基于EPMA的背角無齒蚌貝殼中元素分布的初步研究

陳修報,姜 濤,劉洪波,蘇彥平,楊 健

?

基于EPMA的背角無齒蚌貝殼中元素分布的初步研究

陳修報,姜 濤,劉洪波,蘇彥平,楊 健*

(中國水產科學研究院淡水漁業(yè)研究中心,中國水產科學研究院長江中下游漁業(yè)生態(tài)環(huán)境評價和資源養(yǎng)護重點實驗室,江蘇 無錫 214081)

應用電子顯微探針元素分析技術,對背角無齒蚌(Anodonta woodiana)的貝殼(棱柱層和珍珠層)進行了19種元素(Ag、Al、Au、Ca、Co、Cu、Fe、Hf、Mg、Mn、Mo、Na、Re、Se、Sn、Sr、Tl、V、Zn)分布特征的初步研究.元素面分布分析和定量線分析結果均直觀而明顯地表明:貝殼中Ca含量最高,Hf、Re、Mn、Al、Co、Fe、Sr、Cu和Na的含量較低,而Au、Mg、Tl、Zn、Sn、Ag、V、Mo和Se的含量甚少.Mn在珍珠層的分布高于棱柱層,殼頂區(qū)域的珍珠層的含量(0.087±0.045)%顯著高于棱柱層(0.030±0.025)%(<0.05),腹緣區(qū)域的珍珠層的含量(0.072±0.055)%亦顯著高于棱柱層(0.044±0.025)%(<0.05),而其余元素在貝殼中均勻分布.

背角無齒蚌；貝殼；元素微化學；EPMA；生物監(jiān)測

雙殼貝類(包括軟組織和貝殼)是監(jiān)測水環(huán)境中元素(包含重金屬)污染動態(tài)的理想指示生物[1-5].貝殼的主要結構為鈣質的棱柱層和珍珠層[6].與軟組織相比,貝殼(特別是棱柱層和珍珠層)具有易保存,與元素結合穩(wěn)定(不發(fā)生分解或釋放),甚至生物體死亡后仍能記錄歷史環(huán)境等優(yōu)點[3,7].因此,基于貝殼的元素污染監(jiān)測越來越受到重視[8-9].

背角無齒蚌()隸屬于軟體動物門、瓣鰓綱、蚌科,在亞洲、歐洲和北美洲等世界范圍內廣泛分布[10-12].不僅具有育珠,食用和凈化水質的作用[12],其貝殼還具備藥用(珍珠母)價值[10].此外,作為“淡水貝類觀察”研究體系(Freshwater Mussel Watch)的專用指示生物[13-14],該蚌軟組織已被廣泛用于監(jiān)測國內、外水環(huán)境的農藥[15-16]、有機錫[13]以及重金屬[14,17-19]的污染狀況,而且貝殼也被成功用于監(jiān)測和評價重金屬(Mn、Fe、Cu、Zn、Cd)的污染水平[2].

貝殼棱柱層和珍珠層對元素如Cu[7]、Mn[20]的富集特征差異明顯.然而,迄今利用貝殼監(jiān)測水環(huán)境元素污染動態(tài),幾乎都是通過消解整個貝殼之后應用原子吸收光譜法(AAS)[2]、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(ICP-AES)[21]或電感耦合等離子質譜儀(ICP-MS)[9,22]等測定,完全丟失了不同殼層元素分布特征的重要信息[3].此外,激光剝蝕電感耦合等離子體質譜儀(LA-ICP- MS)也被嘗試用于在保留貝殼原有結構的情況下分析元素分布特征[3],然而該技術也存在著對測定殼層表面剝蝕損傷較重,結果無法圖像化的局限.

電子探針顯微分析儀(EPMA)具有無損傷測定、靈敏度高、圖像分析能力強、對樣本量需求少(1個樣本即可客觀地闡明元素分布特征)等優(yōu)點[23],完全能夠避免上述局限.基于EPMA,古丸明等[24]分析了不同鹽度水體中河蜆(sp.)貝殼中Sr和Ca的分布,發(fā)現(xiàn)Sr/Ca比值與鹽度總體呈正相關;Shirai等[23]通過北極蛤()的1片貝殼成功闡釋了不同殼層對Sr、Mg和S的吸收機制及分布特征.本研究擬利用EPMA首次探索淡水蚌類背角無齒蚌貝殼(棱柱層和珍珠層)中19種元素(Ag、Al、Au、Ca、Co、Cu、Fe、Hf、Mg、Mn、Mo、Na、Re、Se、Sn、Sr、Tl、V、Zn)的分布特征,以期為正在開展的“淡水貝類觀察”研究體系精準篩選更為靈敏的指示物(貝殼殼層)提供支撐.

