植物乳桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

黃秀敏， 張宜靖， 李學(xué)優(yōu)， 曹 丁， 夏楓耿， 黃魁英， 林盛華

(廣州市微生物研究所，廣東廣州 510663)

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植物乳桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

黃秀敏， 張宜靖， 李學(xué)優(yōu)， 曹 丁， 夏楓耿， 黃魁英， 林盛華

(廣州市微生物研究所，廣東廣州 510663)

[目的]在成功篩選出1株有強(qiáng)產(chǎn)酸能力的植物乳桿菌的基礎(chǔ)上，優(yōu)化其發(fā)酵培養(yǎng)基，以提高其生物量。[方法]使用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)法對(duì)培養(yǎng)基的成分進(jìn)行優(yōu)化。[結(jié)果]優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基為：蔗糖30.00 g/L，酵母浸膏50.00 g/L，無(wú)水乙酸鈉5.00 g/L，磷酸氫二鉀2.00 g/L，檸檬酸氫二銨2.00 g/L，硫酸鎂0.58 g/L，硫酸錳0.25 g/L，吐溫-80 1 mL/L，碳酸鈣2.00 g/L。經(jīng)優(yōu)化后植物乳桿菌發(fā)酵液的OD值從5.701增長(zhǎng)到15.021，活菌數(shù)達(dá)7.1×109cfu/mL。[結(jié)論]優(yōu)化后的植物乳桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基降低了生產(chǎn)成本，為后續(xù)工業(yè)化生產(chǎn)的研究提供了參考。

植物乳桿菌；培養(yǎng)基優(yōu)化；發(fā)酵

乳酸菌細(xì)胞為桿狀或球狀，革蘭氏染色陽(yáng)性，不產(chǎn)生過(guò)氧化氫酶，消耗葡萄糖且50%以上產(chǎn)生乳酸，不形成內(nèi)生孢子，無(wú)運(yùn)動(dòng)性，或僅少數(shù)有運(yùn)動(dòng)性[1]。乳酸菌在自然界分布廣泛，種類繁多，是動(dòng)物胃腸道的優(yōu)勢(shì)菌群，具有調(diào)節(jié)動(dòng)物胃腸道菌群平衡、改善腸道內(nèi)環(huán)境、增強(qiáng)免疫力和抵抗力等多種功能[2-7]。而植物乳桿菌在酸奶、發(fā)酵香腸、面包、泡菜等發(fā)酵食品中常被用于改善食品分類，改進(jìn)食品營(yíng)養(yǎng)狀況，延長(zhǎng)制品的保藏時(shí)間。植物乳桿菌也被大量用于養(yǎng)殖業(yè)中，是最常見(jiàn)的青貯發(fā)酵乳酸菌，還被用作微生態(tài)飼料添加劑。此外，植物乳桿菌也被用作生物防腐劑[8]。筆者對(duì)1株具有強(qiáng)產(chǎn)酸能力的植物乳桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，以期加快植物乳桿菌的工業(yè)化生產(chǎn)進(jìn)程。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種。植物乳桿菌由廣州市微生物研究所提供。

1.1.2主要試劑及培養(yǎng)基?；罨陀?jì)數(shù)培養(yǎng)采用MRS培養(yǎng)基：葡萄糖20.00 g/L，胰蛋白胨10.00 g/L，牛肉浸膏10.00 g/L，酵母粉5.00 g/L，無(wú)水乙酸鈉5.00 g/L，磷酸氫二鉀2.00 g/L，檸檬酸氫二銨2.00 g/L，硫酸鎂 0.58 g/L，硫酸錳 0.25 g/L，吐溫-80 1 mL/L，pH6.8，固體培養(yǎng)基加20.00 g/L的瓊脂粉。胰蛋白胨：英國(guó)Oxoid 公司； 瓊脂粉： 廣東廣州環(huán)凱生物科技有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3主要儀器。生化培養(yǎng)箱:上海一恒科學(xué)儀器有限公司；752N 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；pHS-25 數(shù)顯酸度計(jì)：上海雷磁儀器廠。

1.2方法

1.2.1植物乳桿菌搖瓶發(fā)酵。從新鮮種子斜面挑取1環(huán)菌體接入種子搖瓶，于37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，然后以3%的接種量將活化好的種子液接入發(fā)酵搖瓶，37 ℃靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)18 h后取樣測(cè)定OD值。

