擬南芥AtCIPK23基因?qū)煵菘购的芰Φ挠绊?/h1>
2016-10-14 05:22:23楊玲瓏魯黎明
西北植物學(xué)報(bào) 2016年8期
楊玲瓏，李 珂，魯黎明,2*
(1 四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，成都611130；2 植物生理學(xué)與生物化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100094)
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擬南芥AtCIPK23基因?qū)煵菘购的芰Φ挠绊?/p>
楊玲瓏1，李 珂1，魯黎明1,2*
(1 四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，成都611130；2 植物生理學(xué)與生物化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100094)
為了探索擬南芥AtCIPK23基因?qū)煵菽秃的芰Φ挠绊懀瑢?duì)3個(gè)轉(zhuǎn)AtCIPK23基因陽性純合株系KA13、KA14和KA44與野生型煙草K326(對(duì)照)進(jìn)行了自然干旱處理，測定離體葉片的失水速率、葉綠素含量、相對(duì)電導(dǎo)率、脯氨酸和可溶性糖含量，并分析了轉(zhuǎn)基因及野生型材料對(duì)活性氧的清除能力，對(duì)活性氧清除基因NtSOD、NtCAT和NtAPX及干旱脅迫相關(guān)基因NtDREB、NtLEA5和NtCDPK2的表達(dá)量進(jìn)行檢測。結(jié)果表明：(1)轉(zhuǎn)基因煙草離體葉片的失水速率明顯低于K326；自然干旱7 d后，野生型K326出現(xiàn)了明顯的干旱脅迫癥狀；干旱7 d進(jìn)行復(fù)水后，轉(zhuǎn)基因株系的復(fù)水存活率明顯高于K326。(2)轉(zhuǎn)基因株系中的葉綠素、脯氨酸及可溶性糖含量比K326顯著提高，電導(dǎo)率則明顯降低。(3)野生型煙草K326中H2O2的積累量明顯高于3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系，轉(zhuǎn)基因株系中ROS清除機(jī)制的3個(gè)關(guān)鍵基因NtSOD、NtCAT和NtAPX被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)。(4)抗旱相關(guān)基因NtDREB、NtLEA5和NtCDPK2僅在轉(zhuǎn)基因煙草中受干旱誘導(dǎo)。研究認(rèn)為，AtCIPK23基因可能具有提高植物抗旱能力的功能。
煙草；轉(zhuǎn)基因；AtCIPK23；鈣信號(hào)；干旱
干旱是給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成重大威脅的自然災(zāi)害。干旱會(huì)導(dǎo)致農(nóng)作物生長發(fā)育受到嚴(yán)重阻礙，給農(nóng)作物的產(chǎn)量造成巨大的損失[1]。因此，深入了解植物抗旱的生理機(jī)制，提高農(nóng)作物的耐旱性，保證干旱脅迫下農(nóng)作物的產(chǎn)量，具有十分重要的意義。
在分子層面，植物響應(yīng)干旱脅迫可以分為兩種途徑，即依賴ABA途徑和不依賴ABA途徑。兩者的區(qū)別在于，在遭受干旱脅迫時(shí)，前者會(huì)伴隨著植物細(xì)胞內(nèi)ABA含量的增加[2]。當(dāng)ABA含量增加時(shí)，會(huì)激發(fā)胞內(nèi)的由CDPK、MAPK等蛋白激酶的磷酸化和去磷酸化所導(dǎo)致的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而指導(dǎo)下游基因的表達(dá)。在此過程中，Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮著極其重要的作用。研究表明，當(dāng)AtCML9基因被敲除后，atcml9突變體具有更強(qiáng)的抗旱能力[3]。而AtCAMTA1基因卻正調(diào)控植物的抗旱過程，其敲除后植株的抗旱能力卻明顯降低[4]。CDPK同樣在植物干旱響應(yīng)中發(fā)揮重要作用。cpk3cpk6雙突變體中，ABA誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉的功能降低，導(dǎo)致其抗旱能力下降[5]。另外過表達(dá)AtCPK4和AtCPK11時(shí)，植株抗旱能力增強(qiáng)，而cpk4cpk11雙突變體的抗旱能力明顯減弱[6-7]。擬南芥cpk8及cpk10突變體對(duì)干旱表現(xiàn)出敏感的表型，而CPK8與CPK10的過表達(dá)植株的耐旱能力則較野生型大幅度提高[8-9]。CBL(calcineurin B-like proteins)也參與了植物的干旱脅迫響應(yīng)，如AtCBL5正調(diào)控不依賴于ABA抗旱途徑，當(dāng)其過表達(dá)時(shí)，植株的抗旱能力明顯提高[10]；AtCBL9的表達(dá)受ABA的誘導(dǎo)，同時(shí)，其敲除突變體則表現(xiàn)出對(duì)滲透脅迫的敏感[11]。
此外，CIPK(CBL-interacting protein kinase)蛋白也參與了植物的干旱脅迫響應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，AtCIPK6基因的表達(dá)受干旱脅迫的強(qiáng)烈誘導(dǎo)[12]；在干旱條件下AtCBL1/9與AtCIPK1的互作能力增強(qiáng)，有利于平衡干旱條件下細(xì)胞內(nèi)的滲透壓[13-14]。過表達(dá)OsCIPK23基因后，水稻中抗旱相關(guān)基因被誘導(dǎo)表達(dá)，而OsCIPK23基因表達(dá)量的降低，則導(dǎo)致水稻植株的抗干旱能力降低[15]。
AtCIPK23基因在擬南芥應(yīng)答低鉀脅迫時(shí)起關(guān)鍵作用[16-17]，然而，其在干旱脅迫響應(yīng)中的作用尚不清楚。因此，本文通過將AtCIPK23轉(zhuǎn)入煙草，并研究轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性，以為AtCIPK23的抗旱功能研究提供借鑒。
1 材料和方法
1.1 試驗(yàn)材料
普通煙草K326，轉(zhuǎn)AtCIPK23基因煙草株系KA13、KA14和KA44均由植物生理學(xué)與生物化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室武維華教授實(shí)驗(yàn)室提供。
1.2 煙草的培養(yǎng)及樣品采集
煙草種子經(jīng)表面消毒后，播種于花盆中，并置于溫度為25 ℃，相對(duì)濕度為60%～80%的大棚中培養(yǎng)。正常供水條件下生長40 d之后，進(jìn)行自然干旱脅迫處理，即停止?jié)菜?2 d，然后復(fù)水，并統(tǒng)計(jì)復(fù)水成活率。
在干旱處理后的第7天，各材料分別采集10株煙草的葉片，進(jìn)行相關(guān)生理指標(biāo)的測定。
1.3 生理指標(biāo)的測定方法
1.3.1 葉片失水率 摘取生長30天的煙草同一部位葉片，置于25～35 ℃環(huán)境下，自然風(fēng)干12 h。每小時(shí)測1次樣品重量，重復(fù)3次。葉片失水率=(鮮重-風(fēng)干后重量)/鮮重×100%
1.3.2 相對(duì)電導(dǎo)率 在每片葉片上取10個(gè)直徑為10 mm的圓形樣品，置于10 mL ddH2O中浸泡12 h后用電導(dǎo)儀測定電導(dǎo)率(R1),然后沸水浴孵育30 min后，再次測定電導(dǎo)率(R2), 每個(gè)品種重復(fù)3次。相對(duì)電導(dǎo)率=R1/R2×100%。
