冰溫貯藏對(duì)羊肉中蛋白質(zhì)磷酸化水平的影響

張 艷，李 欣，李 錚，李 蒙，劉永峰，張德權(quán)

?

冰溫貯藏對(duì)羊肉中蛋白質(zhì)磷酸化水平的影響

張 艷1,2，李 欣2，李 錚2，李 蒙2，劉永峰1，張德權(quán)2

（1陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，西安 710119；2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

【目的】通過(guò)測(cè)定冰溫貯藏及冷藏過(guò)程中肌肉肌漿蛋白與肌原纖維蛋白的磷酸化水平，分析冰溫貯藏對(duì)蛋白質(zhì)磷酸化水平的影響，為肉類冰溫貯藏品質(zhì)調(diào)控提供理論依據(jù)?！痉椒ā窟x取大尾寒羊與小尾寒羊雜交公羊的背最長(zhǎng)肌于冷藏和冰溫條件下成熟，分別在0.5 h、12 h、24 h、3 d、5 d、9 d取樣測(cè)定蛋白激酶活性、肌漿蛋白與肌原纖維蛋白的磷酸化水平。采用蛋白激酶活性測(cè)定試劑盒、運(yùn)用酶聯(lián)免疫的方法檢測(cè)各處理組蛋白激酶的活性隨貯藏時(shí)間的變化；通過(guò)SDS-PAGE電泳、熒光染色的方法得到全蛋白染色與磷酸化染色的肌漿蛋白與肌原纖維蛋白條帶，運(yùn)用Quantity One軟件分析各處理組各處理時(shí)間的肌漿蛋白及肌原纖維蛋白的磷酸化水平。【結(jié)果】貯藏初期（0.5—12 h），冰溫組蛋白激酶活性顯著升高（＜0.05），冷藏組蛋白激酶活性則顯著降低（＜0.05），貯藏12 h—9 d過(guò)程中，冰溫組蛋白激酶活性均顯著高于冷藏組（＜0.05）。兩處理組蛋白激酶活性均隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低，且冰溫組蛋白激酶活性均顯著高于冷藏組（＜0.05）。對(duì)肌漿蛋白染色效果圖中分布于15—250 kDa的17個(gè)蛋白條帶逐一進(jìn)行分析，結(jié)果表明貯藏溫度極顯著影響肌漿蛋白各蛋白條帶的磷酸化水平（＜0.001）。冷藏組肌漿蛋白整體磷酸化水平先升高后降低，貯藏第3天達(dá)到最大值，冰溫組肌漿蛋白整體磷酸化水平先降低后升高，最小值出現(xiàn)在貯藏第24天，貯藏第12天至3天時(shí)，冷藏組肌漿蛋白整體磷酸化水平高于冰溫組（＜0.05），貯藏第9天時(shí)，冰溫組肌漿蛋白整體磷酸化水平高于冷藏組（＜0.05）。對(duì)肌原纖維蛋白染色效果圖中分布于15—250 kDa的20個(gè)蛋白條帶逐一進(jìn)行分析，結(jié)果表明不同貯藏溫度對(duì)所有肌原纖維蛋白條帶的磷酸化水平均產(chǎn)生極顯著影響作用（＜0.001）。兩處理組肌原纖維蛋白整體磷酸化水平均隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，冷藏組與冰溫組最大值分別出現(xiàn)在24 h和12 h，貯藏初期（0.5-—12 h），兩處理組間肌原纖維蛋白整體磷酸化水平無(wú)顯著差異（＜0.05），貯藏24 h至貯藏期結(jié)束，冷藏組肌原纖維蛋白整體磷酸化水平始終高于冰溫組（＜0.05）?！窘Y(jié)論】冰溫貯藏通過(guò)影響蛋白激酶的活性來(lái)調(diào)控蛋白質(zhì)的磷酸化水平，進(jìn)而通過(guò)影響糖酵解途徑、肌肉收縮及骨架蛋白降解來(lái)間接調(diào)控肉品質(zhì)。

冰溫；蛋白激酶；肌漿蛋白；肌原纖維蛋白；蛋白質(zhì)磷酸化

0 引言

【研究意義】冰溫貯藏是指將食品貯藏在其冰點(diǎn)以上、0℃以下的溫度區(qū)域，該溫度區(qū)域既可使機(jī)體的生理活動(dòng)降到最低程度，又能維持其正常的新陳代謝，既能抑制微生物生長(zhǎng)，又不會(huì)對(duì)食品產(chǎn)生凍害，進(jìn)而起到長(zhǎng)期保鮮食品的作用[1]。磷酸化是經(jīng)蛋白激酶催化的最常見(jiàn)、最重要的一種蛋白質(zhì)的翻譯后修飾方式[2]。糖酵解、肌肉收縮及蛋白質(zhì)降解等與肉品質(zhì)形成相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程都受蛋白質(zhì)磷酸化和去磷酸化這一可逆過(guò)程的調(diào)節(jié)[3-5]。因此，研究冰溫貯藏條件下肌肉蛋白質(zhì)磷酸化水平的變化，可為研究宰后蛋白質(zhì)磷酸化修飾調(diào)控肉品質(zhì)的形成和劣變提供理論依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】李培迪等[6]的研究表明，相較于冷藏，冰溫貯藏可使丙酮酸激酶活性升高，乳酸脫氫酶活性降低，同時(shí)延長(zhǎng)μ-鈣蛋白酶的活性保持時(shí)間，從而延緩肌肉糖酵解進(jìn)程，延遲肌肉成熟，說(shuō)明貯藏溫度能夠通過(guò)調(diào)控酶的活性影響糖酵解過(guò)程。ANDERSON等[7]指出宰后肌漿蛋白中葡萄糖磷酸變位酶-1的磷酸化水平與肌肉剪切力呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，另外，SHEN等[8]的研究指出，豬宰后早期背最長(zhǎng)肌中蛋白激酶的激活導(dǎo)致磷酸果糖激酶2（PFK-2）和磷酸果糖激酶1（PFK-1）的磷酸化，進(jìn)而形成白肌肉（PSE肉），這表明宰后肌肉品質(zhì)與肌漿蛋白的磷酸化關(guān)系密切。同時(shí)，HUANG等[9]研究發(fā)現(xiàn)宰后肌肉成熟及肌肉品質(zhì)變化與肌原纖維蛋白磷酸化水平相關(guān)。HEELEY[10]、MAZZEI[11]、RYDER[12]等研究發(fā)現(xiàn)肌肉中大部分肌原纖維蛋白的功能特性均受蛋白質(zhì)磷酸化和去磷酸化過(guò)程影響，可見(jiàn)肉品質(zhì)變化同樣與肌原纖維蛋白的磷酸化存在緊密聯(lián)系。【本研究切入點(diǎn)】冰溫貯藏有利于延緩宰后肌肉的成熟進(jìn)程，從而調(diào)控肌肉品質(zhì)，同時(shí)有研究表明宰后成熟過(guò)程中（0—24 h）肌漿蛋白的磷酸化修飾水平能夠間接影響糖酵解進(jìn)程，肌原纖維蛋白的磷酸化修飾可以通過(guò)影響肌肉收縮而調(diào)控肉的僵直及嫩化進(jìn)程。肌漿蛋白與肌原纖維蛋白是肌肉蛋白最主要的組成成分，肌漿蛋白包括大多數(shù)與糖酵解有關(guān)的酶類，肌原纖維蛋白包含主要的收縮蛋白及收縮調(diào)控蛋白[13]。在宰后較長(zhǎng)時(shí)間的貯藏過(guò)程中蛋白質(zhì)磷酸化水平是否會(huì)發(fā)生變化，貯藏條件是否會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)磷酸化水平產(chǎn)生影響，均未見(jiàn)報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)檢測(cè)貯藏過(guò)程中蛋白激酶的活性、肌漿蛋白及肌原纖維蛋白的磷酸化水平，揭示冰溫貯藏對(duì)蛋白質(zhì)磷酸化水平的影響。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2015年10月至2016年2月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所進(jìn)行。

