黑曲霉產(chǎn)胺氧化酶培養(yǎng)及誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

周小虎，朱霞，王磊，焦夢(mèng)然，黃瑤，付彩霞，曹約澤，高冰，汪超，李冬生，徐寧*

（1.湖北工業(yè)大學(xué)工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心湖北省食品發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，湖北武漢430068；2.湖北土老憨調(diào)味食品股份有限公司湖北省發(fā)酵調(diào)味品工程技術(shù)研究中心，湖北宜昌443000；3.湖北順溪生物食品股份有限公司，湖北十堰442300）

黑曲霉產(chǎn)胺氧化酶培養(yǎng)及誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

周小虎1，朱霞1，王磊1，焦夢(mèng)然1，黃瑤1，付彩霞2，曹約澤3，高冰1，汪超1，李冬生1，徐寧1*

（1.湖北工業(yè)大學(xué)工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心湖北省食品發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，湖北武漢430068；2.湖北土老憨調(diào)味食品股份有限公司湖北省發(fā)酵調(diào)味品工程技術(shù)研究中心，湖北宜昌443000；3.湖北順溪生物食品股份有限公司，湖北十堰442300）

黑曲霉可經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生胺氧化酶，該酶具有催化生物胺氧化脫氨生成相應(yīng)醛、氨氣和過(guò)氧化氫的特性。黑曲霉胺氧化酶產(chǎn)生分菌體生長(zhǎng)和誘導(dǎo)產(chǎn)酶兩個(gè)階段。通過(guò)單因素試驗(yàn)優(yōu)化得出黑曲霉產(chǎn)胺氧化酶的菌體生長(zhǎng)最佳培養(yǎng)條件：氮源為NaNO3，碳源為麥芽糖，接種量1%，培養(yǎng)時(shí)間24 h；誘導(dǎo)產(chǎn)酶的最佳培養(yǎng)條件：誘導(dǎo)氮源為質(zhì)量濃度60 g/L的正己胺，誘導(dǎo)碳源為葡萄糖，培養(yǎng)時(shí)間36 h，培養(yǎng)溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速160 r/min，初始pH 7.0，胺氧化酶酶活力從誘導(dǎo)前的1 006.5 U/g提升至1 422.4U/g，提高幅度為41.3%。

黑曲霉；胺氧化酶；生物胺；條件優(yōu)化

生物胺是一類具有生物活性含氮的低分子質(zhì)量有機(jī)化合物的總稱，是生成激素、核酸、生物堿、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的前體，具有維持免疫系統(tǒng)代謝活性和正常的內(nèi)臟功能的作用［1］。人體內(nèi)適量的生物胺能調(diào)節(jié)各種正常的生理作用，但當(dāng)存在過(guò)量生物胺時(shí)，就會(huì)改變正常生理機(jī)能，從而產(chǎn)生毒性作用［2］。發(fā)酵食品中生物胺的主要來(lái)源是某些細(xì)菌產(chǎn)生的氨基酸脫羧酶催化氨基酸發(fā)生了脫羧反應(yīng)而形成［3-4］。胺氧化酶廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中，催化各種小分子胺類物質(zhì)氧化脫氨基形成相應(yīng)的醛、過(guò)氧化氫和氨［5-7］。微生物中黑曲霉產(chǎn)胺氧化酶研究最早，當(dāng)其在以正丁胺作為唯一氮源的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)可獲得三種胺氧化酶，分別為MAO-N、AO-Ⅰ、AO-Ⅱ，前者為含黃素單胺氧化酶（EC 1.4.3.4），可催化一級(jí)胺、一些二級(jí)和三級(jí)胺氧化；后兩種為含銅胺氧化酶（EC 1.4.3.6），具有氧化一級(jí)單胺活性和二元胺的特性［8-10］。