1.3.3 葉綠素含量 選取同一部位的葉片，使用葉綠素測量儀SPAD，對(duì)葉片的5個(gè)不同部位進(jìn)行葉綠素含量測定，計(jì)算平均值。
1.3.4 DAB染色 將葉片置于含有20% PEG 6000的MS營養(yǎng)液中模擬干旱脅迫12 h后，使用DAB(3,3′-diaminobenzidine-HCl)染色。然后，抽真空2 min，而后室溫放置2 h，去除染色液，加入適量的脫色液(乙醇∶水∶冰醋酸∶甘油=8∶1∶1∶1)于60 ℃烘箱中進(jìn)行脫色。
1.3.5 脯氨酸和可溶性糖含量測定 脯氨酸含量的測定用酸性水合茚三酮法進(jìn)行[18]，可溶性糖含量測定用蒽酮比色法進(jìn)行[19]。
1.4 基因表達(dá)量分析
采用Trizol法提取煙草樣品的總RNA，用DNase進(jìn)行純化處理。然后，取200 ng純化后的總RNA，使用Reverse TranscriptionM-MLV酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，用ddH2O將cDNA稀釋10倍用于qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。最后使用QuantiTect SYBR Green PCR Kit進(jìn)行相關(guān)基因表達(dá)量分析。qRT-PCR分析所用引物見表1。qRT-PCR反應(yīng)體系為：cDNA 1 μL，2x QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix 5 μL，Primer F (10 μmol/L) 0.5 μL，Primer R (10 μmol/L) 0.5 μL，ddH2O 3 μL，總體積10 μL。qRT-PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性60 s，95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)。
表1 qRT-PCR引物
2 結(jié)果與分析
2.1 轉(zhuǎn)基因煙草的分子檢測
采用qRT-PCR的方法，對(duì)參試的轉(zhuǎn)基因煙草及野生型K326進(jìn)行了外源基因AtCIPK23的表達(dá)檢測。結(jié)果表明，在野生型K326，沒有檢測到外源基因AtCIPK23的表達(dá)；而在3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中，AtCIPK23的表達(dá)水平較高，而且，3個(gè)株系的表達(dá)量并不相同(圖1)。由此說明，外源基因AtCIPK23在3個(gè)轉(zhuǎn)基因煙草株系中，均得到了表達(dá)。
2.2 干旱對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草生長的影響
為了鑒定AtCIPK23轉(zhuǎn)基因煙草植株的耐旱能力，將3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系與野生型K326進(jìn)行了自然干旱處理。在停止?jié)菜? d后，轉(zhuǎn)基因煙草植株與野生型植株的生長，表現(xiàn)出明顯的差異(圖2，A)。3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系植株的生長較為正常，冠部較大，葉色濃綠。而野生型植株的生長受到抑制，多數(shù)葉片萎蔫，冠部偏小，表現(xiàn)出干旱脅迫癥狀。
圖1 轉(zhuǎn)基因植株AtCIPK23表達(dá)量分析Fig.1 Expression analysis of AtCIPK23 in three transgenic lines and K326
A、B. 干旱處理后7 d與復(fù)水后5 d煙草的長勢；C. DAB染色圖2 干旱對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草生長的影響及DAB染色結(jié)果A and B, the phenotype of tobacco after 7 days drought stress treatment and 5 days re-watering. C, DAB stainingFig.2 The effect of drought stress on transgenic tobacco and DAB staining
干旱12 d后，轉(zhuǎn)基因植株也出現(xiàn)黃化和萎蔫現(xiàn)象，但野生型植株的干旱脅迫表現(xiàn)更為嚴(yán)重。此時(shí)，進(jìn)行復(fù)水，5 d之后，統(tǒng)計(jì)各個(gè)參試材料的復(fù)水存活率。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因株系KA13、KA14和KA44的復(fù)水存活率分別為90%、87%和90%，明顯高于野生型K326的70%(圖2，B)。干旱表型分析及復(fù)水存活率的比較結(jié)果，表明了轉(zhuǎn)基因植株具有較強(qiáng)的耐旱能力。
2.3 干旱對(duì)煙草葉片失水率及葉綠素含量的影響
為了探究AtCIPK23轉(zhuǎn)基因植株較為抗旱的原因，以正常生長30 d的野生型K326和3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系葉片為材料，測定了離體葉片的失水率。結(jié)果表明，隨著時(shí)間的延長，4個(gè)株系的相對(duì)失水率均逐漸增加。其中野生型K326的相對(duì)失水率顯著高于其余3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系(圖3，A)，其相對(duì)失水率的高低順序?yàn)镵326>KA13>KA14>KA44。此結(jié)果說明，葉片的保水能力較強(qiáng)，可能是轉(zhuǎn)基因煙草植株較為耐旱的原因之一。
干旱7 d后，測定了轉(zhuǎn)基因植株及野生型植株的SPAD值。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因株系的SPAD值顯著高于野生型K326(圖3，B)。SPAD值的高低順序?yàn)镵A44>KA14>KA13>K326。由于SPAD值在一定程度上反映了葉綠素含量的高低，因此，本結(jié)果也說明，在干旱脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株具有較高的葉綠素含量。而葉綠素含量較高，則意味著轉(zhuǎn)基因植株具有較強(qiáng)的光合能力。
2.4 干旱對(duì)煙草葉片脯氨酸、可溶性糖含量及相對(duì)電導(dǎo)率的影響
脯氨酸及可溶性糖，是植物細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，其含量的高低，在一定程度上反映了植物細(xì)胞的耐旱程度。對(duì)參試材料的脯氨酸及可溶性糖的測定結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因材料這兩個(gè)物質(zhì)的含量均明顯高于野生型材料(圖4)。各材料脯氨酸含量的高低順序?yàn)镵A14>KA13>KA44>K326；而可溶性糖含量的高低順序則為KA44>KA14>KA13>K326。滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的測定結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因株系具有較強(qiáng)的滲透調(diào)節(jié)能力，因而，表現(xiàn)較為耐旱。