1 材料與方法

1.1 材料處理

從2008年在太湖采集的背角無齒蚌中選擇1個貝殼無畸形、無損傷的代表性樣本,3齡,殼長13.3cm,殼寬5.4cm,殼高8.1cm.解剖去除軟組織,將貝殼用Milli-Q水清洗干凈,自然晾干.用切割機(Accutom-50型,丹麥Struers公司)沿殼頂至腹緣的垂直方向切割出3mm寬的片段(圖1).環(huán)氧樹脂(Epofix,丹麥Struers公司)包埋固定之后,1200目砂紙對橫截面(圖1)進行精磨.為了滿足儀器分析的規(guī)格需求,將該片段分割為長度均勻的5等份,最后用磨拋機(Rotopol-35型,丹麥Struers公司)對用于分析的橫截面進行拋光.元素測定之前,樣本用Milli-Q水超聲波水浴洗凈.

1.2 分析方法

為了進行元素電子探針顯微分析,樣本在真空蒸著裝置中鍍碳膜(JEE-420,日本JEOL公司).因為貝殼殼頂包含著貝類整個生活階段的全部信息[25],因此用EPMA(JXA-8100,日本JEOL公司)首先進行該部分的元素的X-射線強度圖像化(X-ray Intensity Maps)分析(簡稱面分布分析),以初步判別元素在不同殼層的分布特征.此時EPMA使用的電子束電流為5×10-7A,記錄時間為0.1s,像素為7μm×7μm,電子束電流聚焦直徑為5 μm.對于分布表現(xiàn)出明顯差異的元素,則進一步掃描殼頂區(qū)域和能夠靈敏反映元素富集的新形成的腹緣區(qū)域[3](圖1),做直線定量測定(簡稱定量線分析).此時EPMA使用的加速電壓為15kV,電子束流為2.0×10-8A,束斑直徑為5μm,每點駐留時間為15s,樣品點分析間隔為10μm.

1.3 統(tǒng)計分析

本研究的統(tǒng)計分析使用美國IBM公司的SPSS 16.0軟件.元素濃度均為干重含量,以平均值±標準差表示.差異的顯著水平判定使用Mann-Whitney測驗進行.

2 結果與討論

背角無齒蚌貝殼由表及里依次為角質層、方解石結構的棱柱層和霰石結構的珍珠層(圖2).面分布分析顯示背角無齒蚌貝殼(殼頂區(qū)域)中Ca含量最高(元素含量約占38%),Hf、Re、Mn、Al、Co、Fe、Sr、Cu和Na的含量較低(元素含量約占0.7%~0.2%),而Au、Mg、Tl、Zn、Sn、Ag、V、Mo和Se的含量甚少(元素含量約占0.1%~0),(圖3).Mn在珍珠層的分布表現(xiàn)出高于棱柱層的趨勢,其余元素在棱柱層和珍珠層之間分布均勻(圖3).定量線分析表明,Mn在殼頂區(qū)域的珍珠層中的含量(0.087±0.045)%顯著高于棱柱層(0.030±0.025)% (<0.05,圖4),并且其在腹緣區(qū)域的珍珠層中的含量(0.072±0.055)%亦顯著高于棱柱層(0.044±0.025)% (<0.05,圖4).

背角無齒蚌貝殼由外套膜邊緣上皮細胞和結締組織細胞分泌形成[26].外套膜細胞在分泌形成厚度約100μm的角質層后,以此為模板,分泌形成多邊形棱柱體,按由外側至內側,由背側至腹側的方式堆砌成棱柱層,最后分泌形成珍珠層,并隨著生長時間的推移而逐步加厚[26].因此,貝殼的生物礦化是由細胞控制的,并受到水體理化特征等環(huán)境因素的影響[27].研究發(fā)現(xiàn)貝殼富集元素有主動吸收(生物礦化)和被動吸附(從周圍水環(huán)境中簡單吸附)兩種途徑[9],而主動吸收是元素積累的主要方式[3].