1.2.2發(fā)酵過(guò)程參數(shù)測(cè)量。

1.2.2.1菌體生物量測(cè)定。測(cè)量經(jīng)適當(dāng)稀釋后的發(fā)酵液在600 nm波長(zhǎng)處的OD值。

1.2.2.2pH的測(cè)定。用pHS-25數(shù)顯酸度計(jì)測(cè)定。

1.2.2.3菌落計(jì)數(shù)。采用平板菌落計(jì)數(shù)法。

1.2.3植物乳桿菌生長(zhǎng)曲線的繪制。將活化好的植物乳桿菌接種于MRS發(fā)酵培養(yǎng)基中，每間隔2 h取樣測(cè)定發(fā)酵液pH和OD值，以同一批次滅菌而未接入菌種的MRS液體培養(yǎng)基為參照，繪制菌體生長(zhǎng)曲線。

1.2.4最佳發(fā)酵培養(yǎng)基的確定。

1.2.4.1最佳碳源的確定。分別用20.00 g/L的葡萄糖、蔗糖、果糖、可溶性淀粉、乳糖替代MRS培養(yǎng)基中的碳源，其余配方同MRS發(fā)酵培養(yǎng)基，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)。

1.2.4.2最佳氮源的確定。在篩選出最佳碳源的基礎(chǔ)上分別用25.00 g/L的酵母粉、酵母浸膏、蛋白胨、牛肉浸膏、脫脂奶粉、大豆蛋白胨、硫酸銨、胰蛋白胨替代MRS培養(yǎng)基中的氮源，其余配方同MRS發(fā)酵培養(yǎng)基，做搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)。

1.2.4.3不同無(wú)機(jī)鹽、刺激因子對(duì)植物乳桿菌OD值的影響。在最佳碳源和氮源的基礎(chǔ)上，分別將無(wú)水乙酸鈉5.00 g/L、磷酸氫二鉀2.00 g/L、檸檬酸氫二銨2.00 g/L、硫酸鎂 0.58 g/L、硫酸錳 0.25 g/L、吐溫-80 1 mL/L、碳酸鈣2.00 g/L單一加入發(fā)酵培養(yǎng)基中，在搖瓶水平進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)。

1.2.4.4正交試驗(yàn)。采用3因素3水平L9(33)正交表進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，對(duì)影響菌體生物量的主要因素蔗糖、酵母浸膏和碳酸鈣進(jìn)行正交試驗(yàn)，以得到最佳配比。正交試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1　正交試驗(yàn)因素與水平

2　 結(jié)果與分析

圖1　植物乳桿菌的生長(zhǎng)曲線和pH變化曲線Fig.1　Change curves of pH value and growth curve of L.plantarum

2.1植物乳桿菌生長(zhǎng)曲線由圖1可知，植物乳桿菌在MRS發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 h進(jìn)入穩(wěn)定期，此時(shí)OD值最高，生物量最大，之后略有下降，因此，18 h為最佳發(fā)酵終點(diǎn)。由于植物乳桿菌在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生乳酸，所以隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，pH急劇下降，當(dāng)培養(yǎng)到18 h，pH下降幅度減小，逐漸趨于穩(wěn)定，pH的變化和植物乳桿菌的生物量變化是相符合的。

2.2最佳發(fā)酵培養(yǎng)基的確定

2.2.1 最佳碳源。由圖2可知，植物乳桿菌的最佳碳源為蔗糖，其次是葡萄糖，最差是可溶性淀粉。這可能跟可溶性淀粉是多糖，不易于被植物乳桿菌利用有關(guān)。因此，選用蔗糖為最佳碳源。

圖2　不同碳源對(duì)植物乳桿菌OD值的影響Fig.2　Effects of carbon sources on the OD value of L.plantarum

2.2.2最佳氮源。由圖3可知，培養(yǎng)基中使用酵母粉和使用酵母浸膏時(shí)植物乳桿菌的OD值最高，而且差異不顯著。而使用牛肉浸膏和硫酸銨時(shí)，生物量顯著低于其他組別。酵母浸膏和酵母粉都富含蛋白質(zhì)，均衡的必需氨基酸以及B族維生素、核苷酸、微量元素等在發(fā)酵過(guò)程中給植物乳桿菌提供了充足的氮源之外，還提供大量的微量元素和氨基酸，促進(jìn)發(fā)酵。但是由于市面上酵母浸膏的價(jià)格遠(yuǎn)低于酵母粉，考慮到成本問(wèn)題，所以選擇酵母浸膏作為最佳氮源。

圖3　不同氮源對(duì)植物乳桿菌OD值的影響Fig.3　Effects of nitrogen source on the OD value of L.plantarum