因此胺氧化酶可以催化分解生物胺，在發(fā)酵食品中使用可降低生物胺的含量，保證食品安全［11-12］。黑曲霉工業(yè)應(yīng)用廣泛，也是安全的食品發(fā)酵菌種［13］，本研究以一株從黑曲霉3.350分離出的FF05菌株為出發(fā)菌，研究了其產(chǎn)生胺氧化酶的培養(yǎng)及誘導(dǎo)條件，為該酶的應(yīng)用提供了理論支持。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

黑曲霉（Aspergillus niger）FF05：湖北省食品發(fā)酵工程技術(shù)研究中心保藏；辣根過(guò)氧化物酶（300 U/mg）、愈創(chuàng)木酚：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

種子培養(yǎng)基：豆汁1 000 mL，可溶性淀粉20 g，MgSO40.5 g，KH2PO41.0 g，（NH4）2SO40.5 g，pH7.0，121℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖30 g，（NH4）2SO42.0 g，K2HPO41.0 g，MgSO40.5g，F(xiàn)eSO40.01g，酵母抽提物1g，蒸餾水1000mL，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

誘導(dǎo)培養(yǎng)基：蔗糖50g，正丁胺5g，K2HPO41.0g，MgSO40.5 g，F(xiàn)eSO40.01 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

1.2儀器與設(shè)備

LDZX-50FBS立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；ZAD-1270生化培養(yǎng)箱：上海智城分析儀器制造公司；WFJ2000紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海尤尼柯儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1黑曲霉培養(yǎng)

從黑曲霉斜面接種1～2環(huán)孢子到種子培養(yǎng)基（裝液量50 mL/250 mL），30℃、180 r/min培養(yǎng)36 h。菌體生長(zhǎng)培養(yǎng)條件：取體積分?jǐn)?shù)1%種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，180 r/min培養(yǎng)36 h。誘導(dǎo)產(chǎn)酶培養(yǎng)條件：取體積分?jǐn)?shù)1%發(fā)酵液接種至誘導(dǎo)培養(yǎng)基，30℃、180 r/min培養(yǎng)24 h。

1.3.2產(chǎn)胺氧化酶條件的優(yōu)化

（1）菌體生長(zhǎng)條件的優(yōu)化

以發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別采用2.0g的尿素、（NH4）2SO4、NH4NO3和NaNO3代替發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源，其他成分不變，考察氮源對(duì)產(chǎn)胺氧化酶酶活力的影響；

以發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別采用30 g的葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉和甘露醇代替發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源，其他成分不變，考察碳源對(duì)產(chǎn)胺氧化酶酶活力的影響；

以菌體生長(zhǎng)培養(yǎng)條件為基礎(chǔ)，改變培養(yǎng)時(shí)間分別為12 h、24 h、36 h、48 h、60 h和72 h，其他條件不變，考察培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)胺氧化酶酶活力的影響；

以菌體生長(zhǎng)培養(yǎng)條件為基礎(chǔ)，在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別接種0.1%、0.2%、0.5%、1.0%、1.5%和2.0%的種子液，其他條件不變，考察接種量對(duì)產(chǎn)胺氧化酶酶活力的影響。

（2）誘導(dǎo)產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

以誘導(dǎo)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別采用5 g/L的丙胺、正丁胺、正戊胺、正己胺和芐胺替代誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的氮源，其他成分不變，考察誘導(dǎo)氮源對(duì)產(chǎn)胺氧化酶酶活力的影響。

以誘導(dǎo)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別調(diào)整正己胺質(zhì)量濃度為0.5 g/L、1 g/L、2 g/L、4 g/L、6 g/L、8 g/L和10 g/L，其他成分不變，考察正己胺質(zhì)量濃度對(duì)產(chǎn)胺氧化酶酶活力的影響。

以誘導(dǎo)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別采用50g/L的葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉和甘露醇替代誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的碳源，其他成分不變，考察誘導(dǎo)碳源對(duì)產(chǎn)胺氧化酶酶活力的影響。