相對(duì)電導(dǎo)率是植物細(xì)胞質(zhì)膜完整性的標(biāo)志指標(biāo)之一，也是植物抗逆程度的反應(yīng)。本研究在停止?jié)菜? d后，測定了參試材料的相對(duì)電導(dǎo)率，結(jié)果表明，野生型材料的相對(duì)電導(dǎo)率(45%)，顯著高于轉(zhuǎn)基因株系KA14(28%)，極顯著高于KA13(18%) 和KA44(18%)。相對(duì)電導(dǎo)率測定的結(jié)果進(jìn)一步說明，細(xì)胞質(zhì)膜較為完整，也是轉(zhuǎn)基因株系耐旱能力較強(qiáng)的原因之一。
A. 葉片失水率；B. 葉綠素含量(SPAD值)圖3 各材料葉片失水率及葉綠素含量的比較A. Water loss rate of tobacco leaves. B. Chlorophyll content of tobacco leaves (in SPDA value)Fig.3 The comparison of water loss rate and chlorophyll content of transgenic tobacco and wild type
2.5 干旱條件下各材料細(xì)胞內(nèi)活性氧清除能力的比較
模擬干旱脅迫12 h后，通過DAB染色發(fā)現(xiàn)，K326葉片絕大部分區(qū)域呈現(xiàn)黃褐色，而轉(zhuǎn)基因植株中黃褐色的區(qū)域較少，株系KA44的葉片幾乎看不到明顯的黃褐色區(qū)域(圖2，C)。此結(jié)果說明，轉(zhuǎn)基因株系對(duì)的H2O2清除能力較強(qiáng)，從而積累的H2O2較少。
為探索轉(zhuǎn)基因株系對(duì)H2O2的清除能力產(chǎn)生的原因，對(duì)轉(zhuǎn)基因株系中編碼超氧化物歧化酶和過氧化氫酶及過氧化物酶的基因NtSOD、NtCAT和NtAPX的表達(dá)量進(jìn)行了檢測。結(jié)果表明，NtCAT和NtAPX基因的表達(dá)量受干旱的強(qiáng)烈誘導(dǎo)，表達(dá)量增加很多。尤其是NtAPX基因的表達(dá)量在KA14和KA44中分別提高了近15與20倍(圖5，B、C)。同時(shí)，盡管NtSOD基因的表達(dá)量受干旱誘導(dǎo)表達(dá)量增加較少，但其在轉(zhuǎn)基因材料中的表達(dá)量卻遠(yuǎn)高于野生型K326(圖5，A)。
此結(jié)果說明，AtCIPK23基因通過提高活性氧清除相關(guān)基因的干旱響應(yīng)表達(dá)水平，有效促進(jìn)了轉(zhuǎn)基因植株在遭遇干旱脅迫后活性氧的清除能力，使轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)活性氧的積累維持在較低的水平，從而有利于提高轉(zhuǎn)基因材料對(duì)干旱的耐受能力。
2.6 干旱條件下抗旱相關(guān)基因的誘導(dǎo)表達(dá)情況
采用qRT-PCR的方法，對(duì)干旱前后參試材料中3個(gè)干旱相關(guān)基因(NtDREB、NtLEA5和NtCDPK2)的表達(dá)量進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖6所示。干旱處理前，NtDREB、NtLEA5和NtCDPK2在轉(zhuǎn)基因材料中的表達(dá)量均高于野生型K326，其中，以NtCDPK2增加的量最多，NtDREB次之，NtLEA5基因的表達(dá)量增加最小。干旱處理后，所檢測的3個(gè)基因的表達(dá)量在轉(zhuǎn)基因材料中均有較大幅度提高，其中，以NtDREB受誘導(dǎo)表達(dá)最為強(qiáng)烈，以NtCDPK2，NtLEA5基因的受誘導(dǎo)表達(dá)量最小。同時(shí)，檢測的結(jié)果還表明，所檢測的3個(gè)基因在不同轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)量不同，其中，以NtDREB在3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)量差異較大，趨勢呈現(xiàn)為KA44>KA14>KA13；而NtCDPK2和NtLEA5的表達(dá)量，無論干旱前后，在3個(gè)株系之間的差異均不大。
干旱相關(guān)基因表達(dá)量檢測結(jié)果說明，AtCIPK23基因促進(jìn)了這3個(gè)基因的表達(dá)，并有可能導(dǎo)致了轉(zhuǎn)基因材料抗旱性的提高。
圖5 NtSOD、NtCAT和NtAPX基因表達(dá)量分析Fig.5 Gene expression analysis of NtSOD, NtCAT and NtAPX
圖6 干旱脅迫前后3個(gè)干旱相關(guān)基因的表達(dá)量分析Fig.6 Expression profiles of 3 drought relative genes in WT and transgenic lines at 0 and 7 days after drought stress
3 討 論
本研究通過對(duì)轉(zhuǎn)AtCIPK23基因煙草及野生型K326進(jìn)行自然干旱，探討了各參試材料的耐旱性。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)AtCIPK23基因的煙草植株具有較強(qiáng)的耐旱性。
Ca2+作為細(xì)胞內(nèi)的第二信使，廣泛參與并調(diào)節(jié)了植物的生長、發(fā)育和抗逆等各項(xiàng)生命活動(dòng)[7,20]。在植物響應(yīng)干旱脅迫的過程中，鈣信號(hào)蛋白發(fā)揮了十分重要的作用[3-8,11]。CIPK蛋白是一類在植物體內(nèi)發(fā)揮重要作用的蛋白[20-23]，也參與了植物的逆境響應(yīng)[12,15]。研究表明，CBL1/CBL9-CIPK23-AKT1途徑遭到抑制時(shí)，保衛(wèi)細(xì)胞氣孔開度降低，從而有效減少了植物的水分散失，間接提高了植物的抗旱能力[16]。此結(jié)果說明，AtCIPK23可能參與了植物的干旱逆境響應(yīng)。本研究的結(jié)果表明，在干旱脅迫下，AtCIPK23轉(zhuǎn)基因煙草表現(xiàn)出了較為耐旱的表型。其葉片水分散失的速率較低、細(xì)胞膜的完整性較好，葉綠素含量較高，均有利于干旱環(huán)境中水分的吸收與保持、保護(hù)細(xì)胞內(nèi)正常的生理生化反應(yīng)，從而使轉(zhuǎn)基因植株對(duì)干旱具有更強(qiáng)的耐受性。
在植物的干旱響應(yīng)中，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)發(fā)揮著十分重要的作用。前人的研究結(jié)果說明，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累有利于對(duì)脅迫下植物體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧和自由基的清除、細(xì)胞滲透勢的降低以及葉片水分含量的維持[24]。本研究的結(jié)果也證實(shí)了轉(zhuǎn)基因植株積累了較多的脯氨酸及可溶性糖等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，這些物質(zhì)的含量較高，可能也是導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因煙草具有較強(qiáng)的耐旱能力的原因之一。
