3種消毒劑對(duì)金黃色葡萄球菌殺菌作用的研究

蘇潤(rùn)雨，聶伯堯，楊百亮

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3種消毒劑對(duì)金黃色葡萄球菌殺菌作用的研究

蘇潤(rùn)雨，聶伯堯，楊百亮通信作者

（天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津 300384）

為了解來蘇兒、百毒殺、84消毒液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用，本試驗(yàn)通過采集膿汁并分離鑒定出金黃色葡萄球菌，采用抑菌試驗(yàn)和懸液定量殺滅試驗(yàn)對(duì)來蘇兒、百毒殺、84消毒液殺滅金黃色葡萄球菌的效果進(jìn)行觀察。結(jié)果顯示：84消毒液和百毒殺作用于金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑明顯大于來蘇兒，且5～20 min內(nèi)能快速高效殺滅金黃色葡萄球菌，來蘇兒的殺滅率較低。來蘇兒對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用較弱，百毒殺和84消毒液對(duì)金黃色葡萄球菌有很好的殺滅作用，84消毒液優(yōu)于百毒殺。

消毒劑；金黃色葡萄球菌；殺滅作用

金黃色葡萄球菌（）簡(jiǎn)稱金黃色葡萄球菌，為革蘭氏陽性無芽孢球菌，廣泛分布于空氣、水、土壤、飼料、人和動(dòng)物體表及與外界相通的腔道，常引起人和動(dòng)物組織器官膿腫、創(chuàng)傷化膿以致敗血癥、膿毒敗血癥以及食物中毒等，也可引起葡萄球菌病，其臨床表現(xiàn)為消瘦、精神沉郁，伴有腹瀉，一年四季均可發(fā)生，尤以氣候溫暖和潮濕季節(jié)多發(fā)，屬于人獸共患病原菌[1]。金黃色葡萄球菌引起的皮膚化膿感染和手術(shù)部位的化膿性感染目前在寵物行業(yè)越來越多見，因此采用有效的消毒劑來對(duì)病原體進(jìn)行消滅，對(duì)其傳播途徑進(jìn)行切斷，控制疾病的蔓延，保護(hù)易感種群顯得十分必要。

近年來，消毒劑在細(xì)菌污染方面的廣泛應(yīng)用得到了高度重視，但消毒劑的種類多，作用原理大不相同，來蘇兒是含50%煤酚的肥皂溶液，又稱為煤酚皂，其主要?dú)⒕煞譃榧追?，屬于酚類消毒劑，其消毒原理是使蛋白質(zhì)變性、沉淀，使酶系統(tǒng)失活，能抑制和殺死部分細(xì)菌的繁殖體和親酯病毒，屬于低效消毒劑[2]。百毒殺屬雙鏈季銨鹽類消毒劑，其主要成分為10%葵甲溴銨溶液，主要是通過改變細(xì)胞膜的通透性，使細(xì)胞質(zhì)外漏進(jìn)而殺滅細(xì)菌等微生物[3]。84消毒劑屬鹵素類消毒劑，其殺菌機(jī)理是氧化菌體中的活性基團(tuán)，與氨基結(jié)合使蛋白質(zhì)變性。選擇細(xì)菌敏感性高的消毒劑在防控動(dòng)物疫病方面至關(guān)重要。

本試驗(yàn)通過杯碟法和懸液定量殺滅法研究來蘇兒、百毒殺、84消毒劑對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用，選用合適的消毒劑來快速消滅金黃色葡萄球菌，以較好地控制化膿性感染和葡萄球菌病。

1 材料

1.1 病料

本試驗(yàn)無菌采取天津農(nóng)學(xué)院附屬動(dòng)物醫(yī)院一患膿皮病白色泰迪幼犬背部化膿處的膿汁，置 4 ℃冰箱待檢。

1.2 消毒劑與中和劑

來蘇兒、百毒殺、84消毒液分別配制5種濃度：2.5%、2.0%、1.5%、1.0%、0.5%，并做好標(biāo)記，硫代硫酸鈉中和劑、吐溫-80中和劑[4]均由天津農(nóng)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 試驗(yàn)器材與試劑

超凈工作臺(tái)、恒溫恒濕培養(yǎng)箱、高壓滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)振蕩器、電子天平、電子顯微鏡，冰箱、電爐子、牛津杯、游標(biāo)卡尺及常用玻璃器材由天津農(nóng)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供；營(yíng)養(yǎng)瓊脂粉、氯化鈉、蛋白胨、牛肉膏、蒸餾水、3%過氧化氫溶液等由天津農(nóng)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供；葡萄球菌屬細(xì)菌生化鑒定管購(gòu)于杭州天和微生物試劑有限公司；羊血瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)于天津金章科技公司。

