水蕨精子發(fā)生過(guò)程中中心體蛋白和微管蛋白的免疫熒光定位

曹建國(guó)，王 堯，陳雪菲，戴錫玲，王全喜,2

(1 上海師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 上海 200234；2 上海資源植物功能基因組重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海辰山植物園 上海201602)

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水蕨精子發(fā)生過(guò)程中中心體蛋白和微管蛋白的免疫熒光定位

曹建國(guó)1，王 堯1，陳雪菲1，戴錫玲1，王全喜1,2

(1 上海師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 上海 200234；2 上海資源植物功能基因組重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海辰山植物園 上海201602)

采用透射電鏡技術(shù)和免疫熒光標(biāo)記技術(shù)對(duì)水蕨精子發(fā)生的超微結(jié)構(gòu)以及中心體蛋白和微管蛋白在精子發(fā)生過(guò)程中的動(dòng)態(tài)表達(dá)進(jìn)行了觀察。研究發(fā)現(xiàn)：(1)生毛體分化早期周圍有放射狀微管分布，這與線粒體向生毛體的聚集有關(guān)。(2)免疫熒光觀察表明，中心體蛋白僅定位于生毛體、基體和鞭毛帶上，自生毛體至基體階段呈現(xiàn)明亮的熒光標(biāo)記，在核塑形、鞭毛形成至精子成熟階段，中心體蛋白熒光標(biāo)記隨著鞭毛的發(fā)生而逐漸減弱，至游動(dòng)精子階段中心體蛋白熒光標(biāo)記信號(hào)幾乎消失。(3)微管蛋白早期熒光標(biāo)記與中心體蛋白標(biāo)記形相同，在生毛體、鞭毛帶、基體等運(yùn)動(dòng)細(xì)胞器上呈現(xiàn)明亮熒光標(biāo)記，但微管蛋白隨著鞭毛的發(fā)生其熒光標(biāo)記越來(lái)越強(qiáng)。從二者的時(shí)空表達(dá)特征可以推斷，中心體蛋白主要是運(yùn)動(dòng)細(xì)胞器的組織者，而非這些運(yùn)動(dòng)細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)成分，其功能是參與或負(fù)責(zé)中心粒、基體和鞭毛的發(fā)生。

水蕨；中心體蛋白；微管蛋白；熒光標(biāo)記

蕨類植物精子發(fā)生是一個(gè)運(yùn)動(dòng)細(xì)胞器，如生毛體、多層結(jié)構(gòu)(片層帶和微管帶)和鞭毛等重新發(fā)生的過(guò)程，超微結(jié)構(gòu)觀察表明這些運(yùn)動(dòng)細(xì)胞器均含微管[1-5]；免疫研究表明蕨類運(yùn)動(dòng)細(xì)胞器含有豐富的微管蛋白(tubulin)[6-7]，在成熟精子的多層結(jié)構(gòu)上還有肌動(dòng)蛋白[7]；免疫金標(biāo)記顯示水蕨生毛體、多層結(jié)構(gòu)和微管帶背面不定形物質(zhì)內(nèi)含有中心體蛋白(centrin)[4, 8-9]；在水蕨精細(xì)胞生毛體上還含有中心體識(shí)別蛋白MPM-2和C-9[9]；在這些蛋白中，中心體蛋白的出現(xiàn)與生毛體等運(yùn)動(dòng)細(xì)胞器的形成密切相關(guān)[10-11]。我們?cè)谒У鞍捉M學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)中心體蛋白在水蕨雄配子體精子器發(fā)生階段特異表達(dá)，是雄配子大量表達(dá)的一種蛋白[12]，并對(duì)水蕨中心體蛋白基因進(jìn)行了克隆和表達(dá)分析[13]。然而，中心體蛋白的動(dòng)態(tài)表達(dá)及與微管蛋白表達(dá)的相關(guān)性尚未可知，本研究以水蕨為材料對(duì)中心體蛋白和微管蛋白在精細(xì)胞發(fā)生過(guò)程中的動(dòng)態(tài)表達(dá)進(jìn)行了研究，這對(duì)闡明中心體蛋白在精子運(yùn)動(dòng)細(xì)胞器發(fā)生中的特點(diǎn)和作用有一定的科學(xué)意義。

1 材料和方法

1.1 水蕨配子體培養(yǎng)

水蕨孢子采自上海師范大學(xué)植物園，孢子用5%的次氯酸鈉溶液消毒3 min，用蒸餾水沖洗3次后接種于改良Knop’s培養(yǎng)基上，置于人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng)，光照18 h/d，溫度為25 ℃，光照強(qiáng)度約35 μmol·m-2·s-1，黑暗6 h，培養(yǎng)溫度為22 ℃。在此條件下，精子器于2～3周后在雄配子體的邊緣產(chǎn)生。