1.1 試驗(yàn)材料

選取飼養(yǎng)方式相同、體重相近的8月齡大尾寒羊×小尾寒羊雜交公羊5只。采用清真方式屠宰，宰前靜養(yǎng)1 h以消除應(yīng)激，宰后0.5 h內(nèi)迅速取下兩側(cè)背最長(zhǎng)肌。

每只羊在宰后0.5 h取其任意一側(cè)背最長(zhǎng)肌靠近尾端的1/7，液氮速凍，貯存于-80℃，用于測(cè)定初始指標(biāo)。剩余背最長(zhǎng)肌樣品均在宰后2 h內(nèi)于冰盒上運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，每只羊兩側(cè)背最長(zhǎng)肌隨機(jī)分為冷藏及冰溫貯藏處理組，每條背最長(zhǎng)肌樣品平均分為6份，從頭至尾隨機(jī)分配至各個(gè)貯藏時(shí)間（12 h、24 h、3 d、5 d、9 d，剩余一塊用于監(jiān)測(cè)溫度），白色托盤(pán)盛放，貼上標(biāo)簽，食品級(jí)PE保鮮膜，氧氣透過(guò)率為（10 600± 20）% cm3/（m2·24 h·atm）包裹后放入-18℃冰箱進(jìn)行降溫，冷藏組待肉塊中心溫度降至4℃時(shí)取出，冷藏貯存（2—4℃），冰溫組待肉塊中心溫度降至-1℃時(shí)取出，冰溫貯存（-1—-1.5℃）。宰后12 h、24 h、3 d、5 d、9 d取出相應(yīng)肉塊，去除可見(jiàn)脂肪及筋膜后經(jīng)液氮速凍，保存于-80℃。

1.2 試驗(yàn)試劑與儀器

1.2.1 主要試劑 試驗(yàn)使用試劑均為分析純。三羥甲基氨基甲烷（Trizma base）、二硫蘇糖醇（DTT）、甲叉雙丙烯酰胺（methylene diacrylamide）、丙烯酰胺（Acrylamide）、過(guò)硫酸銨（APS）、四甲基乙二胺（TEMED）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、甘氨酸、曲拉通-100（Triton-100）、EGTA、巰基乙醇（β-mercaptoethanol）、考馬斯亮藍(lán)G250、溴酚藍(lán)、甘油，美國(guó)Sigma公司；蛋白酶抑制劑（Roche Complete）、磷酸酶抑制劑（Roche PhosStop），瑞士Roche公司；蛋白濃度測(cè)定試劑盒（BCA protein assay kit），美國(guó)Pierce公司；蛋白激酶活性測(cè)定試劑盒，加拿大Immunechem公司；Pro-Q染色液（Pro-Q Diamond）、Ruby染色液（SYPRO Ruby），美國(guó)Invitrogen公司；氯化鉀（KCl）、無(wú)水乙酸鈉、磷酸、乙腈、甲醇、無(wú)水乙醇、乙酸，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司。

1.2.2 主要儀器 MIR-154-PC低溫恒溫培養(yǎng)箱，日本Panasonic公司；Ultra Turrax Disperser S25勻漿器，德國(guó)IKA公司；CR22GII高速冷凍離心機(jī)，日本日立公司；SpectraMax 190多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)Molecular Devices公司；1-14小型臺(tái)式離心機(jī)，美國(guó)Sigma公司；DK-S28電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；電泳儀、凝膠成像儀，美國(guó)Bio-Rad公司；T6紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；超低溫冰箱，美國(guó)Thermo公司。

1.3 試驗(yàn)方法

采用Pro-Q Diamond和SYPRO Ruby染液分別檢測(cè)磷酸化蛋白和全蛋白。將某一蛋白條帶經(jīng)Pro-Q Diamond染色后的灰度值（P）與SYPRO Ruby染色后的灰度值（T）之比作為該條帶磷酸化水平。試驗(yàn)共60個(gè)樣品（5只羊×2個(gè)處理組×6個(gè)時(shí)間點(diǎn)），所有樣品從蛋白質(zhì)提取到進(jìn)行電泳及蛋白質(zhì)條帶染色均進(jìn)行3次以上重復(fù)性檢測(cè)。

1.3.1 蛋白激酶活性測(cè)定 取-80℃凍存的肉樣，用預(yù)冷的生理鹽水洗滌2次，濾紙吸干，稱取3 g肉樣，加入12 mL預(yù)冷緩沖液（25 mmol·L-1Tris-HCl，2 mmol·L-1EGTA，50 mmol·L-1巰基乙醇），冰浴中15 000×充分勻漿（3次，每次15 s，間隔30 s）。在4℃、1 000×條件下離心30 min，上清液用兩層紗布過(guò)濾，即得蛋白激酶粗提液，分裝后于-80℃保存。