2 方法

2.1 培養(yǎng)基的制備

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基制備：營(yíng)養(yǎng)瓊脂 42 g，加入 1 000 mL純化水加熱煮沸溶解，并高壓滅菌備用。倒板時(shí)需在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行。

7.5%氯化鈉肉湯制備：蛋白胨10 g，牛肉膏 5 g，氯化鈉75 g，蒸餾水1 000 mL，pH7.4，加熱溶解，調(diào)節(jié)pH值，分裝，121 ℃高壓滅菌15 min[5]。

普通液體培養(yǎng)基制備：牛肉膏3～5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，蒸餾水1 000 mL，加熱溶解，調(diào)節(jié)pH7.4～7.6，過濾分裝，121 ℃高壓滅菌15 min。

2.2 細(xì)菌的分離培養(yǎng)與純化

無菌采取膿汁，并與生理鹽水按1:10比例混合，接種于7.5%氯化鈉肉湯中并放在37 ℃恒溫箱進(jìn)行增菌培養(yǎng)18～24 h[6]，取出并觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)狀況。然后劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂和羊血瓊脂培養(yǎng)基上，倒置37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)18～24 h，取出并觀察細(xì)菌的菌落特征。然后挑取可疑單個(gè)菌落于羊血瓊脂上進(jìn)行純化培養(yǎng)，并觀察菌落特征，放置4 ℃冰箱備用。

2.3 鏡檢

用滅菌接種環(huán)挑取有溶血現(xiàn)象的單個(gè)菌落于潔凈的載玻片上，并與少量適當(dāng)生理鹽水混勻，均勻地涂布成適當(dāng)大小的薄層[7]。待自然干燥后將其固定，然后做革蘭染色，在顯微鏡下鏡檢觀察細(xì)菌的形態(tài)。

2.4 菌懸液的制備

將分離出的單個(gè)菌落接種到普通液體培養(yǎng)基中，放到37 ℃恒溫培養(yǎng)振蕩器中培養(yǎng)24 h，觀察培養(yǎng)基的渾濁度，根據(jù)其渾濁度再培養(yǎng)12 h，制備成均勻的菌懸液[8]。然后拿出培養(yǎng)基置于4 ℃冰箱備用。

2.5 觸酶試驗(yàn)

取潔凈載玻片1張，用接種環(huán)挑取單個(gè)菌落于載玻片上，然后滴加一滴3%H2O2，立即觀察結(jié)果[9]。

2.6 生化試驗(yàn)

將細(xì)菌純化后，取典型的單個(gè)菌落分別接種于乳糖、麥芽糖、蔗糖、甘露糖、甘露醇、木膠糖、尿素、蕈糖、N-乙酰葡糖胺、硝酸鹽生化管，37 ℃培養(yǎng)24 h[10]。

2.7 抑菌試驗(yàn)

采用杯碟法，取0.1 mL菌懸液于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，涂布均勻，然后再輕輕的放5個(gè)無菌牛津杯，要求分散且等距[11]。在牛津杯中分別加入 5種濃度梯度且等量的消毒劑，做好標(biāo)記。放入37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，取出，觀察比較抑菌圈大小，測(cè)出并記錄各抑菌圈的直徑[12]。該試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2.8 懸液定量殺滅試驗(yàn)

該工藝能夠?qū)⒂蛯咏貛У纳⑸?、污染物和雜質(zhì)排出地面，解決了出砂油藏油井生產(chǎn)管理中存在的砂埋油層、井筒砂堵、井下及地面設(shè)備磨蝕、砂卡等突出矛盾，簡(jiǎn)化了出砂油田的采油工藝，延長(zhǎng)了油井生產(chǎn)周期，降低了油井的維護(hù)費(fèi)用；同時(shí)利用加溫后的地層水作動(dòng)力液，循環(huán)過程中提高了地層溫度，對(duì)稠油起到降黏功效的同時(shí)增加了近井地帶油層滲透率，從而大幅度提高了油井的產(chǎn)能。

首先，10倍倍比稀釋菌懸液并涂板計(jì)數(shù)，作為消毒前菌數(shù)。然后取菌懸液50 μL分別加入450 μL不同濃度的消毒劑，混勻，分別作用5 min及20 min后，取出100 μL加到900 μL中和劑中（84消毒液的中和劑為硫代硫酸鈉，來蘇、百毒殺的中和劑為吐溫-80），此時(shí)溶液共1 000 μL，再?gòu)倪@1 000 μL中取50 μL混合液加入450 μL滅菌蒸餾水，取樣液并稀釋涂板，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，作為消毒后菌數(shù)，并計(jì)算殺滅率[13]。

