猴頭菌子實(shí)體與菌絲體粗多糖理化性質(zhì)及抗胃粘膜細(xì)胞氧化活性比較

肖旭朗，薛德冬，張 薇，張洪賀，高 陽(yáng)，徐多多，王明星*

(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130117；2.山東省東營(yíng)市勝利醫(yī)院藥劑科，山東東營(yíng) 257000；3.長(zhǎng)春銀諾克藥業(yè)有限公司，吉林長(zhǎng)春 130000)

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猴頭菌子實(shí)體與菌絲體粗多糖理化性質(zhì)及抗胃粘膜細(xì)胞氧化活性比較

肖旭朗1，薛德冬2，張 薇3，張洪賀1，高 陽(yáng)1，徐多多1，王明星1*

(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130117；2.山東省東營(yíng)市勝利醫(yī)院藥劑科，山東東營(yíng) 257000；3.長(zhǎng)春銀諾克藥業(yè)有限公司，吉林長(zhǎng)春 130000)

[目的]比較猴頭菌子實(shí)體、菌絲體粗提物理化性質(zhì)，以及2組粗多糖對(duì)胃粘膜上皮細(xì)胞氧化模型保護(hù)能力的差異。[方法]采用水提醇沉法提取粗多糖，用苯酚-濃硫酸法測(cè)定葡萄糖含量、間羥基聯(lián)苯法測(cè)糖醛酸含量、BCA法測(cè)量蛋白質(zhì)含量。每組分別加入一定濃度的含粗多糖的培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)12、24、48 h后加入含過(guò)氧化氫培養(yǎng)基。用MTT法測(cè)細(xì)胞活度。[結(jié)果]猴頭菌菌絲體、子實(shí)體粗多糖中葡萄糖含量分別為49.5%、44.5%，糖醛酸含量分別為22.01%、29.23%，蛋白質(zhì)含量分別為27.69%、23.54%。菌絲體組12、24、48 h抑制率分別為75.1%、68.1%、16.9%；子實(shí)體組分別為70.2%、61.8%、16.7%。[結(jié)論]猴頭菌菌絲體與子實(shí)體粗多糖中糖醛酸、葡萄糖、蛋白質(zhì)含量相近。子實(shí)體粗多糖比菌絲體粗多糖抗氧化活性短時(shí)間內(nèi)略強(qiáng)，長(zhǎng)時(shí)間無(wú)差異。

猴頭菌菌絲體；猴頭菌子實(shí)體；理化性質(zhì)；胃粘膜細(xì)胞；抗氧化

猴頭菌(HericiumErinaceusPers．)屬擔(dān)子菌綱多孔菌目齒菌科猴頭屬，是一種珍貴的藥食兩用真菌，其性平、味甘，助消化、利五臟，自古以來(lái)被譽(yù)為“山珍”。猴頭菌富含多種營(yíng)養(yǎng)成分，據(jù)近現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，其活性成分主要有多糖、脂肪酸、甾醇、酚類等，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明其具有保肝護(hù)胃[1]、增強(qiáng)人體免疫力[2]、降血糖[3]、抗癌[4]、抗氧化[5]等功效。我國(guó)現(xiàn)有以猴頭菌為原料治療萎縮性胃炎及胃穿孔的藥品，但制備工藝簡(jiǎn)單、有效成分不清楚、作用機(jī)理不明確。另外，猴頭菌菌絲體與子實(shí)體均能入藥，但兩者成分的差異及其抗胃粘膜氧化活性差異目前尚無(wú)相關(guān)研究。為此，筆者采用水提醇沉法提取大分子化合物，用苯酚-濃硫酸法、間羥基聯(lián)苯法、BCA法測(cè)定猴頭菌子實(shí)體及菌絲體中粗多糖理化性質(zhì)，用過(guò)氧化氫制造胃粘膜氧化應(yīng)激模型，并用MTT法比較兩者抗氧化能力，研究猴頭菌子實(shí)體與菌絲體粗多糖理化性質(zhì)及抗胃粘膜氧化活性差異。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1原材料。猴頭菌子實(shí)體，購(gòu)于北京同仁堂長(zhǎng)春藥店；猴頭菌菌絲體，產(chǎn)自山西康欣藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字 H14023098；GES-1細(xì)胞來(lái)源于中科院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2主要試劑。DMEM-高糖、胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Gibco；標(biāo)準(zhǔn)品葡萄糖、葡萄糖醛酸購(gòu)于美國(guó)Sigma；苯酚、硫酸，分析純，北京化工廠；BCA試劑盒、MTT，上海碧云天生物試劑有限公司；H2O2，美國(guó)Fisher。