1.2 透射電鏡觀察

在解剖鏡(Nikon SMZ1500)下選取具不同發(fā)育階段精子器的配子體，用0.1 mol/L磷酸緩沖液配制的3%戊二醛固定6 h，經(jīng)相同緩沖液沖洗3次，用2%鋨酸后固定2 h后，再用相同緩沖液沖洗3次，系列丙酮(50%、70%、90%、100%)脫水后，用spurr’s樹(shù)脂滲透并包埋，經(jīng)70 ℃聚合9 h得到包埋塊。經(jīng)半薄切片定位，選擇不同發(fā)育階段的精子器進(jìn)行超微切片(Leica EM UC7, Germany)，超薄切片經(jīng)醋酸鈾和檸檬酸鉛染色后，用FEI 電鏡觀察和照相(Tecnai G2 Spirit BioTWIN, FEI Company)。

1.3 中心體蛋白和微管蛋白的免疫標(biāo)記和觀察

1.3.1 熒光觀察材料樣品的制備 挑選含有不同發(fā)育階段精子器的雄配子體迅速投入到用0.1 mol/L磷酸緩沖液配制的4%多聚甲醛固定液中，在室溫條件下固定2 h。用0.1 mol/L的Pipes溶液進(jìn)行漂洗3次，每次10 min。酒精梯度(25%、50%、75%)脫水，每次30 min，為提高可見(jiàn)性，在酒精中可加入1 μL 8% (w/v) 酸性品紅。在酒精和LR White包埋劑按不同混合比滲透(2∶1，1 h；1∶1，1 h；1∶2，1 h；純包埋劑4 h，純包埋劑12 h，純包埋劑24 h)，最后用純LR White包埋劑包埋和聚合，將配子體放置在0.5 mL錐形管中，于低溫紫外包埋箱中-10 ℃、紫外(波長(zhǎng)365 nm)照射條件下進(jìn)行聚合48 h，得到包埋塊。

1.3.2 蛋白免疫標(biāo)記 (1)切片和粘片：選擇具不同發(fā)育階段精子器的配子體，用超薄切片機(jī)切1 μm的薄片(PowerTome-XL型號(hào))，薄片經(jīng)過(guò)甲苯胺藍(lán)染色后，光鏡檢查確定發(fā)育時(shí)期后，再切取20～30片，用撈片器將薄片輕放在已滴有水滴的正電荷防脫載玻片上，待切片自然展開(kāi)后用吸水紙從水滴側(cè)面吸去多余的水分，將載玻片放入塑料反應(yīng)盒中在30 ℃溫箱烤片至切片完全吸附于載玻片上。(2)脫脂：將粘有樹(shù)脂的載玻片放入裝有純酒精的培養(yǎng)皿中5 min中，中間換2次，即可將樹(shù)脂大部分脫掉。(3)抽提：室溫下用1% Triton-X-100溶液抽提5～15 min，PBS沖洗3次，每次5 min，抽提及沖洗時(shí)反應(yīng)盒置于搖床上。(4)封閉：3%BSA牛血清蛋白中溫室下封閉20 min，封閉及PBS沖洗時(shí)反應(yīng)盒置于搖床上。(5)一抗孵育：本實(shí)驗(yàn)中使用的一抗分別為anti-centrin兔單克隆抗體和anti-Χ-tubulin鼠單克隆抗體。將單克隆抗體按1∶1 000濃度稀釋，將材料置于一抗中37 ℃孵育4 h或者在4 ℃過(guò)夜，PBS中清洗3次，每次5 min，一抗可以用封閉液稀釋。(6)二抗孵育：本實(shí)驗(yàn)使用的二抗分別為羊抗兔lgG(H+L)和羊抗鼠 lgG(H+L)，于37 ℃，二抗中孵育2 h，PBS中沖洗3次，每次5 min，孵育清洗過(guò)程中均在搖床上進(jìn)行，盡量置于黑暗的環(huán)境中操作。(7)染核：用1 μg·mL-1DAPI染細(xì)胞核5 min，PBS沖洗3次，每次5 min。暗室中，用Nikon80i-熒光顯微鏡檢查及拍照。

2 觀察結(jié)果

2.1 精原細(xì)胞

水蕨的產(chǎn)精細(xì)胞可經(jīng)連續(xù)有絲分裂形成8～16個(gè)精原細(xì)胞，16～32個(gè)精母細(xì)胞，最后產(chǎn)生32～64個(gè)精細(xì)胞，精細(xì)胞再分化形成精子。電鏡觀察顯示精原細(xì)胞常呈多邊形，直徑15 μm左右，細(xì)胞核顯著，呈圓形或略方形，具不規(guī)則形狀的核仁，精原細(xì)胞含有豐富的細(xì)胞器(圖版Ⅰ，1)。DAPI染色觀察表明精原細(xì)胞具有顯著的細(xì)胞核，中心體蛋白免疫熒光標(biāo)記顯示精原細(xì)胞階段細(xì)胞無(wú)任何中心體蛋白熒光標(biāo)記(圖版Ⅰ，2)；而微管蛋白免疫熒光標(biāo)記顯示細(xì)胞質(zhì)呈弱熒光標(biāo)記(圖版Ⅰ，3)。