3 結(jié)果

3.1 菌落形態(tài)與形態(tài)學(xué)檢查

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，形成濕潤(rùn)、表面光滑、邊緣整齊、不透明、隆起的金黃色圓形菌落（圖1A）；羊血瓊脂培養(yǎng)基上形成的菌落較大，菌落周圍出現(xiàn)溶血環(huán)（圖1B）。細(xì)菌在普通液體培養(yǎng)基和7.5%氯化鈉肉湯中37 ℃培養(yǎng)24 h后，均勻渾濁，管底有少量沉淀，搖動(dòng)易散；在油鏡下，可見革蘭氏染色為陽性，成對(duì)、短鏈或成串（葡萄狀）排列，無芽孢莢膜。由此可初步判斷其為金黃色葡萄球菌。

（注：A. 普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落；B. 羊血瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落）

3.2 觸酶試驗(yàn)結(jié)果

大多數(shù)需氧和兼性厭氧菌均產(chǎn)生過氧化氫酶，但鏈球菌科為陰性。本試驗(yàn)過程中產(chǎn)生大量氣泡，為陽性結(jié)果，可進(jìn)一步確定此菌為金黃色葡萄球菌。

3.3 生化試驗(yàn)結(jié)果

細(xì)菌生化鑒定結(jié)果見表1。該菌能分解乳糖、麥芽糖、蔗糖、甘露醇、尿素等物質(zhì)，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，與葡萄球菌生化特性相符。

表1 生化試驗(yàn)結(jié)果

注：＋表示呈陽性

3.4 抑菌試驗(yàn)結(jié)果

由圖2和表2可知，百毒殺和84消毒液對(duì)金黃色葡萄球菌有很好的抑制作用，經(jīng)杯碟法試驗(yàn)可見，兩種消毒劑在5個(gè)濃度梯度上均有明顯的抑菌圈，且84消毒液的抑制作用較強(qiáng)。2.0%以上濃度的來蘇兒對(duì)金黃色葡萄球菌有一定抑制作用，1.5%以下濃度的來蘇兒對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用較弱，0.5%濃度的來蘇兒對(duì)金黃色葡萄球菌幾乎沒有抑制作用。相同條件下，金黃色葡萄球菌對(duì)3種消毒劑的敏感性均隨濃度的升高而升高。

（注：A. 來蘇兒處理組；B. 百毒殺處理組；C. 84消毒液處理組）

表2 不同濃度的消毒劑抑菌圈直徑大小 cm

3.5 懸液定量殺滅試驗(yàn)結(jié)果

如表3所示，各濃度84消毒液與金黃色葡萄球菌作用5 min對(duì)其殺滅率即為100%；各濃度百毒殺與金黃色葡萄球菌作用20 min對(duì)其殺滅率為100%，但作用5 min時(shí)，1.5%以上濃度的百毒殺對(duì)其殺滅率才達(dá)到100%，可見84消毒液對(duì)金黃色葡萄球菌的殺滅效果優(yōu)于百毒殺。來蘇兒對(duì)金黃色葡萄球菌的殺滅作用較弱，2.0%以下濃度的來蘇兒對(duì)金黃色葡萄球菌的殺滅率均較低，2.5%濃度的來蘇兒對(duì)金黃色葡萄球菌有一定殺滅作用。綜上所述，在相同的時(shí)間下，隨著濃度的增加，各種消毒劑對(duì)金黃色葡萄球菌的殺滅作用均逐步增強(qiáng)，84消毒液的殺滅作用最好，其次為百毒殺，來蘇兒的殺滅作用最弱。

表3 消毒劑對(duì)金黃色葡萄球菌的殺滅率

4 討論

4.1 分離鑒定

本次試驗(yàn)分離菌在羊血瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落較大，且有完全溶血現(xiàn)象，這與金黃色葡萄球菌的菌落生長(zhǎng)特征相同。普通培養(yǎng)基上形成濕潤(rùn)、表面光滑、邊緣整齊、不透明、隆起的圓形菌落與金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)特性相符。鏡檢結(jié)果可知，菌體堆積成葡萄串狀排列、無芽孢、無莢膜的革蘭氏陽性菌落，結(jié)合以上結(jié)果可初步確定此菌為葡萄球菌。生化試驗(yàn)結(jié)果全為陽性，進(jìn)一步說明此菌為金黃色葡萄球菌。因金黃色葡萄球菌與鏈球菌的生長(zhǎng)特性及顯微鏡下細(xì)菌的形態(tài)相似，不好區(qū)分，但鏈球菌不具有過氧化氫酶，所以采用觸酶試驗(yàn)，其結(jié)果顯示為陽性，即該菌具有過氧化氫酶活性，可立即分解過氧化氫，產(chǎn)生氣泡，因此進(jìn)一步確定此菌為金黃色葡萄球菌。