植物在逆境脅迫時(shí)，會(huì)產(chǎn)生活性氧物質(zhì)ROS(reactive oxygen species, ROS)。ROS如果不及時(shí)清除，則會(huì)攻擊植物細(xì)胞的DNA、蛋白質(zhì)及膜脂質(zhì)等生物大分子，從而使植物細(xì)胞不能夠正常行使功能，導(dǎo)致植物生長受到影響，并降低農(nóng)作物的產(chǎn)量與品質(zhì)[25]。SOD、POD、CAT 和 APX 等保護(hù)酶類，構(gòu)成了植物的活性氧清除系統(tǒng)。它們在植物體內(nèi)共同發(fā)揮作用，能夠減輕ROS對(duì)植物細(xì)胞的傷害[26-29]。Zhou等[8]的研究結(jié)果證實(shí)，CKP8能夠調(diào)節(jié)CAT3的活性，提高擬南芥對(duì)ROS的清除能力，從而提高了擬南芥的抗旱性。本研究也得出了類似的研究結(jié)果。DAB染色的結(jié)果顯示，過表達(dá)AtCIPK23的煙草植株對(duì)ROS的清除能力強(qiáng)于野生型，同時(shí)，其NtSOD、NtCAT和NtAPX基因的表達(dá)量明顯提升，暗示了對(duì)ROS的清除能力較強(qiáng)，是轉(zhuǎn)AtCIPK23的煙草植株抗旱能力增強(qiáng)的重要原因。
干旱相關(guān)基因的誘導(dǎo)表達(dá)，與植物的耐旱性密切相關(guān)。在干旱脅迫下，OsCIPK23過表達(dá)植株的干旱相關(guān)基因DREB2A、rd29A、Rab18 及NCED3被強(qiáng)烈誘導(dǎo)表達(dá)[15]。本研究的結(jié)果表明，轉(zhuǎn)AtCIPK23基因煙株表現(xiàn)出耐旱性增強(qiáng)，同時(shí)，伴隨著3個(gè)干旱相關(guān)基因NtDREB、NtLEA5和NtCDPK2在轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)表達(dá)量的急劇上升。這就說明，CIPK蛋白在不同的物種內(nèi)可能采取類似的機(jī)制參與了植物對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)。
本研究的結(jié)果證實(shí)，AtCIPK23能夠增強(qiáng)煙草的耐旱能力。然而，植物對(duì)外界干旱脅迫的分子響應(yīng)，是一個(gè)較為復(fù)雜的過程。AtCIPK23究竟是如何調(diào)控?zé)煵菁?xì)胞的生理生化活動(dòng)，從而實(shí)現(xiàn)其耐旱能力的增強(qiáng)，尚待進(jìn)一步研究。
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(編輯:宋亞珍)
Physiological Response of Transgenic Tobacco CarryingAtCIPK23 Genes to Drought Stress
YANG Linglong1, LI Ke1, LU Liming1,2*
(1 College of Agronomy, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China; 2 State Key Laboratory of Plant Physiology and Biochemistry, Beijing 100094, China)
In order to study the roles of ArabidopsisAtCIPK23 gene played in response to drought stress, we treated threeAtCIPK23 gene transgenic lines and wide type tobacco K326 by drought stress. The leaf water loss rate, proline, chlorophyll, soluble sugar contents and electrical conductivity were measured. Meanwhile, ROS elimination ability, and gene expression of ROS elimination and drought resistance related genes were analyzed. The results showed that: (1) the water loss speed of leaves detached from transgenic lines distinctly slower than that of K326. After 7 days of drought stress treatment in natural environment, K326 plants showed yellowish and withered. The re-watering survival rate of transgenic lines was higher than that of K326 after 7 days drought stress. (2) The concents of proline, chlorophyll and soluble sugar in transgenic lines were obvious higher than that of K326. The electrical conductivity of transgenic lines leaves was significantly lower than that of K326. (3) Under drought stress, the accumulation of H2O2in K326 was significantly higher than that of three transgenic lines, and three ROS elimination related genesNtSOD,NtCATandNtAPXwere up-regulated only in the transgenic lines. (4) The drought resistance related genesNtAREB,NtLEA5 andNtCDPK2 were induced by drought stress in transgenic tobacco plants. These results suggest that theAtCIPK23 gene can improve the drought stress ability of transgenic tobacco.
tobacco; transgenic plants;AtCIPK23 gene; Ca2+signal; drought stress
1000-4025(2016)08-1534-07
10.7606/j.issn.1000-4025.2016.08.1534
2016-05-08;修改稿收到日期:2016-07-08
植物生理學(xué)與生物化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(SKLPPBKF1505)
楊玲瓏(1989-),女，在讀碩士研究生，主要從事煙草栽培生理研究。E-mail：23702967@qq.com
*通信作者:魯黎明，副教授，主要從事煙草栽培生理研究。E-mail：luliming@sicau.edu.cn
Q789
A
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楊玲瓏，李 珂，魯黎明,2*
(1 四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，成都611130；2 植物生理學(xué)與生物化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100094)
?