2.2 生毛體發(fā)生

通過(guò)電鏡觀察，本研究在發(fā)育早期的精細(xì)胞細(xì)胞核附近觀察到了一團(tuán)不定形物質(zhì)，放大觀察表明該不定形物質(zhì)是由致密的顆粒構(gòu)成(圖版Ⅰ，4、5)。當(dāng)精細(xì)胞略變圓，我們?cè)诩?xì)胞核附近的細(xì)胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了早期的生毛體，呈球狀，其直徑大約在0.8 μm，它由一團(tuán)電子染色暗的物質(zhì)構(gòu)成，與生毛體相對(duì)之處的細(xì)胞核常出現(xiàn)凹刻(圖版Ⅰ，6)，放大觀察可見(jiàn)生毛體內(nèi)具染色較淺的通道(圖版Ⅰ，7)，仔細(xì)觀察可見(jiàn)微管呈放射狀從生毛體向外延伸出來(lái)(圖版Ⅰ，7，箭)，在生毛體的周圍聚集了許多發(fā)育良好的線粒體(圖版Ⅰ，6、7)。此階段，免疫熒光標(biāo)記顯示精細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)具中心體蛋白特異性表達(dá)的綠色熒光亮點(diǎn)，根據(jù)亮點(diǎn)的大小和位置，可以推測(cè)該亮點(diǎn)為早期生毛體(圖版Ⅰ，8，箭)。此時(shí)期亦可見(jiàn)到微管蛋白的特異熒光表達(dá)亮點(diǎn)(圖版Ⅰ，9，箭)。與中心體蛋白免疫熒光標(biāo)記相比，微管蛋白的免疫熒光標(biāo)記亮點(diǎn)略呈擴(kuò)散狀，這與電鏡觀察到生毛體產(chǎn)生大量擴(kuò)散的微管相一致。

2.3 多層結(jié)構(gòu)發(fā)生

進(jìn)一步發(fā)育可見(jiàn)生毛體的直徑增長(zhǎng)到1.5 μm左右，生毛體成為疏松的圓球狀或橢圓狀，其周圍分化出多數(shù)中心粒(centrioles)，生毛體內(nèi)部由電子染色暗的不定形物質(zhì)組成(圖版Ⅱ，1)。偶爾可見(jiàn)中心粒在生毛體一側(cè)打開(kāi)，其內(nèi)的不定形物質(zhì)分化產(chǎn)生了微管帶(MTR)(圖版Ⅱ，2)。更多情況下，微管帶與片層帶(LS)相連，二者形成多層結(jié)構(gòu)(MLS)，多層結(jié)構(gòu)再與一個(gè)線粒體相連，此線粒體最終發(fā)育為環(huán)狀線粒體(圖版Ⅱ，3、4)。不論最初的多層結(jié)構(gòu)朝向如何，最終環(huán)狀線粒體總是朝向精細(xì)胞核，微管帶均背向細(xì)胞核，中心粒分布在微管帶的外表面(圖版Ⅱ，5～7)。多層結(jié)構(gòu)發(fā)生初期，中心體蛋白熒光標(biāo)記顯示生毛體由原來(lái)的圓形斑點(diǎn)狀變?yōu)榛⌒伟唿c(diǎn)，但細(xì)胞質(zhì)均無(wú)中心體蛋白熒光標(biāo)記(圖版Ⅱ，8)。微管蛋白熒光標(biāo)記也顯示生毛體從一個(gè)圓點(diǎn)狀逐漸向兩側(cè)延伸為弧形，此時(shí)的精細(xì)胞除了生毛體特異性微管蛋白標(biāo)記外，精細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)亦呈較顯著的微管蛋白熒光標(biāo)記(圖版Ⅱ，9)。

2.4 微管帶擴(kuò)展和基體形成

微管帶形成后很快延伸到核的表面(圖版Ⅲ，1)，放大觀察，可見(jiàn)微管帶是從多層結(jié)構(gòu)延展到核表面的，多層結(jié)構(gòu)內(nèi)側(cè)的環(huán)狀線粒體亦十分顯著(圖版Ⅲ，2)，生毛體的中心粒此時(shí)沿微管帶外側(cè)分散排列，成為基體(圖版Ⅲ，2～4)，從基體的橫切可觀察到微管三聯(lián)體和輪狀結(jié)構(gòu)(圖版Ⅲ，3)，從基體的縱切可見(jiàn)基體兩端生長(zhǎng)，長(zhǎng)度明顯長(zhǎng)于中心粒，其近極端形成楔狀結(jié)構(gòu)，與不定形的暗物質(zhì)連接(圖版Ⅲ，4)，遠(yuǎn)端形成星狀結(jié)構(gòu)。在核的表面，微管與核膜結(jié)合緊密，微管帶下方雙層核膜清晰可辨(圖版Ⅲ，3、4)。隨發(fā)育，微管帶擴(kuò)展到核表面的1/2左右，但精細(xì)胞核仍然呈圓形，無(wú)明顯的核塑形(圖版Ⅲ，7)。免疫熒光觀察顯示中心體蛋白綠色熒光標(biāo)記與電鏡觀察中微管帶與基體在核表面的擴(kuò)展相一致，此階段的早期熒光標(biāo)記呈短線狀(圖版Ⅲ，5，箭)，隨發(fā)育中心體蛋白熒光標(biāo)記延伸并覆蓋細(xì)胞核的1/2左右(圖版Ⅲ，8，箭)，仔細(xì)辨別可以看到每條綠色熒光標(biāo)記線都是由數(shù)個(gè)熒光亮點(diǎn)構(gòu)成，這表明綠色熒光標(biāo)記可能是微管帶外的不定形物質(zhì)和基體(圖版Ⅲ，5、8)。微管蛋白的特異性熒光標(biāo)記與中心體蛋白相同(圖版Ⅲ，6、9，箭)，但熒光標(biāo)記的亮度似乎略強(qiáng)于中心體蛋白熒光標(biāo)記，值得說(shuō)明的是精細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)亦呈一定的微管蛋白陽(yáng)性標(biāo)記，但標(biāo)記的強(qiáng)度較微管帶弱很多(圖版Ⅲ，6、9)。此階段，DAPI染色顯示細(xì)胞核仍呈規(guī)則的圓形(圖版Ⅲ，5、6、8、9)。