將蛋白激酶粗提液稀釋20倍后采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定樣品蛋白濃度，調(diào)整原激酶粗提液至相同濃度，稀釋2 000倍，采用酶聯(lián)免疫方法，運(yùn)用蛋白激酶活性測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白激酶活性，蛋白激酶相對(duì)活性以495 nm處樣品吸光度值與空白（20×蛋白激酶提取緩沖液）吸光度值之差表示。

1.3.2 肌漿蛋白提取及其磷酸化水平測(cè)定 肌漿蛋白提取參考Lametsch等[14]的方法，并略作修改，取-80℃凍存的肉樣1.0 g，加6 mL預(yù)冷的緩沖液（10 mmol·L-1Tris，10 mmol·L-1DTT，蛋白酶抑制劑1片/50 mL，磷酸酶抑制劑5片/50 mL），冰浴中15 000×勻漿30 s（3次，每次10 s，間隔30 s），4℃、20 000×離心30 min，上清液用兩層紗布過(guò)濾即得肌漿蛋白，震蕩均勻后分裝，于-80℃貯存。

取-80℃貯存的肌漿蛋白，稀釋8倍后用BCA法測(cè)定蛋白濃度，將肌漿蛋白濃度調(diào)整為2 μg·μL-1后與上樣緩沖液（10% SDS 4 mL，甘油2 mL，2 mL 0.5 mol·L-1Tris-HCl pH6.8，2 mL 1 mol·L-1DTT，溴酚藍(lán)0.01 g）1﹕1混合，沸水浴煮5 min，2 000×離心2 min，分裝后-20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

采用SDS-PAGE電泳、磷酸化染色及全蛋白染色測(cè)定肌漿蛋白磷酸化水平。分離膠濃度為14%，濃縮膠濃度為4%，上樣量為5 μg。電泳結(jié)束后至成像前所有操作均需在搖床（60 r/min）上進(jìn)行。固定液（50%甲醇，10%乙酸）固定（100 mL、30 min/次，2次）以確保凝膠上電泳緩沖液被清洗干凈，超純水水洗（100 mL、10 min/次，3次），Pro-Q Diamond染液避光染色80 min，Pro-Q脫色液（20%乙腈，50 mmol·L-1乙酸鈉，pH 4.0）脫色（100 mL、30 min/次，2次），超純水水洗（100 mL、5 min/次、3次），進(jìn)行磷酸化蛋白染色成像；SYPRO Ruby染色液染色4 h，Ruby脫色液（10%乙醇，7%乙酸）脫色（100 mL、30 min/次，2次），超純水水洗（100 mL、5 min/次、3次）。

使用ChemiDocTMMP凝膠成像儀對(duì)染色后的蛋白質(zhì)凝膠進(jìn)行掃描。Pro-Q Diamond染色后在激發(fā)波長(zhǎng)為532 nm、發(fā)射波長(zhǎng)為 580 nm、分辨率為 200 mm的條件下掃描。 SYPRO Ruby染色后在激發(fā)波長(zhǎng)為532 nm、發(fā)射波長(zhǎng)為610 nm、分辨率為200 mm的條件下掃描。

1.3.3 肌原纖維蛋白提取及其磷酸化水平測(cè)定 肌原纖維蛋白提取參考Smuder等[15]的方法并略作修改，取-80℃凍存的肉1.0 g，加6 mL預(yù)冷的緩沖液（10 mmol·L-1Tris，10 mmol·L-1DTT，蛋白酶抑制劑1片/50 mL，磷酸酶抑制劑5片/50 mL），冰浴中15 000×勻漿30 s（3次，每次10 s，間隔30 s），4℃、20 000×離心30 min，棄上清。沉淀中加入8 mL預(yù)冷的肌原纖維溶解緩沖液（100 mmol·L-1KCl，1% Triton），冰浴中勻漿15 s，4℃，2 000×離心15 min，棄上清，此操作重復(fù)2次。沉淀中加入10 mL 5% SDS（60℃），使肌原纖維蛋白充分溶解，80℃加熱20 min，分裝后-80℃保存。

取-80℃貯存的肌漿蛋白，稀釋15倍后用BCA法測(cè)定蛋白濃度，將肌漿蛋白濃度調(diào)整為2 μg·μL-1后與上樣緩沖液1﹕1混合，沸水浴煮沸5 min，2 000×離心2 min，分裝后-20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

肌原纖維蛋白SDS-PAGE電泳分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為4%，其磷酸化蛋白染色、全蛋白染色過(guò)程均同肌漿蛋白。

1.4 圖像分析及統(tǒng)計(jì)分析

運(yùn)用Quantity One（美國(guó)Bio-Rad公司）軟件對(duì)經(jīng)熒光染液染色的SDS-PAGE凝膠電泳蛋白條帶的光密度值進(jìn)行分析，得到每個(gè)條帶的磷酸化蛋白染色（Pro-Q Diamond）光密度值（P）和全蛋白染色（SYPRO Ruby）光密度值（T），同一條帶的磷酸化蛋白與全蛋白光密度值之比P/T即為該條帶蛋白質(zhì)磷酸化水平，樣品整體磷酸化水平為其泳道上所有蛋白條帶的P/T值之和。利用SPSS Statistics 20軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，不同處理組間的差異顯著性采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)進(jìn)行分析；以貯藏條件、宰后時(shí)間及貯藏條件×宰后時(shí)間3個(gè)因素作為變量，動(dòng)物作為隨機(jī)因素，進(jìn)行混合模型方差分析。多重比較方法采用Duncan法，顯著性水平為＜0.05。結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2.1 蛋白激酶活性分析

如圖1所示，冰溫貯藏條件下蛋白激酶活性在宰后0.5—12 h顯著升高（＜0.05），隨后逐漸下降。冷藏過(guò)程中蛋白激酶活性隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸顯著降低（＜0.05），且冷藏過(guò)程中降低速率高于冰溫貯藏，12 h—9 d的貯藏過(guò)程中冰溫組蛋白激酶活性均顯著高于冷藏組（＜0.05）。在貯藏后期，冷藏組蛋白激酶接近失活狀態(tài)而冰溫組仍處于較高水平。