擬南芥AtCIPK23基因?qū)煵菘购的芰Φ挠绊?/p>
楊玲瓏1，李 珂1，魯黎明1,2*
(1 四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，成都611130；2 植物生理學(xué)與生物化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100094)
為了探索擬南芥AtCIPK23基因?qū)煵菽秃的芰Φ挠绊懀瑢?duì)3個(gè)轉(zhuǎn)AtCIPK23基因陽性純合株系KA13、KA14和KA44與野生型煙草K326(對(duì)照)進(jìn)行了自然干旱處理，測定離體葉片的失水速率、葉綠素含量、相對(duì)電導(dǎo)率、脯氨酸和可溶性糖含量，并分析了轉(zhuǎn)基因及野生型材料對(duì)活性氧的清除能力，對(duì)活性氧清除基因NtSOD、NtCAT和NtAPX及干旱脅迫相關(guān)基因NtDREB、NtLEA5和NtCDPK2的表達(dá)量進(jìn)行檢測。結(jié)果表明：(1)轉(zhuǎn)基因煙草離體葉片的失水速率明顯低于K326；自然干旱7 d后，野生型K326出現(xiàn)了明顯的干旱脅迫癥狀；干旱7 d進(jìn)行復(fù)水后，轉(zhuǎn)基因株系的復(fù)水存活率明顯高于K326。(2)轉(zhuǎn)基因株系中的葉綠素、脯氨酸及可溶性糖含量比K326顯著提高，電導(dǎo)率則明顯降低。(3)野生型煙草K326中H2O2的積累量明顯高于3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系，轉(zhuǎn)基因株系中ROS清除機(jī)制的3個(gè)關(guān)鍵基因NtSOD、NtCAT和NtAPX被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)。(4)抗旱相關(guān)基因NtDREB、NtLEA5和NtCDPK2僅在轉(zhuǎn)基因煙草中受干旱誘導(dǎo)。研究認(rèn)為，AtCIPK23基因可能具有提高植物抗旱能力的功能。
煙草；轉(zhuǎn)基因；AtCIPK23；鈣信號(hào)；干旱
干旱是給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成重大威脅的自然災(zāi)害。干旱會(huì)導(dǎo)致農(nóng)作物生長發(fā)育受到嚴(yán)重阻礙，給農(nóng)作物的產(chǎn)量造成巨大的損失[1]。因此，深入了解植物抗旱的生理機(jī)制，提高農(nóng)作物的耐旱性，保證干旱脅迫下農(nóng)作物的產(chǎn)量，具有十分重要的意義。
在分子層面，植物響應(yīng)干旱脅迫可以分為兩種途徑，即依賴ABA途徑和不依賴ABA途徑。兩者的區(qū)別在于，在遭受干旱脅迫時(shí)，前者會(huì)伴隨著植物細(xì)胞內(nèi)ABA含量的增加[2]。當(dāng)ABA含量增加時(shí)，會(huì)激發(fā)胞內(nèi)的由CDPK、MAPK等蛋白激酶的磷酸化和去磷酸化所導(dǎo)致的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而指導(dǎo)下游基因的表達(dá)。在此過程中，Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮著極其重要的作用。研究表明，當(dāng)AtCML9基因被敲除后，atcml9突變體具有更強(qiáng)的抗旱能力[3]。而AtCAMTA1基因卻正調(diào)控植物的抗旱過程，其敲除后植株的抗旱能力卻明顯降低[4]。CDPK同樣在植物干旱響應(yīng)中發(fā)揮重要作用。cpk3cpk6雙突變體中，ABA誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉的功能降低，導(dǎo)致其抗旱能力下降[5]。另外過表達(dá)AtCPK4和AtCPK11時(shí)，植株抗旱能力增強(qiáng)，而cpk4cpk11雙突變體的抗旱能力明顯減弱[6-7]。擬南芥cpk8及cpk10突變體對(duì)干旱表現(xiàn)出敏感的表型，而CPK8與CPK10的過表達(dá)植株的耐旱能力則較野生型大幅度提高[8-9]。CBL(calcineurin B-like proteins)也參與了植物的干旱脅迫響應(yīng)，如AtCBL5正調(diào)控不依賴于ABA抗旱途徑，當(dāng)其過表達(dá)時(shí)，植株的抗旱能力明顯提高[10]；AtCBL9的表達(dá)受ABA的誘導(dǎo)，同時(shí)，其敲除突變體則表現(xiàn)出對(duì)滲透脅迫的敏感[11]。
此外，CIPK(CBL-interacting protein kinase)蛋白也參與了植物的干旱脅迫響應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，AtCIPK6基因的表達(dá)受干旱脅迫的強(qiáng)烈誘導(dǎo)[12]；在干旱條件下AtCBL1/9與AtCIPK1的互作能力增強(qiáng)，有利于平衡干旱條件下細(xì)胞內(nèi)的滲透壓[13-14]。過表達(dá)OsCIPK23基因后，水稻中抗旱相關(guān)基因被誘導(dǎo)表達(dá)，而OsCIPK23基因表達(dá)量的降低，則導(dǎo)致水稻植株的抗干旱能力降低[15]。
AtCIPK23基因在擬南芥應(yīng)答低鉀脅迫時(shí)起關(guān)鍵作用[16-17]，然而，其在干旱脅迫響應(yīng)中的作用尚不清楚。因此，本文通過將AtCIPK23轉(zhuǎn)入煙草，并研究轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性，以為AtCIPK23的抗旱功能研究提供借鑒。
1 材料和方法
1.1 試驗(yàn)材料
普通煙草K326，轉(zhuǎn)AtCIPK23基因煙草株系KA13、KA14和KA44均由植物生理學(xué)與生物化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室武維華教授實(shí)驗(yàn)室提供。
1.2 煙草的培養(yǎng)及樣品采集
煙草種子經(jīng)表面消毒后，播種于花盆中，并置于溫度為25 ℃，相對(duì)濕度為60%～80%的大棚中培養(yǎng)。正常供水條件下生長40 d之后，進(jìn)行自然干旱脅迫處理，即停止?jié)菜?2 d，然后復(fù)水，并統(tǒng)計(jì)復(fù)水成活率。
在干旱處理后的第7天，各材料分別采集10株煙草的葉片，進(jìn)行相關(guān)生理指標(biāo)的測定。
1.3 生理指標(biāo)的測定方法
1.3.1 葉片失水率 摘取生長30天的煙草同一部位葉片，置于25～35 ℃環(huán)境下，自然風(fēng)干12 h。每小時(shí)測1次樣品重量，重復(fù)3次。葉片失水率=(鮮重-風(fēng)干后重量)/鮮重×100%
1.3.2 相對(duì)電導(dǎo)率 在每片葉片上取10個(gè)直徑為10 mm的圓形樣品，置于10 mL ddH2O中浸泡12 h后用電導(dǎo)儀測定電導(dǎo)率(R1),然后沸水浴孵育30 min后，再次測定電導(dǎo)率(R2), 每個(gè)品種重復(fù)3次。相對(duì)電導(dǎo)率=R1/R2×100%。
1.3.3 葉綠素含量 選取同一部位的葉片，使用葉綠素測量儀SPAD，對(duì)葉片的5個(gè)不同部位進(jìn)行葉綠素含量測定，計(jì)算平均值。