2.5 核塑形與鞭毛的發(fā)生

接下來(lái)，精細(xì)胞進(jìn)入核塑形階段。核塑形初期，精細(xì)胞外產(chǎn)生了明顯加厚的細(xì)胞壁，精細(xì)胞原生質(zhì)體開(kāi)始消瘦，質(zhì)膜與細(xì)胞壁之間產(chǎn)生空腔，細(xì)胞核開(kāi)始由圓形變?yōu)樯葼睿w已經(jīng)長(zhǎng)出鞭毛，伸入到原生質(zhì)體的外方(圖版Ⅳ，1)。DAPI標(biāo)記觀察到細(xì)胞核開(kāi)始向兩側(cè)延伸，逐漸變?yōu)樯刃位虿灰?guī)則形狀(圖版Ⅳ，2、3)。免疫熒光標(biāo)記顯示中心體蛋白特異性熒光標(biāo)記信號(hào)顯著下降，前一階段標(biāo)記的綠色條狀熒光帶此時(shí)不易觀察，僅在微管帶的表面觀察到一些斷續(xù)的綠色熒光亮點(diǎn)(圖版Ⅳ，2，箭)。而微管蛋白特異性熒光標(biāo)記依然顯著，綠色熒光帶除覆蓋細(xì)胞核部分表面外，熒光標(biāo)記也擴(kuò)展到核外大部分區(qū)域，甚至包圍著整個(gè)細(xì)胞(圖版Ⅳ，3，箭)，這與微管帶和鞭毛在細(xì)胞外圍的延展相一致，此時(shí)，細(xì)胞質(zhì)無(wú)明顯的微管蛋白熒光標(biāo)記。

進(jìn)一步發(fā)育，細(xì)胞核變?yōu)閹睿旧|(zhì)進(jìn)一步濃縮，精細(xì)胞外可見(jiàn)大量的鞭毛(圖版Ⅳ，4)。DAPI標(biāo)記也觀察到細(xì)胞核延展成為帶狀、扇形或不規(guī)則形狀(圖版Ⅳ，5、6)。熒光標(biāo)記顯示中心體蛋白特異性熒光標(biāo)記依然微弱，僅在核表面呈現(xiàn)點(diǎn)狀分布(圖版Ⅳ，5，箭)。而此時(shí)微管蛋白熒光特異性標(biāo)記顯著增強(qiáng)，包圍著整個(gè)精細(xì)胞(圖版Ⅳ，6)，這與精細(xì)胞產(chǎn)生了大量的鞭毛相一致，有的呈現(xiàn)為條狀強(qiáng)綠色熒光標(biāo)記，應(yīng)該是鞭毛聚集處(圖版Ⅳ，6，箭)，這與電鏡切片中鞭毛的聚集情況相一致。

2.6 游動(dòng)精子

經(jīng)過(guò)核塑形階段，精細(xì)胞最終成為一個(gè)螺旋形游動(dòng)精子，它主要由運(yùn)動(dòng)細(xì)胞器和螺旋狀的細(xì)胞核構(gòu)成，運(yùn)動(dòng)細(xì)胞器包括多層結(jié)構(gòu)、環(huán)狀線粒體、微管帶和鞭毛。細(xì)胞核亦呈螺旋的帶狀，染色質(zhì)高度濃縮(圖版Ⅳ，7)。在成熟精細(xì)胞的內(nèi)部，仍有許多大而明顯的造粉體、囊泡和線粒體(圖版Ⅳ，7)。DAPI染色亦可以觀察到此階段的細(xì)胞核呈螺旋狀(圖版Ⅳ，8、9)。熒光免疫標(biāo)記顯示，中心體蛋白熒光特異性標(biāo)記幾乎完全消失，偶爾可以看見(jiàn)零散分布的微弱綠色熒光亮點(diǎn)(圖版Ⅳ，8，箭)，而微管蛋白熒光特異性標(biāo)記達(dá)到最高程度，有時(shí)可見(jiàn)塊狀的綠色熒光標(biāo)記，這應(yīng)該是鞭毛聚集處(圖版Ⅳ，9，箭)。

