，培養(yǎng)基在使用前均進(jìn)行高溫、高壓滅菌處理。

①藻種培養(yǎng)。使用BG11培養(yǎng)基，使用1 L的錐形瓶，置于日光燈下培養(yǎng)，定期搖勻。

②小球藻的擴(kuò)大培養(yǎng)。使用改良的培養(yǎng)基，使用1 L的管式反應(yīng)器和14 L的柱式反應(yīng)器，并持續(xù)通入含2%CO2的空氣混合氣，置于日光燈下培養(yǎng)。

③小球藻的最終培養(yǎng)在平板氣升環(huán)流式光生物反應(yīng)器中。使用改良的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基濃度為基準(zhǔn)使用量的2倍，并持續(xù)通入空氣與純CO2混合均勻曝氣，空氣流量為150 L/h，CO2流量為51 mL/min，培養(yǎng)時(shí)間約為264 h，每天取樣1次，檢測小球藻的生長狀況和培養(yǎng)液中的鉀、鈣、鎂、氮、磷、鐵元素的濃度變化。

1.2.2 元素分析和小球藻生物量檢測。小球藻的生物量采取抽濾、烘干、稱重的辦法進(jìn)行檢測，準(zhǔn)備已稱重、孔徑0.44 μm的微孔濾膜，根據(jù)藻液濃度定量抽濾10～100 mL的藻液，并將留有小球藻的濾膜置于恒溫干燥箱內(nèi)24 h后稱重，根據(jù)前后重量差來計(jì)算每次平行取樣藻液的生物量干重濃度，然后取多次取樣的均值作為平均濃度，將抽濾后的澄清溶液進(jìn)行元素分析。鉀元素濃度使用四苯硼酸鉀重量法[19]測定，鈣和鎂元素濃度使用EDTA滴定法[20]測定，氮元素濃度采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法[21]測定，磷元素濃度采用鉬酸銨分光光度法[22]測定，鐵元素濃度使用鄰菲啰啉分光光度法[23]測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 小球藻的生物量變化

從圖1可以看出，試驗(yàn)中控制小球藻的接種濃度約為0.2 g/L，經(jīng)過264 h的培養(yǎng)，小球藻的干重的變化趨勢近似線性增加。總體來看，前期增長速度略快，后期增長速度略微緩慢，小球藻的最終濃度在4.5 g/L左右，比初始濃度增加了大約22倍，生物量積累速率約為04 g/（L·d）。由于該試驗(yàn)使用的日光燈光強(qiáng)較弱，約為120 μmol/（m2·s），隨著藻液濃度的增大，光穿透力僅有幾毫米，光成為限制小球藻快速生長的主要因素。因此，試驗(yàn)中并未明顯觀察到小球藻的指數(shù)生長期，而是呈持續(xù)近似線性增長。

2.2 關(guān)鍵元素濃度的變化

從圖2和圖3可以看出，氮和磷2種元素的代謝規(guī)律基本相似，196 h以前2種元素的濃度都快速下降，而在196～264 h達(dá)到極低水平，小球藻無法繼續(xù)攝取利用，因此其濃度基本不再變化，此時(shí)的氮濃度約為5.0 mg/L，而磷濃度約為15 mg/L，氮和磷的吸收率分別達(dá)到97%和83%以上。196 h后，雖然2種元素的濃度不再下降，在氮磷元素短缺的情況下，持續(xù)通入CO2補(bǔ)充碳源，生物量仍然在繼續(xù)增加，小球藻仍然可以繼續(xù)生長72 h以上。

從圖4可以看出，培養(yǎng)液中的鉀濃度并未呈現(xiàn)出下降的趨勢，整體處于小幅波動(dòng)的狀態(tài)。這可能是由于鉀元素只是小球藻攝取、排出來維持滲透壓的一種元素，在小球藻的內(nèi)外進(jìn)行周期循環(huán)，但其并不是構(gòu)成小球藻的重要元素。因此，在培養(yǎng)過程中不需要進(jìn)行鉀元素的額外補(bǔ)充。