1.3.4 DAB染色 將葉片置于含有20% PEG 6000的MS營養(yǎng)液中模擬干旱脅迫12 h后，使用DAB(3,3′-diaminobenzidine-HCl)染色。然后，抽真空2 min，而后室溫放置2 h，去除染色液，加入適量的脫色液(乙醇∶水∶冰醋酸∶甘油=8∶1∶1∶1)于60 ℃烘箱中進(jìn)行脫色。
1.3.5 脯氨酸和可溶性糖含量測定 脯氨酸含量的測定用酸性水合茚三酮法進(jìn)行[18]，可溶性糖含量測定用蒽酮比色法進(jìn)行[19]。
1.4 基因表達(dá)量分析
采用Trizol法提取煙草樣品的總RNA，用DNase進(jìn)行純化處理。然后，取200 ng純化后的總RNA，使用Reverse TranscriptionM-MLV酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，用ddH2O將cDNA稀釋10倍用于qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。最后使用QuantiTect SYBR Green PCR Kit進(jìn)行相關(guān)基因表達(dá)量分析。qRT-PCR分析所用引物見表1。qRT-PCR反應(yīng)體系為：cDNA 1 μL，2x QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix 5 μL，Primer F (10 μmol/L) 0.5 μL，Primer R (10 μmol/L) 0.5 μL，ddH2O 3 μL，總體積10 μL。qRT-PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性60 s，95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)。
表1 qRT-PCR引物
2 結(jié)果與分析
2.1 轉(zhuǎn)基因煙草的分子檢測
采用qRT-PCR的方法，對(duì)參試的轉(zhuǎn)基因煙草及野生型K326進(jìn)行了外源基因AtCIPK23的表達(dá)檢測。結(jié)果表明，在野生型K326，沒有檢測到外源基因AtCIPK23的表達(dá)；而在3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中，AtCIPK23的表達(dá)水平較高，而且，3個(gè)株系的表達(dá)量并不相同(圖1)。由此說明，外源基因AtCIPK23在3個(gè)轉(zhuǎn)基因煙草株系中，均得到了表達(dá)。
2.2 干旱對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草生長的影響
為了鑒定AtCIPK23轉(zhuǎn)基因煙草植株的耐旱能力，將3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系與野生型K326進(jìn)行了自然干旱處理。在停止?jié)菜? d后，轉(zhuǎn)基因煙草植株與野生型植株的生長，表現(xiàn)出明顯的差異(圖2，A)。3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系植株的生長較為正常，冠部較大，葉色濃綠。而野生型植株的生長受到抑制，多數(shù)葉片萎蔫，冠部偏小，表現(xiàn)出干旱脅迫癥狀。
圖1 轉(zhuǎn)基因植株AtCIPK23表達(dá)量分析Fig.1 Expression analysis of AtCIPK23 in three transgenic lines and K326
A、B. 干旱處理后7 d與復(fù)水后5 d煙草的長勢；C. DAB染色圖2 干旱對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草生長的影響及DAB染色結(jié)果A and B, the phenotype of tobacco after 7 days drought stress treatment and 5 days re-watering. C, DAB stainingFig.2 The effect of drought stress on transgenic tobacco and DAB staining
干旱12 d后，轉(zhuǎn)基因植株也出現(xiàn)黃化和萎蔫現(xiàn)象，但野生型植株的干旱脅迫表現(xiàn)更為嚴(yán)重。此時(shí)，進(jìn)行復(fù)水，5 d之后，統(tǒng)計(jì)各個(gè)參試材料的復(fù)水存活率。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因株系KA13、KA14和KA44的復(fù)水存活率分別為90%、87%和90%，明顯高于野生型K326的70%(圖2，B)。干旱表型分析及復(fù)水存活率的比較結(jié)果，表明了轉(zhuǎn)基因植株具有較強(qiáng)的耐旱能力。
2.3 干旱對(duì)煙草葉片失水率及葉綠素含量的影響
為了探究AtCIPK23轉(zhuǎn)基因植株較為抗旱的原因，以正常生長30 d的野生型K326和3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系葉片為材料，測定了離體葉片的失水率。結(jié)果表明，隨著時(shí)間的延長，4個(gè)株系的相對(duì)失水率均逐漸增加。其中野生型K326的相對(duì)失水率顯著高于其余3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系(圖3，A)，其相對(duì)失水率的高低順序?yàn)镵326>KA13>KA14>KA44。此結(jié)果說明，葉片的保水能力較強(qiáng)，可能是轉(zhuǎn)基因煙草植株較為耐旱的原因之一。
干旱7 d后，測定了轉(zhuǎn)基因植株及野生型植株的SPAD值。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因株系的SPAD值顯著高于野生型K326(圖3，B)。SPAD值的高低順序?yàn)镵A44>KA14>KA13>K326。由于SPAD值在一定程度上反映了葉綠素含量的高低，因此，本結(jié)果也說明，在干旱脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株具有較高的葉綠素含量。而葉綠素含量較高，則意味著轉(zhuǎn)基因植株具有較強(qiáng)的光合能力。
2.4 干旱對(duì)煙草葉片脯氨酸、可溶性糖含量及相對(duì)電導(dǎo)率的影響
脯氨酸及可溶性糖，是植物細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，其含量的高低，在一定程度上反映了植物細(xì)胞的耐旱程度。對(duì)參試材料的脯氨酸及可溶性糖的測定結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因材料這兩個(gè)物質(zhì)的含量均明顯高于野生型材料(圖4)。各材料脯氨酸含量的高低順序?yàn)镵A14>KA13>KA44>K326；而可溶性糖含量的高低順序則為KA44>KA14>KA13>K326。滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的測定結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因株系具有較強(qiáng)的滲透調(diào)節(jié)能力，因而，表現(xiàn)較為耐旱。