3 討 論

3.1 生毛體的形成和分化

生毛體的來(lái)源是人們感興趣的問(wèn)題之一，Hepler[14]在蘋(Marsileavestita)精原細(xì)胞第8次分裂中觀察到一團(tuán)絮狀物質(zhì)，從該絮狀物質(zhì)內(nèi)逐步分化產(chǎn)生生毛體。Vaudois和Tourte發(fā)現(xiàn)蕨(Pteridiumaquilinum)生毛體也來(lái)自電子染色暗的顆粒狀或絮狀物質(zhì)[15]。Doonan等在Platyzomamicrophyllum精母細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)了球形的顆粒狀結(jié)構(gòu)[6]。Kotenko在球子蕨(Onocleasensibilis)精細(xì)胞中也觀察到了顆粒狀物質(zhì)構(gòu)成的球形結(jié)構(gòu)，他們認(rèn)為這是生毛體的早期形態(tài)[3]。本研究中，我們通過(guò)透射電鏡觀察到了一團(tuán)電子暗的顆粒狀物質(zhì)，位于精細(xì)胞細(xì)胞核附近，我們認(rèn)為這是生毛體的最早可見(jiàn)形態(tài)，我們?cè)噲D用免疫熒光標(biāo)記方法確定其是否含有中心體蛋白成分，盡管我們定位到了中心體蛋白免疫熒光標(biāo)記的亮點(diǎn)，但光鏡觀察到的熒光標(biāo)記點(diǎn)尚無(wú)法準(zhǔn)確對(duì)應(yīng)電鏡觀察到的細(xì)致結(jié)構(gòu)，免疫金標(biāo)記是解決這一問(wèn)題的方法。

水蕨生毛體的分化過(guò)程經(jīng)歷了前中心粒(procentrioles)、中心粒(centrioles)、多層結(jié)構(gòu)分化等過(guò)程，這與蕨(P.aquilimum)、P.microphyllum、球子蕨(O.sensibilis)、蘋(M.vestita)等其他蕨類生毛體的發(fā)育過(guò)程類似[1-3, 6，9]。本研究中通過(guò)電鏡觀察到前中心粒階段的生毛體周圍有細(xì)胞質(zhì)微管呈放射狀分布，通過(guò)微管蛋白免疫熒光標(biāo)記也在生毛體周圍觀察到了彌散狀的微管蛋白分布，我們?cè)诟凳哮P尾蕨(Pterisfauriei)精子發(fā)生中也觀察到了生毛體周圍放射狀微光分布現(xiàn)象[5]，產(chǎn)生放射狀微管的功能尚無(wú)探討，本研究發(fā)現(xiàn)此階段有多數(shù)線粒體聚集在生毛體的周圍，在植物細(xì)胞中線粒體的分布可能受微管的影響，如通過(guò)一些被子植物的研究表明線粒體的分布與微管有關(guān)或受微管分布的影響[16-18]，因此，我們認(rèn)為蕨類精細(xì)胞發(fā)生過(guò)程中生毛體周圍的大量放射狀微管與線粒體的聚集有關(guān)，而線粒體的聚集應(yīng)該是為多層結(jié)構(gòu)和環(huán)狀線粒體的發(fā)生做好準(zhǔn)備，因?yàn)樵谏w發(fā)育后期產(chǎn)生的多層結(jié)構(gòu)都會(huì)連接一個(gè)環(huán)狀線粒體[2-5，9]，而此環(huán)狀線粒體可能就是由這些分散的線粒體融合形成。

3.2 多層結(jié)構(gòu)的形成和分化

蕨類植物精細(xì)胞發(fā)生中多層結(jié)構(gòu)是由生毛體內(nèi)的不定形物質(zhì)產(chǎn)生，電鏡觀察表明多層結(jié)構(gòu)是由微管帶、片層結(jié)構(gòu)、嗜鋨層構(gòu)成[1, 5，6，9,14]，在這些研究中發(fā)現(xiàn)微管帶一旦產(chǎn)生即與片層帶相連接，二者誰(shuí)先產(chǎn)生尚不清楚，本研究發(fā)現(xiàn)生毛體在中心粒擴(kuò)散階段，其內(nèi)的不定形物質(zhì)首先產(chǎn)生了微管帶，其外側(cè)尚無(wú)片層帶、嗜鋨層，可能表明微管帶是先產(chǎn)生的，傅氏鳳尾蕨(P.fauriei)精子發(fā)生研究中也觀察到多層結(jié)構(gòu)外側(cè)的不定形物質(zhì)可產(chǎn)生附屬微管帶[5]，進(jìn)一步表明不定形物質(zhì)具有分化出微管帶的能力，此后再產(chǎn)生片層帶和嗜鋨層，共同形成多層結(jié)構(gòu)，但該結(jié)論仍有待于大量電鏡觀察。