貝殼主要由方解石(棱柱層)和霰石(珍珠層)構成,CaCO3是貝殼的最主要成分,并含有少量的Mn、Ni、Mo、Mg等元素[22,28].本研究的面分布分析結果,從橫截面的角度進一步證實了背角無齒蚌貝殼的元素含量特征.與傳統(tǒng)的將貝殼整體消解、測定相比,波蘭Licheńskie Lake中背角無齒蚌貝殼的Mn、Fe、Zn和Cu含量分別為200, 70, 35和14μg/g, Licheński Channel中背角無齒蚌貝殼的Mn、Fe、Zn和Cu含量分別為180,50,42和11μg/g,除了Zn含量偏高之外,這兩水域背角無齒蚌貝殼元素含量的高低順序與本研究一致[2].同為無齒蚌屬的貝殼中Ca、Mn、Mo、Zn、Cu、V、Co和Tl含量分別為383631, 289, 104, 46, 11, 3, 1和0μg/g[22],元素含量高低順序總體和背角無齒蚌差別較大,這提示貝殼元素組成在種間具有特殊性.

迄今,對于元素在貝殼中分布特征的研究非常有限.Ron?evi?等[21]認為元素在貝殼中的分布與殼層結構有關,由方解石構成的棱柱層容易吸收比Ca離子半徑小的元素(如Fe、Mn、Cu、Zn),而霰石構成的珍珠層更容易吸收比Ca離子半徑大的元素(如Na).然而,面分布分析結果顯示Ag、Al、Au、Ca、Co、Cu、Fe、Hf、Mg、Mo、Na、Re、Se、Sn、Sr、Tl、V和Zn這18種元素在背角無齒蚌的棱柱層和珍珠層中呈均勻分布,并未表現(xiàn)出顯著的殼層分布差異(圖2).相反,雖然Mn離子半徑小于Ca,背角無齒蚌珍珠層卻富集了更多的Mn(圖2,3).因此,背角無齒蚌貝殼中元素的分布特征不支持Ron?evi?等[21]觀點.另有研究表明元素在貝殼中的分布與水環(huán)境如鹽度[24]、元素含量[3,7,29]密切相關.河蜆貝殼珍珠層中Sr含量和鹽度呈正相關,根據(jù)Sr含量可以反演其生活履歷[24].翡翠貽貝()貝殼(特別是新形成部分)中重金屬如Mn、Cd、Cu、Pb,會隨著水體中相應元素含量上升而顯著增加[3].本研究發(fā)現(xiàn)背角無齒蚌貝殼珍珠層Mn含量顯著高于棱柱層,這與淡水珍珠貝()貝殼Mn分布特征一致[20],而不同于淡水貝類貝殼Mn在珍珠層和棱柱層均勻分布[25].太湖水體未受到明顯的重金屬污染, Mn平均含量為48.3μg/L,但其含量變異系數(shù)為36%(變化范圍為26.3~88.3μg/L)[30],提示背角無齒蚌貝殼的珍珠層比棱柱層能夠更為靈敏地反映出水環(huán)境中元素(如Mn)的動態(tài).研究表明應用熱處理(加熱到350~400℃)等方法能夠分離出貝殼的珍珠層[31-32],因此,利用珍珠層監(jiān)測漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重金屬污染具有可行性.值得注意的是,雙殼貝類珍珠層與其分泌的產物珍珠具有相近的組分與構造[28],除此之外,珍珠還有插珠技術成熟、取樣方便、分析前處理相對簡單等優(yōu)點,今后應該可以作為貝殼珍珠層的理想“替代品”,更簡便、快速地用于上述重金屬污染的監(jiān)測.相關進一步的研究需要得到高度重視.

3 結論

3.1 在未受明顯重金屬污染的自然水體中,背角無齒蚌貝殼中Ca為最主要成分,Hf、Re、Mn、Al、Co、Fe、Sr、Cu和Na的含量較低,Au、Mg、Tl、Zn、Sn、Ag、V、Mo和Se的含量甚少;Mn在珍珠層的分布顯著高于棱柱層,Ag、Al、Au、Ca、Co、Cu、Fe、Hf、Mg、Mo、Na、Re、Se、Sn、Sr、Tl、V和Zn在貝殼中均勻分布.

3.2 污染水體中的背角無齒蚌貝殼元素(特別是有毒有害重金屬Pb、Cd、Cr、Hg、As等)分布差異性還需進一步監(jiān)測驗證.然而,即使在元素背景含量較低的水體中,其珍珠層已顯示出比棱柱層更為靈敏地反映Mn等元素的變化動態(tài).因此,在今后的“淡水貝類觀察”研究體系中建議選用珍珠層(包括其分泌產物珍珠)作為水環(huán)境重金屬(至少是Mn)污染監(jiān)測和評價的指示物.