1.1.3主要儀器。UV-752紫外分光光度計(jì)，上海第三分析儀器廠；MK-3酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo；實(shí)驗(yàn)室專用超純水機(jī)，Millipore公司；二氧化碳培養(yǎng)箱，日本三洋電器。

1.2方法

1.2.1猴頭菌粗多糖提取。

1.2.1.1子實(shí)體粗多糖提取。猴頭菌干燥子實(shí)體切制，加5倍體積蒸餾水，煮沸持續(xù)3 h后濾出殘?jiān)?，殘?jiān)偌尤?倍體積水持續(xù)煮沸3 h，合并煎煮液后濃縮至粘稠，冷卻后加95%乙醇至藥液濃度為80%沉降8～12 h。取出沉淀冷凍干燥。

1.2.1.2菌絲體粗多糖提取。猴頭菌菌絲體粉末，加入3倍體積水于70 ℃水浴中溫浸12 h，離心，將沉淀中加入1倍水于70 ℃水浴中溫浸8 h合并溫浸液，濃縮至粘稠，加95%乙醇使藥液濃度到80%沉降8～12 h。取出沉淀冷凍干燥。

1.2.2總糖含量測(cè)定。

1.2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。將葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品置于含五氧化二磷的保干器中干燥至恒重，精密稱取10 mg，置于100 mL容量瓶中，加蒸餾水定容，振蕩搖勻配制成100 μg/mL的葡萄糖對(duì)照品溶液。吸取葡萄糖對(duì)照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置于試管中，向各試管中加蒸餾水補(bǔ)足到1.0 mL，再分別向其中加入5%苯酚水溶液1.0 mL，渦流振蕩，再加入濃硫酸5 mL，振蕩均勻后冷卻至室溫，于490 nm處測(cè)定吸光度值[6]。以葡萄糖質(zhì)量為橫坐標(biāo)、吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性回歸方程。

1.2.2.2樣品含量測(cè)定。精密稱取“1.2.1”中干燥后粉碎的2種樣品各3份，每份約20.00 mg，置于100 mL容量瓶中，加蒸餾水定容，依次吸取1 mL于6支試管中，重復(fù)“1.2.2.1”操作測(cè)吸光度值，根據(jù)回歸曲線計(jì)算總糖的含量。

1.2.3糖醛酸含量測(cè)定。

1.2.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。將葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品置于含五氧化二磷的保干器中干燥至恒重，精密稱取25 mg，置于50 mL容量瓶中，加蒸餾水定容，振蕩搖勻后取出10 mL定容至100 mL，配制成50 μg/mL的葡萄糖醛酸對(duì)照品溶液。精密吸取葡萄糖對(duì)照品溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4 mL，分別置于試管中，向各試管中加蒸餾水補(bǔ)足至0.4 mL，于冰水浴中加入2.4 mL 0.0125 mol/L的四硼酸鈉-硫酸溶液，再置于沸水浴中加熱5 min，取出迅速冷卻至室溫，加入0.15%間羥基聯(lián)苯(0.5%NaOH溶液配制)40 μL，立即混勻，于525 nm處測(cè)定吸光度值[7]。以葡萄糖醛酸質(zhì)量為橫坐標(biāo)、吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性回歸方程。