2.2.3不同無(wú)機(jī)鹽、刺激因子對(duì)植物乳桿菌OD值的影響。無(wú)機(jī)鹽也是細(xì)菌生長(zhǎng)不可缺少的物質(zhì)，無(wú)機(jī)鹽的主要作用是維持菌體的滲透壓，另一方面一些離子對(duì)細(xì)菌體內(nèi)的酶有激活作用。乳酸菌在代謝過(guò)程中產(chǎn)生乳酸使pH下降，故培養(yǎng)基中需要加入一些緩沖鹽來(lái)調(diào)節(jié)pH，維持滲透壓，從而使乳酸菌更好地生長(zhǎng)。而筆者考慮到該株植物乳桿菌產(chǎn)酸能力很強(qiáng)，同時(shí)也使用碳酸鈣作為對(duì)照。由圖4可知，不同的無(wú)機(jī)鹽對(duì)植物乳桿菌生物量的增值有不同的影響，其中碳酸鈣最顯著，這可能是由于碳酸鈣在發(fā)酵中后期由于乳酸急劇增加而起到中和劑的作用，游離的碳酸根離子不穩(wěn)定，在水中很容易水解產(chǎn)生碳酸氫根離子和氫氧根離子。這在一定程度上為植物乳桿菌菌體增值創(chuàng)造了較適宜的培養(yǎng)環(huán)境。

圖4　不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)植物乳桿菌OD值的影響Fig.4　Effects of inorganic salt on the OD value of L.plantarum

2.2.4正交試驗(yàn)結(jié)果。由表2可知，最優(yōu)培養(yǎng)基組合為A2B2C1，即3%蔗糖、5%酵母浸膏、2%碳酸鈣。根據(jù)極差大小可以得出對(duì)植物乳桿菌生物量影響的顯著性順序?yàn)榻湍附?蔗糖>碳酸鈣，即培養(yǎng)基中初始的酵母浸膏含量對(duì)植物乳桿菌生物量的影響最大。

表2　正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.3驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果在搖瓶中使用優(yōu)化后的培養(yǎng)基進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，植物乳桿菌OD值達(dá)15.021，活菌數(shù)達(dá)7.1×109cfu/mL，與初始OD值5.701、活菌數(shù)1.4×109cfu/mL相比，活菌數(shù)提高了407%。

3　結(jié)論與討論

試驗(yàn)以1株具有強(qiáng)產(chǎn)酸能力的植物乳桿菌為研究對(duì)象，通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定了優(yōu)化后的培養(yǎng)基為蔗糖30.00 g/L，酵母浸膏50.00 g/L，無(wú)水乙酸鈉5.00 g/L，磷酸氫二鉀2.00 g/L，檸檬酸氫二銨2.00 g/L，硫酸鎂0.58 g/L，硫酸錳0.25 g/L，吐溫-80 1 mL/L，碳酸鈣2.00 g/L，優(yōu)化后發(fā)酵搖瓶的OD值為15.021，活菌數(shù)達(dá)7.1×109cfu/mL，與初始OD值5.701、活菌數(shù)1.4×109cfu/mL相比，發(fā)酵液活菌數(shù)是原來(lái)的5倍，顯著增加了植物乳桿菌的菌體生物量。此外，優(yōu)化后的培養(yǎng)基用廉價(jià)易得的國(guó)產(chǎn)組分代替昂貴的進(jìn)口成分，生產(chǎn)成本為原配方的2/3，大大降低了生產(chǎn)成本，為今后工業(yè)化生產(chǎn)植物乳桿菌奠定了基礎(chǔ)，具有較好的經(jīng)濟(jì)效益、社會(huì)效益和發(fā)展前景。

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Optimization of Fermentation Medium forLactobacillusplantarum

HUANG Xiu-min, ZHANG Yi-jing, LI Xue-you et al

(Guangzhou Institute of Microbiology, Guangzhou, Guangdong 510663)

[Objective] To optimize the fermentation medium, and to enhance the biomass ofLactobacillusplantarumbased on successful screening of aL.plantarumwith strong acid production. [Method] The single factor test and orthogonal test were used to optimize the composition of the culture medium. [Result] The optimized fermentation medium was as follows: 30.00 g/L sucrose, 50.00 g/L yeast extract, 5.00 g/L anhydrous sodium acetate, 2.00 g/L dipotassium hydrogen phosphate, 2.00 g/L diammonium hydrogen citrate, 0.58 g/L magnesium sulfate, 0.25 g/L manganese sulfate, 1 mL/L Tween-80, and 2.00 g/L calcium carbonate.ODvalue ofL.plantarumbroth after optimization increased from 5.701 to 15.021, viable count reached 7.1 × 109cfu/mL.[Conclusion] The production cost was reduced by the optimized fermentation medium, which provided reference for the study of the subsequent industrial production.

L.plantarum; Optimization of culture medium; Fermentation

廣東省省級(jí)科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015B040403004)；廣東省廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(201605040004)。

黃秀敏(1990- )，女，廣東梅州人，助理工程師，從事微生物研究。

2016-06-30

S 182

A

0517-6611(2016)24-006-02