3.3 微管蛋白的時(shí)空表達(dá)和功能

微管蛋白是構(gòu)成微管的基本成分，電鏡觀察表明蕨類植物運(yùn)動(dòng)細(xì)胞器主要由微管構(gòu)成，如生毛體內(nèi)的中心粒、微管帶、基體和鞭毛等都含有微管結(jié)構(gòu)[1-5，9，19]。Marc和Gunning通過(guò)微管抗體免疫熒光標(biāo)記表明蕨(P.aquilinum)的運(yùn)動(dòng)細(xì)胞器，包括生毛體、微管帶、基體和鞭毛都呈明顯的微管蛋白陽(yáng)性標(biāo)記，表明這些細(xì)胞器含有豐富的微管蛋白[7]。本研究也對(duì)水蕨精細(xì)胞發(fā)生過(guò)程中的微管蛋白進(jìn)行了熒光標(biāo)記，我們發(fā)現(xiàn)水蕨運(yùn)動(dòng)細(xì)胞器生毛體、微管帶、基體和鞭毛都呈微管蛋白特異性標(biāo)記，且微管蛋白的熒光染色隨精子的發(fā)育而逐漸增強(qiáng)，這表明水蕨精細(xì)胞后期產(chǎn)生的微管蛋白數(shù)量越來(lái)越多，與電鏡觀察的結(jié)果一致。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，除了運(yùn)動(dòng)細(xì)胞器呈強(qiáng)微管蛋白熒光標(biāo)記外，精細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)也呈弱熒光標(biāo)記，這表明精細(xì)胞質(zhì)中也存在一定數(shù)量的微管蛋白，這部分微管蛋白可能是基本的細(xì)胞骨架成分，也可能是作為鞭毛發(fā)生時(shí)所需要的原料。

3.4 中心體蛋白的時(shí)空表達(dá)和功能

中心體蛋白最初是在綠藻Tetraselmisstriata中發(fā)現(xiàn)的一種鈣調(diào)蛋白，它是鞭毛基的一種成分[20]。大量研究表明中心體蛋白是真核生物微管組織中心(MTOC)中的一種保守成分，在中心體的定向、定位、有絲分裂、紡錘體的分離及微管組織方面都發(fā)揮著重要的作用[21-22]。在蕨類植物中，免疫金標(biāo)記表明中心體蛋白最早定位于生毛體，多層結(jié)構(gòu)、微管帶背面的不定形物質(zhì)區(qū)以及基體內(nèi)部的星狀區(qū)也含有中心體蛋白成分[8-9]。本研究中，我們也發(fā)現(xiàn)生毛體、微管帶附近和基體均呈現(xiàn)較強(qiáng)的中心體蛋白免疫熒光標(biāo)記，但細(xì)胞質(zhì)內(nèi)完全沒(méi)有中心體蛋白熒光標(biāo)記，表明中心體蛋白是參與精細(xì)胞運(yùn)動(dòng)細(xì)胞器發(fā)生的特有蛋白。盡管前人對(duì)中心體蛋白的分布進(jìn)行了精細(xì)的細(xì)胞定位，但中心體蛋白在精細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中的時(shí)間變化仍然不清，我們經(jīng)過(guò)大量的熒光標(biāo)記發(fā)現(xiàn)中心體蛋白在生毛體和基體發(fā)生階段均呈較強(qiáng)的免疫熒光標(biāo)記，一旦精細(xì)胞發(fā)育進(jìn)入核塑形階段，也即基體產(chǎn)生鞭毛后，微管帶附近的中心體蛋白免疫熒光標(biāo)記信號(hào)明顯減弱，這種中心體蛋白熒光標(biāo)記信號(hào)的減弱與鞭毛的形成呈完全的負(fù)相關(guān)，中心體蛋白的這種時(shí)空變化可能表明生毛體和微管帶背面不定形物質(zhì)內(nèi)的中心體蛋白是微管的組織者，其功能可能是參與中心粒、基體和鞭毛的發(fā)生，一旦鞭毛產(chǎn)生后，其作為微管組織者的功能就已經(jīng)完成，中心體蛋白的含量減少，免疫熒光標(biāo)記減弱，故在核塑形時(shí)期，中心體蛋白的免疫熒光標(biāo)記大大降低，至游動(dòng)精子階段幾乎完全不見(jiàn)中心體蛋白的帶狀熒光標(biāo)記，然而，中心體蛋白的點(diǎn)狀熒光標(biāo)記仍然可見(jiàn)，可能表明鞭毛基內(nèi)仍然有中心體蛋白的存在，可能作為結(jié)構(gòu)成分參與鞭毛帶運(yùn)動(dòng)。

在原生動(dòng)物毛滴蟲(chóng)(Trichomonasvaginalis)中，中心體蛋白被定位于鞭毛基內(nèi)，是錨定臂的組成之一[23]，在纖毛蟲(chóng)Nassula和Furgasonia中，中心體蛋白定位在胞咽器的上部，很可能參與鞭毛的收縮[24]。在衣藻中，中心體蛋白位于核與基體連接器纖維、相鄰基體間連接纖維和基體與其鞭毛間的鞭毛轉(zhuǎn)化區(qū)，主要參與核-基體連接器纖維的收縮[25]，這些研究表明低等生物中心體蛋白是鞭毛基部的組成成分，參與鞭毛的運(yùn)動(dòng)。在高等植物苔蘚和蕨類植物中都標(biāo)記到了中心體蛋白[8]，通過(guò)在蕨類植物蘋(Marsileavestita)中心體蛋白翻譯的中斷實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)中心體蛋白的缺失影響了精細(xì)胞中的微管分布，表明其可能控制著細(xì)胞骨架和運(yùn)動(dòng)細(xì)胞器的形成[26]，但仍不能確定中心體蛋白是否參與鞭毛的運(yùn)動(dòng)。種子植物細(xì)胞在整個(gè)生活史過(guò)程中不產(chǎn)生鞭毛，但其仍具有中心體蛋白基因，其中心體蛋白定位于發(fā)育的細(xì)胞板以及細(xì)胞壁胞間連絲上，其功能可能是作為鈣敏感的納米纖絲參與調(diào)控鈣誘導(dǎo)的胞間運(yùn)輸[27]，煙草的中心體蛋白主要參與細(xì)胞板的形成，也參與Ca2+調(diào)節(jié)的胞內(nèi)運(yùn)輸[28]。本研究中，通過(guò)微管蛋白和中心體蛋白的同時(shí)標(biāo)記和時(shí)空表達(dá)觀察，發(fā)現(xiàn)它們都在生毛體和微管帶附近顯著標(biāo)記，分布的位置相似，但微管蛋白表達(dá)越來(lái)越強(qiáng)，而中心體蛋白的表達(dá)在核塑形后越來(lái)越弱，由此可以推出中心體蛋白是微管組織中心的主要成分，負(fù)責(zé)或參與中心粒、基體和鞭毛的形成，當(dāng)精子成熟后鞭毛基仍含有少量中心體蛋白，這部分中心體蛋白應(yīng)該是基體和鞭毛基的組成成分，可能與鞭毛的運(yùn)動(dòng)有關(guān)。