從圖5和圖6可以看出，鈣元素整體呈下降趨勢，96 h下降到較低的濃度，96 h后僅有小幅度下降，最終濃度約為30 mg/L，此濃度大約為小球藻可以攝取與利用的臨界值。鎂元素的代謝規(guī)律與鈣元素相似，前期濃度快速下降，大約在96 h后鎂濃度處于波動(dòng)狀態(tài)，鎂濃度幾乎不變。據(jù)此推測，當(dāng)鎂濃度低于30 mg/L時(shí)，小球藻同樣不能攝取與利用該元素。

從圖7可以看出，與前幾種元素相比，鐵濃度的下降尤為明顯和迅速。在前24 h鐵濃度急速下降到約3 mg/L，48 h下降到1 mg/L以下，48 h后下降非常緩慢，由于鐵濃度過低而無法繼續(xù)被小球藻攝取利用，因此鐵濃度基本不再變化，但小球藻的生長速率也未見明顯降低。

2.3 試驗(yàn)干擾因素分析

對(duì)元素代謝規(guī)律的研究，試驗(yàn)使用的是間接測量培養(yǎng)液中剩余元素的濃度來分析小球藻對(duì)各種元素的吸收與利用規(guī)律，而元素可能會(huì)有其他一些損失途徑（如生產(chǎn)沉淀、揮發(fā)等）。根據(jù)培養(yǎng)基配方可知，培養(yǎng)液中的氮源主要以硝酸根的形式存在，僅有不到0.1%的氮是以銨根形式存在，極少量的氮可能會(huì)以氨揮發(fā)和反硝化途徑損耗。鉀離子本身不會(huì)與其他離子生成沉淀，也不會(huì)揮發(fā)掉。鈣、鎂和亞鐵離子的沉淀pH分別為9.5、10.5和7.6，而該試驗(yàn)中測得的初始pH為6.5左右，大約96 h后上升到76左右，最終pH不超過8.2，達(dá)不到鈣鎂離子沉淀的條件。96 h后雖然能達(dá)到亞鐵離子沉淀的pH，但鐵元素代謝主要發(fā)生在48 h前，96 h后并無明顯變化，而且培養(yǎng)基中的亞鐵離子與EDTA形成穩(wěn)定的絡(luò)合物，不易形成沉淀。因此，鈣、鎂和鐵離子不會(huì)有沉淀損失。在小球藻干重測量時(shí)，理論上也不會(huì)摻雜這些元素的沉淀物對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果，該試驗(yàn)設(shè)置了1個(gè)空白對(duì)照組：在1個(gè)1 L的大試管中，加入水和培養(yǎng)基，并持續(xù)通入CO2，8 h后取100 mL溶液進(jìn)行抽濾、烘干測定，結(jié)果表明溶液中的不溶性物質(zhì)僅有約15 mg/L，而小球藻1 d后干重就超過0.8 g/L，不溶物僅占小球藻干重的1%左右，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響不大。培養(yǎng)液中溶解的鈣、鐵、鎂、鉀等礦物質(zhì)元素濃度遠(yuǎn)大于沉淀物的濃度，而沉淀物的大部分又是水中原有的沙粒等物質(zhì)，因此沉淀物中可能僅有極微量的部分是由培養(yǎng)液中的無機(jī)鹽沉淀所致。此外，這些無機(jī)鹽的沉淀作用也僅會(huì)發(fā)生在前期，并不會(huì)影響后期元素變化的趨勢。因此，可以認(rèn)為培養(yǎng)液中的營養(yǎng)元素的消耗絕大部分是被小球藻吸收利用。

3 討論

3.1 小球藻的生物量

該試驗(yàn)使用高效的平板氣升式環(huán)流式光生物反應(yīng)器，小球藻的產(chǎn)量和產(chǎn)率要比一些常規(guī)的培養(yǎng)方式高很多。嚴(yán)佳琦等[24]研究表明光合自養(yǎng)的小球藻7 d產(chǎn)量達(dá)到0.92 g/L，僅達(dá)到該試驗(yàn)培養(yǎng)3 d產(chǎn)量的60%。Wang等[25]使用鼓泡塔光生物反應(yīng)器培養(yǎng)小球藻，小球藻的生物量產(chǎn)率為31.55 mg/（L·d），僅達(dá)到該試驗(yàn)產(chǎn)率的8%左右。如果后期對(duì)營養(yǎng)元素進(jìn)行適當(dāng)補(bǔ)充，并且適量增加光照強(qiáng)度，該試驗(yàn)預(yù)期可以達(dá)到更高的生物量和產(chǎn)率。