[1] 賀廣凱.黃渤海沿岸經濟貝類體中重金屬殘留量水平 [J]. 中國環(huán)境科學, 1996,16(2):96-100.

[2] Królak E, Zdanowski B. The bioaccumulation of heavy metals by the mussels(Lea, 1834) and(Pall.) in the heated Konin Lakes [J]. Archives of Polish Fisheries, 2001,9:229-237.

[3] Bellotto V R, Miekeley N. Trace metals in mussel shells and corresponding soft tissue samples: a validation experiment for the use ofshells in pollution monitoring [J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2007,389:769-776.

[4] Makarenko T V, Baychorov V M. Heavy metals content in the shells and soft tissues of mollusks of the water bodies of Gomel and adjacent territories [J]. Hydrobiological Journal, 2014,2:33-40.

[5] 孫元敏,馬志遠,黃海萍.我國海島潮間帶貝類體中重金屬含量及其評價 [J]. 中國環(huán)境科學, 2015,35(2):574-578.

[6] Paula S M, Silveira M. Studies on molluscan shells: contributions from microscopic and analytical methods [J]. Micron, 2009, 40:669-690.

[7] Andrello A C, Lopes F, Galvao T D. Mussel shell evaluation as bioindicator for heavy metals [C]//Deppman A, Krug C, Zahn G S, Lubian J, Added N, Timoteo V S (Ed), XXXII Brazilian Workshop on Nuclear Physics, AIP Conference Proceedings, 2010:110-113.

[8] Shoults-Wilson W A, Seymour L, Unrine J M, et al. Improving data resolution and statistical rigor in the analysis of bivalve shells [J]. Environmental Science: Processes Impacts, 2014,16:247-255.

[9] Bolotov I N, Pokrovsky O S, Auda Y, et al. Trace element composition of freshwater pearl musselsspp. across Eurasia: testing the effect of species and geographic location [J]. Chemical Geology, 2015,402:125-139.

[10] 劉月英,張文珍,王躍先,等.淡水軟體動物 [M]. 科學出版社, 1979.

[11] Watters G T. A synthesis and review of the expanding range of the Asian freshwater mussel(Lea, 1834) (Bivalvia: Unionidae) [J]. Veliger, 1997,40:152-156.

[12] Chen X, Liu H, Su Y, et al. Morphological development and growth of the freshwater musselfrom early juvenile to adult [J]. Invertebrate Reproduction and Development, 2015,59(3):131-140.

[13] Yang J, Harino H, Liu H, et al. Monitoring the organotin contamination in the Taihu Lake of China by bivalve mussel[J]. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology, 2008,81:164-168.

[14] 陳修報,蘇彥平,劉洪波,等.移殖“標準化”背角無齒蚌監(jiān)測五里湖重金屬污染 [J]. 中國環(huán)境科學, 2014,34(1):225-231.

[15] Uno S, Shiraishi H, Hatakeyama S, et al. Accumulative characteristics of pesticide residues in organs of bivalves (and) under natural conditions [J]. Archives of Environmental Contamination and Toxicology, 2001,40:35-47.

[16] Bian X, Liu H, Gan J, et al. HCH and DDT residues in bivalvesfrom the Taihu Lake, China [J]. Archives of Environmental Contamination and Toxicology, 2009,56:67-76.

[17] 楊 健,王 慧,朱宏宇,等.背角無齒蚌()在五里湖中的重金屬富集 [J]. 長江流域資源與環(huán)境, 2005,14(3): 362-366.

[18] Liu H, Yang J, Gan J. Trace element accumulation in bivalve musselsfrom Taihu Lake, China [J]. Archives of Environmental Contamination and Toxicology, 2010, 59:593-601.

[19] Chen X, Yang J, Liu H, et al. Element concentrations in a unionid mussel () at different life stages [J]. Journal of the Faculty of Agriculture Kyushu University, 2012,57:139-144.

[20] Nystr?m J, Lindh U, Dunca E, et al. A study ofshells from the River Paulistr?ms?n, S. Sweden [J]. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section B - Beam Interactions with Materials and Atoms, 1995,104:612-618.

[21] Ron?evi? S, Svedru?i? L P, Smeti?ko J, et al. ICP-AES analysis of metal content in shell of musselfrom Croatian coastal waters [J]. International Journal of Environmental Analytical Chemistry, 2010,90(8):620-632.