2.2 肌漿蛋白各蛋白條帶磷酸化水平分析

冰溫貯藏組及冷藏組在宰后0.5 h、12 h、24 h、3 d、5 d、9 d的肌漿蛋白SDS-PAGE電泳圖如圖2-a、2-b所示。對(duì)圖2中分布于15—250 kDa的17個(gè)蛋白條帶逐一進(jìn)行分析，結(jié)果如表1所示。不同貯藏溫度下，各個(gè)蛋白條帶的磷酸化水平均差異顯著（＜0.001），條帶2、3、5、6、10、14、15的磷酸化在不同貯藏溫度和不同貯藏時(shí)間下均產(chǎn)生顯著差異（＜0.05），條帶2、5、6、14、15、17的磷酸化水平在貯藏溫度與貯藏時(shí)間的交互作用下差異顯著（＜0.05）。其中，條帶4、7、9的磷酸化水平隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)先升高后降低，且分別在第24 h、第5天、第12 h達(dá)到最大值。條帶2、5、6、11、15的磷酸化水平在貯藏期內(nèi)先降低后升高，最小值分別出現(xiàn)在第12 h（及24 h）、第24 h、第5天、第24 h、第12 h。條帶10磷酸化水平隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)逐漸升高。條帶8、12、13、17在整個(gè)貯藏期內(nèi)磷酸化水平均處于較穩(wěn)定狀態(tài)。另外，冷藏組條帶11、17的磷酸化水平顯著高于冰溫組（＜0.05），而冰溫組條帶6、13、14、15、16的磷酸化水平顯著高于冷藏組（＜0.05）。

2.3 肌漿蛋白整體磷酸化水平隨貯藏時(shí)間的變化

對(duì)圖2中電泳圖譜進(jìn)行灰度值分析，不同貯藏處理組的整體磷酸化水平如圖3所示。從圖中可知，宰后冷藏組肌漿蛋白磷酸化水平呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，冰溫組在宰后0.5—24 h時(shí)磷酸化水平降低，隨后上升。冷藏組肌漿蛋白最高磷酸化水平出現(xiàn)在貯藏第3天，而冰溫組肌漿蛋白磷酸化水平最高值出現(xiàn)在宰后0.5 h及第5天。其中在貯藏第12、24 h及第3天時(shí)，冷藏組肌漿蛋白整體磷酸化水平均顯著高于冰溫組（＜0.05），貯藏第9天時(shí)冰溫組肌漿蛋白磷酸化水平顯著高于冷藏組（＜0.05）。

不同小寫(xiě)字母表示冷藏條件不同貯藏時(shí)間之間存在差異顯著（P＜0.05）；不同大寫(xiě)字母表示冰溫條件不同貯藏時(shí)間之間存在差異顯著（P＜0.05）；*表示不同溫度處理間差異顯著（P＜0.05）。下同

a：磷酸化肌漿蛋白；b：全肌漿蛋白 a: Image of phosphoproteins stained with Pro-Q Diamond; b:Image of total proteins stained with SYPRO Ruby

表1 不同貯藏條件對(duì)肌漿蛋白磷酸化水平的影響

表中各條帶的磷酸化水平（P/T）均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。不同小寫(xiě)字母表示同一條帶不同處理間差異顯著（＜0.05）。下同

Phosphorylation level of each band is expressed as the mean±standard error. Different small letters represent significant difference (＜0.05). The same as below

圖3 冷藏、冰溫貯藏過(guò)程中肌漿蛋白整體磷酸化水平分析

2.4 肌原纖維蛋白各蛋白條帶磷酸化水平分析

冰溫貯藏組及冷藏組在宰后0.5 h、12 h、24 h、3 d、5 d、9 d的肌原纖維蛋白SDS-PAGE電泳圖如圖4-a、4-b所示，其中圖4-a為Pro-Q Diamond 染色的磷酸化蛋白，圖4-b為SYPRO染色的全肌原纖維蛋白。對(duì)圖4中20個(gè)蛋白條帶逐個(gè)進(jìn)行分析，結(jié)果如表2所示。不同貯藏溫度對(duì)所有肌原纖維蛋白條帶的磷酸化水平均產(chǎn)生極顯著影響（＜0.001），不同貯藏時(shí)間對(duì)所有的肌原纖維蛋白條帶的磷酸化水平產(chǎn)生顯著影響作用（＜0.05），貯藏溫度與貯藏時(shí)間的交互作用對(duì)條帶2、3、4、5、7、8、9、10、13、14、15、17、18、20的磷酸化水平有顯著影響作用（＜0.05）。其中，條帶10的磷酸化水平隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸減低。條帶8的磷酸化水平在貯藏期內(nèi)先降低后升高，最小值出現(xiàn)在第12 h。條帶9、11、16、20的磷酸化水平隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)先升高后降低，最大值分別出現(xiàn)在第24 h、第12 h、第5天、第24 h。條帶1、3、4、14的磷酸化水平均在貯藏第12 h達(dá)到最大值，條帶15、17的磷酸化水平在貯藏第5天達(dá)到最大值。另外，冷藏組條帶2、7、8、9、12、14、15、18的磷酸化水平顯著高于（＜0.05）冰溫組，而條帶1、4、10、11、16、19在冰溫組的磷酸化水平顯著高于（＜0.05）冷藏組，說(shuō)明在不同貯藏條件下，肌原纖維蛋白各蛋白條帶的磷酸化水平變化并不一致。

a：磷酸化肌原纖維蛋白；b：全肌原纖維蛋白 a: Image of phosphoproteins stained with Pro-Q Diamond; b: Image of total proteins stained with SYPRO Ruby

表2 不同貯藏條件對(duì)肌原纖維蛋白磷酸化水平的影響

2.5 肌原纖維蛋白整體磷酸化水平隨貯藏時(shí)間的變化

對(duì)圖4中電泳圖譜進(jìn)行灰度值分析，不同貯藏處理組的整體磷酸化水平如圖5所示，宰后羊肉肌原纖維蛋白整體磷酸化水平在冰溫貯藏組與冷藏組中均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，其中冷藏組在宰后24 h時(shí)達(dá)到最大磷酸化水平，冰溫貯藏組在宰后12 h達(dá)到最大磷酸化水平，且從貯藏24 h開(kāi)始至貯藏期結(jié)束，冷藏組肌原纖維蛋白整體磷酸化水平均顯著高于冰溫組（＜0.05）。