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圖版Ⅰ 精原細(xì)胞和精細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及中心體蛋白和微管蛋白免疫熒光標(biāo)記1. 精原細(xì)胞；2. 中心體蛋白免疫標(biāo)記；3. 微管蛋白免疫標(biāo)記；4、5.精細(xì)胞早期，箭所指為一團(tuán)致密物質(zhì)；6. 早期生毛體(箭)；7. 生毛體放大，其周圍有放射狀微管(箭)；8. 中心體蛋白免疫標(biāo)記，熒光標(biāo)記亮點(diǎn)為生毛體(箭)；9. 微管蛋白免疫標(biāo)記，熒光標(biāo)記亮點(diǎn)為生毛體(箭)PlateⅠ Ultrastructure and immunofluorescence labeling of anti-centrin and anti-tubulin antibodies of spermatogenous cell and spermatidFig. 1. A spermatogenous cell; Fig. 2. Immunofluorescence labeling of centrin；Fig. 3. Immunofluorescence labeling of tubulin；Fig. 4,5. Early stage of spermatid，arrow indicated the spherical granular bodies, which may be the nascent blepharoplasty；Fig. 6. Early blepharoplast(arrow) is seen in the spermatid；Fig. 7. Magnification of the blepharoplast，radial arranged microtubules (arrow) are seen around the blepharoplast；Fig. 8. The brighter spot of the immunofluorescence labeling of centrin is blepharoplast (arrow)；Fig. 9. The brighter spot of the immunofluorescence labeling of tubulin is blepharoplast (arrow)

圖版 Ⅱ 生毛體發(fā)生超微結(jié)構(gòu)及中心體蛋白和微管蛋白的免疫熒光標(biāo)記1. 生毛體(B)，分化出中心粒；2. 生毛體(B)產(chǎn)生微管帶(MTR)；3、4. 微管帶(MTR)與片層帶(LL)相連形成多層結(jié)構(gòu)(MLS)，并與環(huán)狀線粒體(CM)相連；5. 進(jìn)一步分化的生毛體(B)；6. 生毛體放大；7. 生毛體，中心粒進(jìn)一步擴(kuò)散；8. 中心體蛋白免疫標(biāo)記，熒光標(biāo)記亮點(diǎn)為擴(kuò)大的生毛體(箭)；9. 微管蛋白免疫標(biāo)記，熒光標(biāo)記亮點(diǎn)為擴(kuò)大的生毛體(箭)Plate Ⅱ Ultrastructure of blepharoplast and immunofluorescence labeling of centrin and tubulinFig. 1. Blepharoplast (B), the centriole are formed; Fig. 2. Blepharoplast (B), the microtubular ribbon (MTR) is formed; Fig. 3,4. Blepharoplast (B). The MTR is associated with the lamellar strip (LS) and forms the multilayered structure (MLS) , which is connected with the coiled mitochondrion (CM)；Fig. 5. The further developed blepharoplast (B); Fig. 6. The magnification of blepharoplasty; Fig. 7. The blepharoplast, showing the further dispersed centrioles；Fig. 8. The immunofluorescence labeling of centrin, the brighter spot is the expanded blepharoplast (arrow)；Fig. 9. The immunofluorescence labeling of tubulin, the brighter spot is the expanded blepharoplast (arrow)