1.2.3.2樣品含量測(cè)定。精密稱取“1.2.1”中2種樣品各約25 mg，置于25 mL容量瓶中，加蒸餾水定容，各取6支試管，每支精密吸取400 μL?！?.2.3.1”方法測(cè)吸光度值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出實(shí)際含糖醛酸的含量。

1.2.4蛋白質(zhì)含量測(cè)定。

1.2.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。取BCA試劑盒中標(biāo)準(zhǔn)品10 μL，加90 μL PBS使標(biāo)準(zhǔn)品終濃度為0.5 μg/μL，在96孔板中分別加0、1、2、8、12、16、20 μL，再在各孔中加入PBS補(bǔ)足至20 μL，工作液A∶B按1∶50比例配置好混勻，每孔加入200 μL，于60 ℃反應(yīng)30 min，在595 nm處測(cè)吸光度值[7]。以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量(μg)為橫坐標(biāo)、吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性回歸方程。

1.2.4.2樣品含量測(cè)定。將“1.2.1”中2種樣品精密稱量各約50 mL，加蒸餾水定容至25 mL，配制成2.0 mg/mL溶液。以“1.2.4.1”方法測(cè)吸光度值，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出蛋白質(zhì)含量。

1.2.5抗氧化活性試驗(yàn)。

1.2.5.1樣品配制。將“1.2.1”中2種樣品各用DMEM-高糖培養(yǎng)基配制成1 mg/mL的供試樣品，在無(wú)菌環(huán)境中用0.22 μm濾器過(guò)濾待用。

1.2.5.2細(xì)胞準(zhǔn)備。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期GES-1細(xì)胞，使細(xì)胞濃度為2×104個(gè)/mL吹吸均勻，將細(xì)胞加入96孔板，每孔100 μL。將細(xì)胞分為空白組、對(duì)照組、菌絲體組、子實(shí)體組。用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后扣去培養(yǎng)基，空白組、對(duì)照組加入無(wú)血清培養(yǎng)基，給藥組分別加入“1.2.5.1”供試樣品100 μL。分別培養(yǎng)12、24、48 h后加入含100 nmol/mL過(guò)氧化氫的DMEM-高糖培養(yǎng)基[8]100 μL培養(yǎng)4 h后扣除培養(yǎng)基，每孔加入含10% MTT試劑100 μL的培養(yǎng)基，30 min后扣除MTT，加入150 μL DMSO在490 nm處測(cè)吸光度值，以空白組為對(duì)照，計(jì)算各處理組細(xì)胞抑制率，公式如下：

2　結(jié)果與分析

2.1總糖含量測(cè)定以葡萄糖質(zhì)量為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)得到線性回歸方程為：y=10.350x-0.002 3(R2=0.999 7)，根據(jù)樣品吸光度計(jì)算菌絲體粗多糖中總糖占樣品質(zhì)量的49.5%，子實(shí)體中總糖含量為44.5%。

2.2糖醛酸含量測(cè)定以糖醛酸質(zhì)量為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)得到線性回歸方程為：y=28.960x-0.009 8(R2=0.998 4)，根據(jù)樣品吸光度計(jì)算得知菌絲體粗多糖中糖醛酸含量為22.01%，子實(shí)體提取物中含29.23%糖醛酸。

2.3蛋白質(zhì)含量測(cè)定根據(jù)蛋白質(zhì)質(zhì)量及相應(yīng)的吸光度值制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性回歸方程為：y=0.035 8x+0.133 0(R2=0.999 3)，測(cè)得樣品中蛋白質(zhì)含量分別為菌絲體中含27.69%、子實(shí)體中含23.54%。

2.4抗氧化活性比較從圖1可看出，12 h時(shí)各組抑制率分別為過(guò)氧化氫組36.8%、菌絲體組75.1%、子實(shí)體組70.2%；24 h時(shí)各組抑制率分別為過(guò)氧化氫組50.2%、菌絲體組68.1%、子實(shí)體組61.8%；48 h時(shí)各組抑制率分別為過(guò)氧化氫組78.6%、菌絲體組16.9%、子實(shí)體組16.7%。