相對(duì)電導(dǎo)率是植物細(xì)胞質(zhì)膜完整性的標(biāo)志指標(biāo)之一，也是植物抗逆程度的反應(yīng)。本研究在停止?jié)菜? d后，測定了參試材料的相對(duì)電導(dǎo)率，結(jié)果表明，野生型材料的相對(duì)電導(dǎo)率(45%)，顯著高于轉(zhuǎn)基因株系KA14(28%)，極顯著高于KA13(18%) 和KA44(18%)。相對(duì)電導(dǎo)率測定的結(jié)果進(jìn)一步說明，細(xì)胞質(zhì)膜較為完整，也是轉(zhuǎn)基因株系耐旱能力較強(qiáng)的原因之一。
A. 葉片失水率；B. 葉綠素含量(SPAD值)圖3 各材料葉片失水率及葉綠素含量的比較A. Water loss rate of tobacco leaves. B. Chlorophyll content of tobacco leaves (in SPDA value)Fig.3 The comparison of water loss rate and chlorophyll content of transgenic tobacco and wild type
2.5 干旱條件下各材料細(xì)胞內(nèi)活性氧清除能力的比較
模擬干旱脅迫12 h后，通過DAB染色發(fā)現(xiàn)，K326葉片絕大部分區(qū)域呈現(xiàn)黃褐色，而轉(zhuǎn)基因植株中黃褐色的區(qū)域較少，株系KA44的葉片幾乎看不到明顯的黃褐色區(qū)域(圖2，C)。此結(jié)果說明，轉(zhuǎn)基因株系對(duì)的H2O2清除能力較強(qiáng)，從而積累的H2O2較少。
為探索轉(zhuǎn)基因株系對(duì)H2O2的清除能力產(chǎn)生的原因，對(duì)轉(zhuǎn)基因株系中編碼超氧化物歧化酶和過氧化氫酶及過氧化物酶的基因NtSOD、NtCAT和NtAPX的表達(dá)量進(jìn)行了檢測。結(jié)果表明，NtCAT和NtAPX基因的表達(dá)量受干旱的強(qiáng)烈誘導(dǎo)，表達(dá)量增加很多。尤其是NtAPX基因的表達(dá)量在KA14和KA44中分別提高了近15與20倍(圖5，B、C)。同時(shí)，盡管NtSOD基因的表達(dá)量受干旱誘導(dǎo)表達(dá)量增加較少，但其在轉(zhuǎn)基因材料中的表達(dá)量卻遠(yuǎn)高于野生型K326(圖5，A)。
此結(jié)果說明，AtCIPK23基因通過提高活性氧清除相關(guān)基因的干旱響應(yīng)表達(dá)水平，有效促進(jìn)了轉(zhuǎn)基因植株在遭遇干旱脅迫后活性氧的清除能力，使轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)活性氧的積累維持在較低的水平，從而有利于提高轉(zhuǎn)基因材料對(duì)干旱的耐受能力。
2.6 干旱條件下抗旱相關(guān)基因的誘導(dǎo)表達(dá)情況
采用qRT-PCR的方法，對(duì)干旱前后參試材料中3個(gè)干旱相關(guān)基因(NtDREB、NtLEA5和NtCDPK2)的表達(dá)量進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖6所示。干旱處理前，NtDREB、NtLEA5和NtCDPK2在轉(zhuǎn)基因材料中的表達(dá)量均高于野生型K326，其中，以NtCDPK2增加的量最多，NtDREB次之，NtLEA5基因的表達(dá)量增加最小。干旱處理后，所檢測的3個(gè)基因的表達(dá)量在轉(zhuǎn)基因材料中均有較大幅度提高，其中，以NtDREB受誘導(dǎo)表達(dá)最為強(qiáng)烈，以NtCDPK2，NtLEA5基因的受誘導(dǎo)表達(dá)量最小。同時(shí)，檢測的結(jié)果還表明，所檢測的3個(gè)基因在不同轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)量不同，其中，以NtDREB在3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)量差異較大，趨勢呈現(xiàn)為KA44>KA14>KA13；而NtCDPK2和NtLEA5的表達(dá)量，無論干旱前后，在3個(gè)株系之間的差異均不大。
干旱相關(guān)基因表達(dá)量檢測結(jié)果說明，AtCIPK23基因促進(jìn)了這3個(gè)基因的表達(dá)，并有可能導(dǎo)致了轉(zhuǎn)基因材料抗旱性的提高。
圖5 NtSOD、NtCAT和NtAPX基因表達(dá)量分析Fig.5 Gene expression analysis of NtSOD, NtCAT and NtAPX
圖6 干旱脅迫前后3個(gè)干旱相關(guān)基因的表達(dá)量分析Fig.6 Expression profiles of 3 drought relative genes in WT and transgenic lines at 0 and 7 days after drought stress
3 討 論
本研究通過對(duì)轉(zhuǎn)AtCIPK23基因煙草及野生型K326進(jìn)行自然干旱，探討了各參試材料的耐旱性。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)AtCIPK23基因的煙草植株具有較強(qiáng)的耐旱性。
Ca2+作為細(xì)胞內(nèi)的第二信使，廣泛參與并調(diào)節(jié)了植物的生長、發(fā)育和抗逆等各項(xiàng)生命活動(dòng)[7,20]。在植物響應(yīng)干旱脅迫的過程中，鈣信號(hào)蛋白發(fā)揮了十分重要的作用[3-8,11]。CIPK蛋白是一類在植物體內(nèi)發(fā)揮重要作用的蛋白[20-23]，也參與了植物的逆境響應(yīng)[12,15]。研究表明，CBL1/CBL9-CIPK23-AKT1途徑遭到抑制時(shí)，保衛(wèi)細(xì)胞氣孔開度降低，從而有效減少了植物的水分散失，間接提高了植物的抗旱能力[16]。此結(jié)果說明，AtCIPK23可能參與了植物的干旱逆境響應(yīng)。本研究的結(jié)果表明，在干旱脅迫下，AtCIPK23轉(zhuǎn)基因煙草表現(xiàn)出了較為耐旱的表型。其葉片水分散失的速率較低、細(xì)胞膜的完整性較好，葉綠素含量較高，均有利于干旱環(huán)境中水分的吸收與保持、保護(hù)細(xì)胞內(nèi)正常的生理生化反應(yīng)，從而使轉(zhuǎn)基因植株對(duì)干旱具有更強(qiáng)的耐受性。
在植物的干旱響應(yīng)中，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)發(fā)揮著十分重要的作用。前人的研究結(jié)果說明，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累有利于對(duì)脅迫下植物體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧和自由基的清除、細(xì)胞滲透勢的降低以及葉片水分含量的維持[24]。本研究的結(jié)果也證實(shí)了轉(zhuǎn)基因植株積累了較多的脯氨酸及可溶性糖等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，這些物質(zhì)的含量較高，可能也是導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因煙草具有較強(qiáng)的耐旱能力的原因之一。