圖版 Ⅲ 基體形成階段超微結(jié)構(gòu)及中心體蛋白和微管蛋白的免疫熒光標(biāo)記1. 微管帶(箭)擴(kuò)展到核表面，分化出基體(BB)；2. 放大示多層結(jié)構(gòu)(MLS)和微管帶(MTR)；3. 基體(BB)橫切；4. 基體(BB)縱切；5. 亮短線為 中心體蛋白熒光免疫標(biāo)記(箭)；6. 亮短線為微管蛋白熒光免疫標(biāo)記(箭)；7. 細(xì)胞核(N)表面的微管帶進(jìn)一步擴(kuò)展；8. 亮線為中心體蛋白熒光免疫標(biāo)記(箭)；9. 亮線為微管蛋白熒光免疫標(biāo)記(箭)。Plate Ⅲ Basal body formation stage, ultrastructure and immunofluorescence labeling of centrin and tubulinFig. 1. The microtubular ribbon (arrow) expands to the nuclear surface. Basal bodies (BB) are formed; Fig. 2. Magnification showing the multilayered structure (MLS) and the microtubular ribbon (MTR)；Fig. 3. Transverse section of the basal bodies (BB). Fig. 4. Longitudinal section of basal bodies (BB)；Fig. 5. The brighter short line (arrow) is the immunofluorescence labeling of centrin；Fig. 6. The brighter short line (arrow) is the immunofluorescence labeling of tubulin；Fig. 7. The microtubular ribbon (arrow) expands further along the nuclear(N) surface；Fig. 8 Immunofluorescence labeling of centrin (arrow)；Fig. 9. Immunofluorescence labeling of tubulin (arrow)

圖版 Ⅳ 核塑形和游動(dòng)精子階段超微結(jié)構(gòu)及中心體蛋白和微管蛋白的免疫熒光標(biāo)記1.核塑形早期，細(xì)胞核(N)呈扇形，分化出鞭毛(F)；2. 中心體蛋白免疫熒光標(biāo)記減弱(箭)；3. 微管蛋白免疫熒光標(biāo)記，鞭毛帶呈明亮熒光標(biāo)記(箭)；4. 核塑形中期，鞭毛數(shù)量增加；5. 中心體蛋白免疫標(biāo)記信號(hào)進(jìn)一步減弱(箭)；6. 微管蛋白免疫標(biāo)記，鞭毛帶、鞭毛呈明亮熒光標(biāo)記(箭)；7. 游動(dòng)精子階段，外有大量鞭毛；8. 中心體蛋白免疫標(biāo)記，只有少量標(biāo)記信號(hào)(箭)；9. 微管蛋白免疫標(biāo)記，鞭毛帶、鞭毛呈明亮熒光標(biāo)記(箭)Plate Ⅳ Nuclear shaping and spermatozoid stage, ultrastructure and immunofluorescence labeling of centrin and tubulinFig. 1. Early stage of nuclear shaping, the nucleus (N) shows fan-shaped. flagella (F) are formed; Fig. 2. The immunofluorescence labeling of centrin decrease (arrow); Fig. 3. The immunofluorescence labeling of tubulin, the flagellar band show brighter labeling (arrow); Fig. 4. Middle stage of nuclear shaping，the flagella number increase；Fig. 5. The immunofluorescence labeling of centrin decrease further; Fig. 6. The immunofluorescence labeling of tubulin, the flagella and flagellar band show brighter labeling; Fig. 7. Spermatozoid stage，numerous flagella are formed；Fig. 8. Almost no the immunofluorescence labeling of centrin are seen, but some labeling spots (arrows); Fig. 9. The immunofluorescence labeling of tubulin, the flagella and flagellar band show brighter labeling (arrow)

(編輯:潘新社)

Immunofluorescence Localization of Centrin and Tubulin during Spermatogenesis ofCeratopteristhalictroides

CAO Jianguo1, WANG Yao1, CHEN Xuefei1, DAI Xiling1，WANG Quanxi1,2

(1 College of Life and Environment Sciences, Shanghai Normal University, Shanghai 200234; 2 Shanghai Key Laboratory of Plant Functional Genomics and Resource，Shanghai Chenshan Botanical Garden, Shanghai 201602, China)

The ultrastructure and the dynamic expression of the centrin and tubulin during spermatogenesis of the fernCeratopteristhalictroideswere observed using the TEM technology and immunofluorescence technology. The present investigation shows that: (1) there are abundant radial microtubules around the early blepharoplast. The function of the radial microtubules may be used to converge mitochondria to the blepharoplast. (2) Immunofluorescence observations show that centrin is only located in the blepharoplast, basal bodies and flagellar band. The fluorescence labeling of centrin becomes brighter from the blepharoplast stage to the basal body stage. Then the fluorescence labeling of centrin becomes weak gradually with the formation of flagella and almost disappears at the spermatozoid stage. (3) The early fluorescence labeling of tubulin, showing the same form as the centrin labelling, is located in the blepharoplast, basal bodies, flagellar band. Then the fluorescence labeling of tubulin becomes more and more stronger as the flagella form in the spermatids. Based on the expression features of centrin and tubulin, it can be inferred that centrin is one of the organizer of the motile apparatuses, but not to be the components of the motile apparatuses. The main function of centrin may take part in formation of the centrioles, basal bodies and flagella of the spermatids.

Ceratopteristhalictroides; cetrin; tubulin; fluorescence labeling

1000-4025(2016)08-1575-10

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.08.1575

2016-05-03;修改稿收到日期:2016-06-17

上海市自然科學(xué)基金(13ZR1429700)；上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)課題(14DZ2260400)資助

曹建國(guó)(1968-)，男，教授，主要從事蕨類植物生殖發(fā)育和蕨類植物資源開(kāi)發(fā)與利用的研究。E-mail：cao101@shnu.edu.cn

Q248;Q944.62

A