圖1　不同時(shí)間時(shí)過(guò)氧化氫對(duì)細(xì)胞損傷情況Fig.1　Cell damage by hydrogen peroxide in different time periods

3　結(jié)論與討論

該試驗(yàn)結(jié)果顯示，猴頭菌的菌絲體與子實(shí)體粗多糖中成分均以葡萄糖為主，說(shuō)明其抗氧化活性成分主要為多糖，這與黃萍等[1]研究的結(jié)論一致?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，眾多疾病均與過(guò)氧化損傷有一定相關(guān)性，其中包括心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病及消化系統(tǒng)疾病等[4]。猴頭菌子實(shí)體與菌絲體多糖對(duì)胃粘膜上皮細(xì)胞(GES-1細(xì)胞)氧化模型的保護(hù)程度長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)活性相同。猴頭菌子實(shí)體生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，對(duì)環(huán)境要求嚴(yán)格，生產(chǎn)成本較高，如果僅考慮藥用價(jià)值，猴頭菌菌絲體更加經(jīng)濟(jì)合理。菌絲體以發(fā)酵條件溫和、生長(zhǎng)條件較為寬泛，且泛，且生產(chǎn)周期短、單次收獲量較大等優(yōu)勢(shì)已被廣泛關(guān)注。國(guó)內(nèi)外很多藥用菌類均已陸續(xù)發(fā)掘菌絲體的利用價(jià)值，猴頭菌菌絲體的開(kāi)發(fā)前景廣闊，值得引起重視。

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Comparison of Physicochemical Properties betweenHericiumErinaceusMycelium and Fruit Body Crude Polysaccharides and Their Anti-oxidation Effects of Gastric Mucosal Cell

XIAO Xu-lang1, XUE De-dong2, ZHANG Wei3, WANG Ming-xing1*et al

(1. College of Pharmacy, Changchun University of Chinese Medicine, Changchun, Jilin 130117; 2. Pharmacy Department of Shengli Hospital Dongying City, Dongying, Shandong 257000; 3. Changchun Yinnuoke Pharmaceutical Co., Ltd., Changchun, Jilin 130000)

[Objective] To compare the physicochemical properties of crude polysaccharides compare ofHerciumerinaceusmycelium and fruit body, and to compare the differences of the effects of two crude extracts on oxidation protection ability of gastric mucosa epithelial cell. [Method] Crude crude polysaccharides were extracted by water-extraction and alcohol-precipitation method. Glucose content was detected by phenol-sulphuric acid method; uronic acid content was detected by m-hydroxydiphenyl method; and protein content was detected by BCA method. Culture medium containing certain content of polysaccharides compare was added into each group. After cultivated for 12, 24 and 48 h, culture medium containing hydrogen peroxide was added. Viability of cells was detected by MTT. [Result] Glucose contents in mycelium and fruit body were 49.5% and 44.5%, respectively. The uronic acid contents were 22.01% and 29.23%; protein contents were 27.69% and 23.54%.The inhibitory rates of mycelium group at 12, 24 and 48 h were 75.1%, 68.1% and 16.9%, respectively; those of fruit body were 70.2%, 61.8% and 16.7%, respectively. [Conclusion] In the crude crude polysaccharides of mycelium and fruit body ofHerciumerinaceus, contents of uronic acid, glucose and protein are close. Crude polysaccharides of fruit body have stronger antioxidant activity than extracts of mycelium in short term, but there were no differences in long term.

HericiumErinaceusmycelium;Herciumerinaceusfruit body; Physicochemical properties; Gastric mucosal cell; Antioxidant

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30873370)。

肖旭朗(1990- )，女，遼寧沈陽(yáng)人，碩士研究生，研究方向：中藥化學(xué)。*通訊作者，副研究員，博士，碩士生導(dǎo)師，從事多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)分析及藥效機(jī)理研究。

2016-06-27

S 567.3

A

0517-6611(2016)24-123-02