圖5 冷藏、冰溫貯藏過(guò)程中肌原纖維蛋白整體磷酸化水平分析

3 討論

3.1 不同貯藏處理對(duì)蛋白激酶活性的影響

蛋白激酶是一類能夠催化蛋白質(zhì)磷酸化反應(yīng)的酶，它們幾乎在每一個(gè)細(xì)胞功能中都起著重要作用[16]。所有的蛋白激酶都處于基態(tài)，在需要時(shí)被不同的刺激因素激活，進(jìn)而催化某些蛋白質(zhì)的磷酸化反應(yīng)并激活磷酸酶[17]。SHEN等[8]的研究表明，PSE肉中AMP激活性蛋白激酶（AMPK）在宰后早期被激活并在0.5 h酶活性最高，隨后逐漸降低，而正常豬肉中AMPK酶活性在宰后1 h最高，說(shuō)明AMPK活性對(duì)宰后肉品質(zhì)存在影響。AMPK在宰后糖酵解進(jìn)程及PSE肉的形成中起關(guān)鍵，宰后早期ATP的消耗與AMP的生成使AMPK被激活，導(dǎo)致肌肉pH快速下降，在豬肉中則表現(xiàn)為PSE肉的形成[18-20]。李培迪等[6]研究發(fā)現(xiàn)，冰溫貯藏的肌肉較冷藏晚4 d達(dá)到其極限pH。本研究中，冰溫條件下蛋白激酶活性的激活滯后于冷藏，結(jié)合李培迪的研究，可以從新的角度揭示冰溫貯藏條件下肌肉達(dá)到極限pH所需時(shí)間較長(zhǎng)的原因。

3.2 不同貯藏處理對(duì)肌漿蛋白磷酸化水平的影響

糖酵解作為宰后肌肉最主要的供能方式，與肌肉肉色、pH、系水力及肌肉僵直都有直接關(guān)系，肌漿蛋白中糖酵解酶占三分之二以上[21]。宰后肌肉中ATP大量消耗導(dǎo)致糖酵解速率加快，pH快速下降，這將會(huì)加速僵直現(xiàn)象的出現(xiàn)，促進(jìn)成熟，減少僵直總時(shí)間[22-23]。另有研究表明，蛋白質(zhì)磷酸化在調(diào)節(jié)糖酵解酶活性方面發(fā)揮著重要作用[3]，因此，選擇宰后羊肉的肌漿蛋白來(lái)檢測(cè)并分析其磷酸化水平在不同貯藏條件下6個(gè)貯藏時(shí)間點(diǎn)的變化。

貯藏12 h至3 d時(shí)，冷藏組肌漿蛋白整體磷酸化水平高于冰溫組，而第9天時(shí)冰溫組高于冷藏組（圖3），原因可能是貯藏初期冷藏組蛋白激酶活性高于冰溫組（圖1），催化肌漿蛋白發(fā)生磷酸化反應(yīng)的程度較強(qiáng)，而隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，冷藏組由于糖酵解速率快[6]，ATP消耗較快、含量降低，導(dǎo)致ATP依賴性蛋白激酶活性降低[24]，肌漿蛋白磷酸化反應(yīng)程度降低，磷酸化水平不再升高。相反，冰溫貯藏有利于維持蛋白激酶活性，進(jìn)而促進(jìn)肌漿蛋白整體磷酸化水平的穩(wěn)定。即使冷藏有利于肌漿蛋白整體磷酸化水平的提高，但并不是所有的冷藏處理組所有的肌漿蛋白磷酸化水平均高于冰溫貯藏組。肌漿蛋白整體磷酸化水平受貯藏條件、貯藏時(shí)間及貯藏條件與貯藏時(shí)間的交互作用共同影響。

HUANG等[3]的質(zhì)譜鑒定結(jié)果顯示，條帶3主要為糖原磷酸化酶，有研究表明糖原磷酸化酶等大多數(shù)糖酵解酶都可以在體外被不同激酶催化發(fā)生磷酸化反應(yīng)，反應(yīng)后酶活性或其穩(wěn)定性增強(qiáng)，進(jìn)而加速糖酵解進(jìn)程[25-26]，本研究中，冷藏組糖原磷酸化酶磷酸化水平高于冰溫組，因此推測(cè)冰溫貯藏會(huì)通過(guò)下調(diào)糖原磷酸化酶的磷酸化水平而使其活性降低，從而延緩糖酵解。條帶4主要為磷酸果糖激酶，磷酸果糖激酶是糖酵解作用的限速酶，其發(fā)生磷酸化反應(yīng)后活性下降，減少了2,6-二磷酸果糖的產(chǎn)生，從而抑制糖酵解進(jìn)程，減緩肌肉pH下降速率，本試驗(yàn)結(jié)果為冰溫組磷酸果糖激酶磷酸化水平高于冷藏組，所以冰溫貯藏有利于通過(guò)上調(diào)磷酸果糖激酶磷酸化水平而使其活性升高，對(duì)糖酵解進(jìn)程起到限制作用。條帶7主要為丙酮酸激酶，其為糖酵解途徑的限速酶，可催化磷酸稀醇丙酮酸向丙酮酸轉(zhuǎn)化，進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗?，本研究結(jié)果為冷藏組丙酮酸激酶磷酸化水平高于冰溫組，此外，李培迪等[6]的研究表明，冰溫貯藏可上調(diào)丙酮酸激酶活力，同時(shí)延緩肌肉達(dá)到極限pH的時(shí)間，因此，認(rèn)為冰溫貯藏可通過(guò)調(diào)控肌肉中糖酵解酶的活性來(lái)影響其成熟進(jìn)程。但另有研究表明，AMPK會(huì)抑制L-丙酮酸激酶的活性，從而抑制糖酵解，說(shuō)明丙酮酸激酶通過(guò)多個(gè)途徑影響糖酵解進(jìn)程。條帶8可能為AMPK，AMPK的激活會(huì)引起磷酸果糖激酶2的磷酸化反應(yīng)，本試驗(yàn)結(jié)果為冰溫組AMPK磷酸化水平高于冷藏組，說(shuō)明冰溫條件更有利于AMPK催化磷酸果糖激酶發(fā)生磷酸化反應(yīng)，這也是冰溫組磷酸果糖激酶磷酸化水平高于冷藏組的原因。條帶13主要為乳酸脫氫酶，乳酸脫氫酶能夠可逆地催化并氧化L-乳酸生成丙酮酸，李培迪[6]的研究表明冰溫貯藏下調(diào)乳酸脫氫酶活力，本研究中，冰溫貯藏中乳酸脫氫酶磷酸化水平低于冷藏條件中其磷酸化水平，因此認(rèn)為冰溫貯藏能夠通過(guò)調(diào)控乳酸脫氫酶磷酸化水平而影響其活性，進(jìn)而影響糖酵解。條帶14可能為熱休克蛋白27，該蛋白是涉及細(xì)胞生長(zhǎng)及細(xì)胞凋亡等功能的重要蛋白，當(dāng)細(xì)胞受到脅迫，熱休克蛋白27表達(dá)量將增加，且會(huì)被磷酸化從而具有活性，行使保護(hù)肌動(dòng)蛋白的功能，阻礙肌動(dòng)蛋白與肌球蛋白的結(jié)合，進(jìn)而影響嫩度，本試驗(yàn)中，冰溫組熱休克蛋白27的磷酸化水平高于冷藏組，說(shuō)明冰溫條件能夠上調(diào)熱休克蛋白27的磷酸化水平使其對(duì)肉品嫩度的調(diào)控作用發(fā)生改變。另外，REISS[27]、SALE[28]等的研究都表明豬背最長(zhǎng)肌中的丙酮酸激酶、磷酸果糖激酶等糖酵解酶的活性均受自身磷酸化程度的影響，它們發(fā)生磷酸化反應(yīng)后更加活躍，從而加快肌肉的糖酵解反應(yīng)。因此，本研究結(jié)果表明，肌肉中各種糖酵解酶的磷酸化水平受冰溫貯藏調(diào)控，導(dǎo)致其活性受到影響，進(jìn)而通過(guò)影響宰后糖酵解進(jìn)程調(diào)控肉品品質(zhì)。