[22] Ravera O, Cenci R, Beone G M, et al. Trace element concentrations in freshwater mussels and macrophytes as related to those in their environment [J]. Journal of Limnology, 2003, 62:61-70.

[23] Shirai K, Sch?ne B R, Miyaji T, et al. Assessment of the mechanism of elemental incorporation into bivalve shells () based on elemental distribution at the microstructural scale [J]. Geochimica et Cosmochimica Acta, 2014,126:307-320.

[24] 古丸明,尾之內健次,柳瀬泰宏,等. EPMA (Electron Probe Micro Analyzer) による塩分濃度の異なる水域で採集されたヤマトツヅミ貝殼のSr/Ca比 [J]. 日本水産學會誌, 2009,75(3):443- 450.

[25] Siegele R, Orlic I, Cohen D D, et al. Manganese profiles in freshwater mussel shells [J]. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section B - Beam Interactions with Materials and Atoms, 2001,181:593-597.

[26] 劉 彬,蒲德永,王志堅,等.橢圓背角無齒蚌貝殼棱柱層的結構 [J]. 四川動物, 2013,32(2):223-227.

[27] Machado J, Lopes-Lima M. Calcification mechanism in freshwater mussels: potential targets for cadmium [J]. Environmental Toxicology and Chemistry, 2011,93(9):1778-1787.

[28] Jacob D E, Soldati A L, Wirth R, et al. Nanostructure, composition and mechanisms of bivalve shell growth [J]. Geochimica et Cosmochimica Acta, 2008,72:5401-5415.

[29] Gillikin D P, Dehairs F, Baeyens W, et al. Inter- and intra-annual variations of Pb/Ca ratios in clam shells (): a record of anthropogenic lead pollution? [J] Marine Pollution Bulletin, 2005,50(12):1530-1540.

[30] Liang F, Yang S, Sun C. Primary health risk analysis of metals in surface water of Taihu Lake, China [J]. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology, 2011,87:404-408.

[31] Bourgoin B P. A rapid and inexpensive technique to separate the calcite and nacreous layers inshells [J]. Marine Environmental Research, 1988,25(2):125-129.

[32] Rivero L E, Lares M L. A technique for the separation of the most recently deposited nacreous layer inshells for trace metal analysis [J]. Ciencias Marinas, 2004,30(2):343-347.

* 責任作者, 研究員, jiany@ffrc.cn

A preliminary study on elemental profile in the shell of freshwater bivalve Anodonta woodiana

CHEN Xiu-bao, JIANG Tao, LIU Hong-bo, SU Yan-ping, YANG Jian*

(Key Laboratory of Fishery Eco-Environment Assessment and Resources Conservation in Middle and Lower Reaches of the Yangtze River, Freshwater Fisheries Research Center, Chinese Academy of Fishery Sciences, Wuxi 214081, China). China Environmental Science, 2016,36(8)：2516~2521

An electron probe microanalyzer (EPMA) was used to analyze the content profiles of 19 elements (Ag, Al, Au, Ca, Co, Cu, Fe, Hf, Mg, Mn, Mo, Na, Re, Se, Sn, Sr, Tl, V, and Zn) in the shell (prismatic layer and nacreous layer) of freshwater bivalve. Results of both the line transect and map analyses clearly showed that the element contents generally decreased in the order of Ca, Hf, Re, Mn, Al, Co, Fe, Sr, Cu, Na, Au, Mg, Tl, Zn, Sn, Ag, V, Mo, and Se. Level of Mn in the nacreous layer was evidently higher than that of prismatic layer. Furthermore, Mn content in the nacreous layer of the umbo (0.087±0.045)% was significantly higher than that in the prismatic layer (0.030±0.025)% (<0.05). Likewise, Mn content in the nacreous layer nearby the ventral edge (0.072±0.055)% was significantly higher than that in the prismatic layer (0.044±0.025)% (<0.05). The present study can provide a better basis for selecting a more sensitive bioindicator in our undertaking “Freshwater Mussel Watch” project.

；shell；element microchemistry；EPMA；biomonitoring

X835

A

1000-6923(2016)08-2516-06

陳修報(1983-),男,江蘇徐州人,助理研究員,博士,從事水域生態(tài)環(huán)境的評價與保護研究.發(fā)表論文19篇.

2016-01-05

國家自然科學基金項目(31502166);中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項資金項目(2015JBFM13)