4.2 殺滅效果比較

本文通過杯碟法抑菌試驗(yàn)和懸液定量殺滅試驗(yàn)，比較研究了實(shí)驗(yàn)室常用的3種消毒劑對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用。結(jié)果顯示，時(shí)間、溫度、消毒劑濃度相同的條件下，84消毒液和百毒殺作用的金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑明顯大于來蘇兒處理組的抑菌圈直徑，說明來蘇兒的抑菌作用最弱。溫度、時(shí)間、消毒劑濃度相同的條件下，84消毒劑對(duì)金黃色葡萄球菌的殺滅率高于百毒殺和來蘇兒，來蘇兒的殺滅率最低，與上述抑菌試驗(yàn)的結(jié)果吻合。綜上所述，在相同試驗(yàn)條件下，84消毒液、百毒殺、來蘇兒對(duì)金黃色葡萄球菌的殺滅效果依次降低，表明金黃色葡萄球菌對(duì)84消毒液、百毒殺的敏感性較高。其中百毒殺為季銨鹽類消毒劑，有研究認(rèn)為復(fù)合季銨鹽類消毒劑對(duì)革蘭氏陽性的敏感性較高，與本試驗(yàn)結(jié)論一致[9]。另外，3種消毒劑的殺菌效果均隨作用時(shí)間的延長(zhǎng) 而增強(qiáng)，與作用濃度也成正相關(guān)，這與其他相關(guān)的研究報(bào)道結(jié)果也類似[8]。

此外，由于目前抗生素濫用現(xiàn)象嚴(yán)重，一些常見病原菌的耐藥性不斷提高，給臨床應(yīng)用帶來了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。例如，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌是最常見的多重耐藥菌，國(guó)內(nèi)外屢有暴發(fā)流行的報(bào)道，已成為世界范圍內(nèi)醫(yī)療費(fèi)用快速增長(zhǎng)和導(dǎo)致患者死亡率升高的主要因素，成為當(dāng)前醫(yī)院感染控制的難點(diǎn)[14]。有研究報(bào)道顯示，來蘇兒對(duì)金黃色葡萄球菌臨床菌株的抑菌作用明顯弱于對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株的抑制效果[11]。因此，本研究建議將這兩種消毒劑交替使用，以避免金黃色葡萄球菌對(duì)其產(chǎn)生耐藥性，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。

5 結(jié)論

試驗(yàn)表明，84消毒劑和百毒殺對(duì)金黃色葡萄球菌有很強(qiáng)的抑菌效果，來蘇兒的抑菌效果相對(duì)較差，84消毒劑和百毒殺作為殺滅金黃色葡萄球菌的高效消毒劑，建議臨床使用。

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Study on Killing Effect of Three Disinfectants against

SU Run-yu, NIE Bo-yao, YANG Bai-liangCorresponding Author

（College of Animal Science and Veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China）

To study the effects of Lysol, didecyl dimethyl ammonium bromide solution and 84 disinfectant in killing. Bacteriostatic test and suspension quantitative killing test were conducted in the laboratory, respectively. Larger inhibition zone were observed onagar media which were treated with 84 disinfectant and didecyl dimethyl ammonium bromide solution, andcould be killed by them quickly and effectively in 5~20 min. It is suggested that the sterile efficacy of Lysol is weaker significantly than other two disinfectants onAmong of these disinfectants, 84 disinfectant is the best choice in killing pathogenic bacteria clinically.

disinfectants;; killing effect

P641.131；S152.72

A

1008-5394（2016）03-0051-04

2016-01-05

天津市自然科學(xué)基金項(xiàng)目“豬傳染性胃腸炎病毒單克隆抗體免疫生物制劑研制”（033608511）

蘇潤(rùn)雨（1990-），女，河北唐山人，碩士在讀，研究方向?yàn)轭A(yù)防獸醫(yī)學(xué)。E-mail：1558761240@qq.com。

楊百亮（1960-），男，山西洪洞人，教授，碩士，主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究。E-mail：bailiangyang@163.com。