植物在逆境脅迫時(shí)，會(huì)產(chǎn)生活性氧物質(zhì)ROS(reactive oxygen species, ROS)。ROS如果不及時(shí)清除，則會(huì)攻擊植物細(xì)胞的DNA、蛋白質(zhì)及膜脂質(zhì)等生物大分子，從而使植物細(xì)胞不能夠正常行使功能，導(dǎo)致植物生長受到影響，并降低農(nóng)作物的產(chǎn)量與品質(zhì)[25]。SOD、POD、CAT 和 APX 等保護(hù)酶類，構(gòu)成了植物的活性氧清除系統(tǒng)。它們在植物體內(nèi)共同發(fā)揮作用，能夠減輕ROS對(duì)植物細(xì)胞的傷害[26-29]。Zhou等[8]的研究結(jié)果證實(shí)，CKP8能夠調(diào)節(jié)CAT3的活性，提高擬南芥對(duì)ROS的清除能力，從而提高了擬南芥的抗旱性。本研究也得出了類似的研究結(jié)果。DAB染色的結(jié)果顯示，過表達(dá)AtCIPK23的煙草植株對(duì)ROS的清除能力強(qiáng)于野生型，同時(shí)，其NtSOD、NtCAT和NtAPX基因的表達(dá)量明顯提升，暗示了對(duì)ROS的清除能力較強(qiáng)，是轉(zhuǎn)AtCIPK23的煙草植株抗旱能力增強(qiáng)的重要原因。
干旱相關(guān)基因的誘導(dǎo)表達(dá)，與植物的耐旱性密切相關(guān)。在干旱脅迫下，OsCIPK23過表達(dá)植株的干旱相關(guān)基因DREB2A、rd29A、Rab18 及NCED3被強(qiáng)烈誘導(dǎo)表達(dá)[15]。本研究的結(jié)果表明，轉(zhuǎn)AtCIPK23基因煙株表現(xiàn)出耐旱性增強(qiáng)，同時(shí)，伴隨著3個(gè)干旱相關(guān)基因NtDREB、NtLEA5和NtCDPK2在轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)表達(dá)量的急劇上升。這就說明，CIPK蛋白在不同的物種內(nèi)可能采取類似的機(jī)制參與了植物對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)。
本研究的結(jié)果證實(shí)，AtCIPK23能夠增強(qiáng)煙草的耐旱能力。然而，植物對(duì)外界干旱脅迫的分子響應(yīng)，是一個(gè)較為復(fù)雜的過程。AtCIPK23究竟是如何調(diào)控?zé)煵菁?xì)胞的生理生化活動(dòng)，從而實(shí)現(xiàn)其耐旱能力的增強(qiáng)，尚待進(jìn)一步研究。
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(編輯:宋亞珍)
Physiological Response of Transgenic Tobacco CarryingAtCIPK23 Genes to Drought Stress
YANG Linglong1, LI Ke1, LU Liming1,2*
(1 College of Agronomy, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China; 2 State Key Laboratory of Plant Physiology and Biochemistry, Beijing 100094, China)
In order to study the roles of ArabidopsisAtCIPK23 gene played in response to drought stress, we treated threeAtCIPK23 gene transgenic lines and wide type tobacco K326 by drought stress. The leaf water loss rate, proline, chlorophyll, soluble sugar contents and electrical conductivity were measured. Meanwhile, ROS elimination ability, and gene expression of ROS elimination and drought resistance related genes were analyzed. The results showed that: (1) the water loss speed of leaves detached from transgenic lines distinctly slower than that of K326. After 7 days of drought stress treatment in natural environment, K326 plants showed yellowish and withered. The re-watering survival rate of transgenic lines was higher than that of K326 after 7 days drought stress. (2) The concents of proline, chlorophyll and soluble sugar in transgenic lines were obvious higher than that of K326. The electrical conductivity of transgenic lines leaves was significantly lower than that of K326. (3) Under drought stress, the accumulation of H2O2in K326 was significantly higher than that of three transgenic lines, and three ROS elimination related genesNtSOD,NtCATandNtAPXwere up-regulated only in the transgenic lines. (4) The drought resistance related genesNtAREB,NtLEA5 andNtCDPK2 were induced by drought stress in transgenic tobacco plants. These results suggest that theAtCIPK23 gene can improve the drought stress ability of transgenic tobacco.
tobacco; transgenic plants;AtCIPK23 gene; Ca2+signal; drought stress
1000-4025(2016)08-1534-07
10.7606/j.issn.1000-4025.2016.08.1534
2016-05-08;修改稿收到日期:2016-07-08
植物生理學(xué)與生物化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(SKLPPBKF1505)
楊玲瓏(1989-),女，在讀碩士研究生，主要從事煙草栽培生理研究。E-mail：23702967@qq.com
*通信作者:魯黎明，副教授，主要從事煙草栽培生理研究。E-mail：luliming@sicau.edu.cn
Q789
A
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