3.3 不同貯藏處理對(duì)肌原纖維蛋白磷酸化水平的影響

肌原纖維蛋白是骨骼肌蛋白中含量最多的蛋白，其含量占蛋白總量的55%—60%，肌原纖維蛋白與肌肉收縮特性相關(guān)，并且與肌肉功能特性及原料肉烹飪特性之間均存在很大聯(lián)系[29]。Heeley[10]、Mazzei[11]、Ryder[12]等學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，肌間線蛋白、肌鈣蛋白、肌動(dòng)蛋白、原肌球蛋白及肌球蛋白輕鏈等多種肌原纖維蛋白都會(huì)發(fā)生蛋白質(zhì)磷酸化反應(yīng)。結(jié)合筆者課題組[30]及Huang等[9]的質(zhì)譜試驗(yàn)結(jié)果，本試驗(yàn)選擇了分析部分重要肌原纖維蛋白條帶的磷酸化水平。

條帶3中主要為肌球蛋白結(jié)合蛋白C，研究表明肌球蛋白結(jié)合蛋白C能夠在蛋白激酶C作用下發(fā)生磷酸化反應(yīng)，磷酸化的肌球蛋白結(jié)合蛋白C與肌動(dòng)蛋白的相互作用將會(huì)減弱，不利于肌肉收縮[31]，有利于肌肉嫩化，本試驗(yàn)結(jié)果為冷藏組蛋白激酶C磷酸化水平高于冷藏組，說(shuō)明冰溫貯藏可通過(guò)下調(diào)肌球蛋白結(jié)合蛋白C的磷酸化水平來(lái)延緩肌肉成熟。條帶8、9可能為原肌球蛋白，原肌球蛋白主要功能為調(diào)控肌球蛋白與肌動(dòng)蛋白之間的相互作用，WU等[32]研究表明蛋白激酶C可使原肌球蛋白的絲氨酸位點(diǎn)發(fā)生磷酸化反應(yīng)，從而提高其磷酸化水平，本研究結(jié)果為，冷藏組原肌球蛋白磷酸化水平高于冰溫組，說(shuō)明冰溫貯藏可能會(huì)通過(guò)影響原肌球蛋白的磷酸化水平而調(diào)控肌肉收縮。條帶10與條帶11可能為肌鈣蛋白T3（TNNT3）與肌鈣蛋白T1（TNNT1），肌鈣蛋白是肌肉中主要的調(diào)節(jié)蛋白，直接參與鈣離子調(diào)控的肌肉收縮[33-34]，MOIR等[33]研究發(fā)現(xiàn)，肌鈣蛋白T激酶、磷酸化酶b激酶、酪蛋白激酶TS以及Ca2＋依賴性磷脂敏感蛋白激酶均可使肌鈣蛋白T發(fā)生磷酸化反應(yīng)，本研究中冰溫組條帶10、條帶11的磷酸化水平均高于冷藏組，說(shuō)明相較于冷藏，冰溫貯藏可上調(diào)肌鈣蛋白T的磷酸化水平，對(duì)肌肉收縮的強(qiáng)度與速度產(chǎn)生重要影響。條帶16可能為肌鈣蛋白I，ENGLAND[35]的研究表明，肌鈣蛋白I的磷酸化現(xiàn)象能夠促進(jìn)肌肉收縮，本試驗(yàn)中冰溫組條帶16的磷酸化水平高于冷藏組，說(shuō)明冰溫條件更有利于肌鈣蛋白I磷酸化水平的升高，有利于其對(duì)肌肉收縮的促進(jìn)作用。條帶20為肌球蛋白輕鏈2，STULL等[36]發(fā)現(xiàn)肌球蛋白輕鏈的磷酸化會(huì)引起肌球蛋白的結(jié)構(gòu)改變，由此增加肌球蛋白的收縮強(qiáng)度，本試驗(yàn)中冰溫組肌球蛋白輕鏈2磷酸化水平高于冷藏組，因此冰溫貯藏引起肌球蛋白輕鏈磷酸化水平的升高，從而增強(qiáng)肌球蛋白的收縮。綜上所述，冰溫貯藏可通過(guò)影響肌原纖維蛋白中肌肉收縮相關(guān)主要蛋白的磷酸化水平，而影響肌肉收縮的速度與強(qiáng)度，從而調(diào)控肉品質(zhì)。

4 結(jié)論

冰溫及冷藏條件下蛋白激酶活性均隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，但降低的程度不同，貯藏12 h—9 d時(shí)，冷藏組蛋白激酶活性始終顯著低于冰溫組。冷藏組肌漿蛋白整體磷酸化水平最大值出現(xiàn)在貯藏第3天，冰溫組出現(xiàn)在第5天，且在貯藏早期（12 h—3 d）冷藏組顯著高于冰溫組，貯藏9 d時(shí)冰溫組顯著高于冷藏組。冷藏組肌原纖維蛋白整體磷酸化水平在貯藏24 h時(shí)達(dá)到最大值，冰溫組最大值則出現(xiàn)在12 h。綜上所述，冰溫貯藏有利于降低蛋白質(zhì)磷酸化水平，從而間接調(diào)控肉品質(zhì)，可為宰后貯藏條件的優(yōu)化提供參考。

References

[1] 孫天利. 冰溫保鮮技術(shù)對(duì)牛肉品質(zhì)的影響研究[D]. 沈陽(yáng): 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué), 2013.