3.2 關(guān)鍵元素濃度變化

（1）氮和磷元素的濃度下降較快，由于氮和磷元素都是影響小球藻生長的關(guān)鍵營養(yǎng)元素，也是污染環(huán)境、造成水華等現(xiàn)象的主要元素，而小球藻對(duì)氮和磷元素具有高去除率的特點(diǎn)，如果應(yīng)用在污水處理方面，不僅能凈化水源，還可以節(jié)約培養(yǎng)成本。呂本松等[8]研究表明氮元素和磷元素對(duì)促進(jìn)小球藻生物量積累的協(xié)同作用與2種元素的配比有關(guān)，當(dāng)小球藻培養(yǎng)液中的氮磷比為15∶1～16∶1時(shí)小球藻的生物量積累最高。該試驗(yàn)的初始氮磷比為2.65∶1，隨著消耗，后期氮磷比為1∶3。因此，可以適當(dāng)提高培養(yǎng)基初始濃度中的氮磷比，將更有利于小球藻的快速生長。

（2）鉀元素濃度基本不變，其不被小球藻吸收利用，僅在細(xì)胞內(nèi)外周期循環(huán)，可能與調(diào)節(jié)小球藻的滲透壓有關(guān)。此外，鉀元素可能還有維持酶的活性、調(diào)控基因表達(dá)等作用。

（3）鈣、鎂元素的代謝主要發(fā)生在前期，在96 h后2種元素的濃度降到約30 mg/L，后期由于鈣、鎂濃度低導(dǎo)致小球藻無法攝取與利用，因此鈣、鎂濃度幾乎不再變化。已有研究表明，在小球藻的生長過程中減少鈣元素的供應(yīng)、數(shù)倍增加鎂元素的供應(yīng)，均有利于小球藻內(nèi)脂質(zhì)的積累[13]，缺鎂脅迫下小球藻的脂質(zhì)積累得到了提高，生長速率、光合活性和光合色素都有明顯下降[26]。因此，在特定時(shí)期對(duì)鈣和鎂元素濃度進(jìn)行調(diào)整，可以促進(jìn)小球藻目標(biāo)產(chǎn)物的提高。

（4）鐵元素代謝速率尤為迅速，在48 h內(nèi)初始濃度由10 mg/L降到1 mg/L以下，此后幾乎不再下降，但并不影響小球藻生物量的繼續(xù)增加。這是由于鐵元素的濃度影響小球藻脂質(zhì)的積累，補(bǔ)充足量的鐵元素可以增加小球藻的產(chǎn)油率[16]，其對(duì)小球藻生長速率的影響卻不大[27]。駱科柩[28]試驗(yàn)也表明鐵濃度會(huì)影響到小球藻對(duì)磷元素的吸收，鐵磷元素的比例則會(huì)影響到小球藻的生長速率，當(dāng)鐵磷比為0.7時(shí)小球藻可以達(dá)到較高的比生長速率。該試驗(yàn)中鐵磷元素的初始比為0.12，鐵磷元素比例較低。因此，在實(shí)際的營養(yǎng)元素補(bǔ)充時(shí)，除了適時(shí)、適量地添加營養(yǎng)元素以外，還應(yīng)注意維持各元素之間的比例平衡，才能保證小球藻的高速生長和目標(biāo)產(chǎn)物的積累。

4 結(jié)論

該試驗(yàn)中小球藻在264 h的生長過程中生物量干重接近線性增加，而關(guān)鍵營養(yǎng)元素的代謝規(guī)律各不相同。氮和磷元素的代謝發(fā)生在前168 h，鈣和鎂元素的代謝發(fā)生在前72 h，鐵元素的代謝發(fā)生在前48 h，而鉀元素濃度全程處于波動(dòng)狀態(tài)并未下降。在培養(yǎng)168 h后，培養(yǎng)液中的關(guān)鍵營養(yǎng)元素幾乎耗盡，其濃度也不再下降。此時(shí)，若繼續(xù)通入CO2，小球藻仍然可以在充足光照和CO2條件下進(jìn)行有限時(shí)間段的生物量積累直至死亡。

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