Sun T L. Influences of controlled freezing point storage on beef [D]. Shenyang: Shenyang Agricultural University, 2013. (in Chinese)

[2] 錢(qián)小紅, 賀福初. 蛋白質(zhì)組學(xué): 理論與方法. 北京: 北京科學(xué)出版社, 2003.

Qian X H, He F C.. Beijing: Beijing Science Press, 2003. (in Chinese)

[3] Huang H G, Larsen M R, Karlsson A H, Pomponio L, Costa L N, Lametsch R. Gel-based phosphoproteomics analysis of sarcoplasmic proteins in postmortem porcine muscle with pH decline rate and time differences., 2011, 11(20): 4063-4076.

[4] Gannon J, Staunton L, O’ connell K, Doran P, Ohlendieck K. Phosphoproteomic analysis of aged skeletal muscle., 2008, 22(1): 33-42.

[5] DOUMIT M E, BATES R O. Regulation of pork water holding capacity, color, and tenderness by protein phosphorylation., 2000, 63(1): 17-22.

[6] 李培迪, 李欣, 李錚, 陳麗, 李仲文, 陳麗娟, 田建文, 張德權(quán). 冰溫貯藏對(duì)宰后肌肉成熟進(jìn)程的影響. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2016, 49(3): 554-562.

Li P D, Li X, Li Z, Chen L, Li Z W, Chen L J, Tian J W, Zhang D Q. Effects of controlled freezing point storage on aging from muscle to meat., 2016, 49(3): 554-562. (in Chinese)

[7] ANDERSON M J, LONERGAN S M, Huff-LONERGAN E. Differences in phosphorylation of phosphoglucomutase 1 in beef steaks from the longissimus dorsi with high or low star probe values., 2014, 96(1): 379-384.

[8] SHEN Q W, MEANS W J, UNDERWOOD K R, THOMPSON S A, ZHU M J, MCCORMICK R J, FORD S P, ELLIS M, DU M. Early post-mortem AMP-activated protein kinase (AMPK) activation leads to phosphofructokinase-2 and -1 (PFK-2 and PFK-1) phosphorylation and the development of pale, soft, and exudative (PSE) conditions in porcine longissimus muscle., 2006, 54(15): 5583-5589.

[9] HUANG H G, LARSEN M R, LAMETSCH R. Changes in phosphorylation of myofibrillar proteins during postmortem development of porcine muscle., 2012, 134(4): 1999-2006.

[10] HEELEY D H, WATSEN M H, MAK A S, DUBORD P, SMILLI L B. Effect of phosphorylation on the interaction and functional properties of rabbit striated-muscle alpha-alpha-tropomyosin., 1989, 264(5): 2424-2430.

[11] MAZZEI G J, KUO J F. Phosphorylation of skeletal-muscle troponin I and troponin T by phospholipid-sensitive Ca2+-dependent protein kinase and its inhibition by troponin C and tropomyosin., 1984, 218(2): 361-369.

[12] RYDER J W, LAU K S, KAMM K E, STULL J T. Enhanced skeletal muscle contraction with myosin light chain phosphorylation by a calmodulin-sensing kinase., 2007, 282(28): 20447-20454.

[13] 尹靖東. 動(dòng)物肌肉生物學(xué)與肉品科學(xué). 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社, 2011.

Yin J D.. Beijing: China Agricultural University Press, 2011. (in Chinese)

[14] LAMETSCH R, KRISTENSEN L, LARSEN M R, THERKIDSEN M, OKSBIERG N, ERTBJERG P. Changes in the muscle proteome after compensatory growth in pigs., 2006, 84: 918-924.

[15] SMUDER A J, KAVAZIS A N, HUDSON M B, NELSON W B, POWER S K. Oxidation enhances myofibrillar protein degradation via calpain and caspase-3., 2010, 49(7): 1152-1160.

[16] MANNING G, WHYTE D B, MARTINEZ R, HUNTER T, SUDARSANAM S. The protein kinase complement of the human genome., 2002, 298(5600): 1912-1934.

[17] ROBERT R J. A historical overview of protein kinases and their targeted small molecule inhibitors., 2015, 7(10): 1-23.

[18] BARON S J, LI J, RUSSELL 3rd R R, NEUMANN D, MILLER E J, TUERK R, WALLIMANN T, HURLEY R L, WITTERS L A, YOUNG L H. Dual mechanisms regulating AMPK kinase action in the ischemic heart., 2005, 96(3): 337-345.

[19] HWANG J T, HA J, PARK O J. Combination of 5-fluorouracil and genistein induces apoptosis synergistically in chemo-resistant cancer cells through the modulation of AMPK and COX-2 signaling pathways., 2005, 332(2): 433-440.

[20] HWANG J T, LEE M, JUNG S N, LEE H J, KANG I, KIM S S, HA J. AMP-activated protein kinase activity is required for vanadate- induced hypoxia-inducible factor 1alpha expression in DU145 cells., 2004, 25(12): 2497-2507.

[21] HAWLEY S A, PAN D A, MUSTARD K J, ROSS L, BAIN J, EDELMAN A M, FRENGUELLI B G, HARDIE D G. Calmodulin- dependent protein kinase kinase-beta is an alternative upstream kinase for AMP-activated protein kinase., 2005, 2(1): 9-19.

[22] WOODS A, DICKERSON K, HEATH R, HONG S P, MIMCILOVIC M, JOHNSTONE SR, CARLSON M, CARLING D. Ca2+/ calmodulin-dependent protein kinase kinase-beta acts upstream of AMP-activated protein kinase in mammalian cells., 2005, 2(1): 21-33.

[23] SCOPES, R K, STOTER A. Purification of all glycolytic enzymes from one muscle extract., 1982, 90: 479-490.

[24] DICKENS J A, LYON C E. The effects of electric stimulation and extended chilling times on the biochemical reactions and texture of cooked broiler breast meat., 1995, 74(12): 2035-2040.

[25] SAVELL J W, MUELLER S L, BAIRD B E. The chilling of carcasses., 2005, 70(3): 449-459.

[26] WALSH D A, PERKINS J P, KREBS E G. An adenosine 3’,5’-monophosphatedependant protein kinase from rabbit skeletal muscle., 1968, 243(13): 3763-3774.

[27] REISS N, KANETY H, SCHLESSINGER J. Five enzymes of the glycolytic pathway serve as substrates for purified epidermal- growth-factor-receptor kinase., 1986, 239(3): 691-697.

[28] SALE E M, WHITE M F, KAHN C R. Phosphorylation of glycolytic and gluconeogenic enzymes by the insulin receptor kinase., 1987, 33(1): 15-26.

[29] LEE S H, JOO S T, RYU Y C. Skeletal muscle fiber type and myofibrillar proteins in relation to meat quality., 2010, 86(1): 166-170.

[30] CHEN L J, LI X, NI N, LIU Y, CHEN L, WANG Z Y, SHEN Q W, ZHANG D Q. Phosphorylation of myofibrillar proteins in post- mortem ovine muscle with different tenderness., 2016, 96(5): 1474-1483.

[31] WANG L, SADAYAPPANAPPAN S, KAWAI M. CARDIAC. Myosin binding protein C phosphorylation affects cross-bridge cycle’s elementary steps in a site-specific manner., 2014, 9(11): e113417.

[32] WU S C, SOLARO R J. Protein kinase C zeta. A novel regulator of both phosphorylation and de-phosphorylation of cardiac sarcomeric proteins., 2007, 282(42): 30691-30698.

[33] MOIR A J, PERRY S V. The sites of phosphorylation of rabbit cardiac troponin I by adenosine 3’,5’-cyclic monophosphate-dependent protein kinase: Effect of interaction with troponin C., 1977, 167(2): 333-343.

[34] PINNA L A, MEGGIO F, DEDIUKINA M M. Phosphorylation of troponin T by casein kinase TS., 1981, 100(1): 449-454.

[35] ENGLAND P J. Correlation between contraction and phosphorylation of the inhibitory subunit of troponin in perfused rat heart., 1975, 50(1): 57-60.

[36] STULL J T, KAMM K E, VANDENBOOM R. Myosin light chain kinase and the role of myosin light chain phosphorylation in skeletal muscle., 2011, 510(2): 120-128.

（責(zé)任編輯 趙伶俐）

Effects of Controlled Freezing Point Storage on the Protein Phosphorylation Level

ZHANG Yan1,2, LI Xin2, LI Zheng2, LI Meng2, LIU Yong-feng1, ZHANG De-quan2

(1College of Food Engineering and Nutritional Science, Shaanxi Normal University, Xi’an 710119;2Institute of Food Science and Technology, Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Agro-Products Processing, Ministry of Agriculture, Beijing 100193)

【Objective】 The aim of this study was to investigate the effect of controlled freezing point on protein phosphorylation level, so as to provide a new theoretical basis for controlling meat quality by controlled freezing point. 【Method】 The longissimus doris (LD) of large tail×small tail crossed sheep were obtained and divided into two groups: refrigeration group and controlled freezing point group. Each LD was assigned to 6 storage times (0.5 h, 12 h, 24 h, 3 d, 5 d and 9 d). Kit for protein kinase activity measurement and enzyme linked immunosorbent assay were applied to detect protein kinase activity. A gel-based phosphoproteomic study was performed. And SDS-PAGE electrophoresis and fluorescence staining were applied to gain the protein bands of sarcoplasmic proteins and myofibrillar proteins stained by SYPRO Ruby and Pro-Q Diamond. A software named Quantity One was used to analyze the protein phosphorylation level by measuring the fluorescence intensity.【Result】 At 12 h, the protein kinase activity of controlled freezing point group significantly increased (＜0.05) and that of refrigeration group significantly decreased. The protein kinase activity of the two groups were reduced from 12h to 9 d, which was significantly higher in controlled freezing group compared with refrigeration group (＜0.05). Seventeen protein bands distributed from 15-250 kDa in each sarcoplasmic protein sample were analyzed and the results suggested that storage temperature influenced (<0.001) the protein phosphorylation level of all sarcoplasmic proteins significantly. The total phosphorylation level of sarcoplasmic proteins in refrigeration group increased at first and then decreased while the sarcoplasmic proteins in controlled freezing point group showed an opposite variation trend. The phosphorylation level of 3 d was the highest, while the lowest was 24 h. Globally, the sarcoplasmic proteins of refrigeration group had the higher total phosphorylation level than controlled freezing point group during 12 h to 3 d. However, the total phosphorylation level of the sarcoplasmic proteins of controlled freezing point was higher than refrigeration group on 9 d. Twenty protein bands distributed from 15-250 kDa in each myofibrillar protein sample were analyzed and the results suggested storage temperature influenced the protein phosphorylation level of all myofibrillar proteins very significantly (<0.001). The total phosphorylation level of myofibrillar proteins increased firstly and then decreased in two groups. And the highest phosphorylation level of 24 h in refrigeration group and 12 h in controlled freezing point group was the highest. Total phosphorylation level of myofibrillar protein had no significant difference between two groups from 0.5 h to 12 h. However, total phosphorylation level of myofibrillar protein was higher in refrigeration group compared with controlled freezing group from 24 h to the end of storage.【Conclusion】 The controlled freezing point storage regulated the phosphorylation level of protein by affecting the activity of protein kinase, which can indirectly regulate the meat quality by influencing the glycometabolism, muscle contraction and degradation of skeleton protein.

controlled freezing point; protein kinase; sarcoplasmic proteins; myofibrillar proteins; protein phosphorylation

2016-04-18；接受日期：2016-07-29

國(guó)家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201303083）、國(guó)家農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程、陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新計(jì)劃（2015KTTSNY04-07）

張艷，E-mail：zhangwen2255@126.com。通信作者劉永峰，E-mail：yongfeng200@126.com。通信作者張德權(quán)，E-mail：dequan_zhang0118 @126.com