以誘導(dǎo)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別調(diào)整誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間為12 h、 24 h、36 h、48 h、60 h；誘導(dǎo)培養(yǎng)溫度為20℃、23℃、25℃、28℃、30℃、33℃、35℃；搖床轉(zhuǎn)速為100 r/min、120 r/min、140 r/min、160 r/min、180 r/min、200 r/min；初始pH值為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5；考察不同誘導(dǎo)條件對(duì)產(chǎn)胺氧化酶酶活力的影響。

1.3.3胺氧化酶粗酶提取

將1 g菌絲放入10 mL離心管中，加入5 mL的硫酸鉀緩沖液，放在裝滿冰塊的燒杯中，進(jìn)行冷凍超聲破碎。設(shè)定超聲功率為60%，超聲間隔為2 s，選擇超聲時(shí)間為5 min。將超聲破碎獲得的粗酶液，10 000 r/min離心10 min，去沉淀，取上清液，測(cè)量酶活。加入pH 7.0的磷酸鉀緩沖液，定容，保存于4℃環(huán)境中待用。

1.3.4胺氧化酶酶活力測(cè)定

胺氧化酶先作用于胺類生成相應(yīng)的醛類、H2O2和氨，然后使用辣根過(guò)氧化物酶催化釋放的H2O2產(chǎn)生氧氣，使無(wú)色的愈創(chuàng)木酚氧化成紅棕色的四鄰甲氧基連酚。該產(chǎn)物在波長(zhǎng)470 nm處有最大的光吸收，可通過(guò)測(cè)定ΔA470nm間接表示胺氧化酶的活力［14-15］。3 mL反應(yīng)體系包括0.1 mol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖液，0.2 mmol/L正丁胺，0.2 mg/mL辣根過(guò)氧化物酶，0.05 mol/L愈創(chuàng)木酚，100 μL稀釋酶液。25℃條件下檢測(cè)波長(zhǎng)470 nm處的吸光度值變化（ΔA470nm/min）。以每分鐘內(nèi)A470nm變化0.01為1個(gè)酶活性單位（U）。相對(duì)酶活力以每組實(shí)驗(yàn)中所產(chǎn)酶活力最高為100%。

2　結(jié)果與分析

2.1黑曲霉產(chǎn)酶培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.1.1氮源對(duì)胺氧化酶酶活力的影響

圖1　氮源對(duì)胺氧化酶酶活力的影響Fig.1 Effect of nitrogen sources on amine oxidase production

由圖1可知，NaNO3作為發(fā)酵培養(yǎng)基氮源時(shí)酶活最高，尿素作為發(fā)酵培養(yǎng)基氮源時(shí)酶活最低，可能是由于有機(jī)氮源尿素相對(duì)于無(wú)機(jī)氮源利用率較低。因此選擇NaNO3為發(fā)酵培養(yǎng)基最適氮源。

2.1.2碳源對(duì)產(chǎn)胺氧化酶酶活力的影響

由圖2可知，不同碳源對(duì)胺氧化酶酶活的影響依次為麥芽糖＞果糖＞葡萄糖＞淀粉＞蔗糖＞甘露醇。因此選擇麥芽糖為發(fā)酵培養(yǎng)基最適碳源。

圖2　碳源對(duì)胺氧化酶酶活力的影響Fig.2 Effect of different carbon sources on amine oxidase production

2.1.3培養(yǎng)時(shí)間對(duì)胺氧化酶酶活力的影響

圖3　培養(yǎng)時(shí)間對(duì)胺氧化酶酶活力的影響Fig.3 Effect of culture time on amine oxidase production

由圖3可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的增長(zhǎng)，誘導(dǎo)后胺氧化酶的酶活呈現(xiàn)先增高再降低的趨勢(shì)，培養(yǎng)24h時(shí)，酶活達(dá)到最高。因此選擇24 h為最適菌體培養(yǎng)時(shí)間。

2.1.4接種量對(duì)胺氧化酶酶活力的影響

圖4　接種量對(duì)胺氧化酶酶活力的影響Fig.4 Effect of inoculum on amine oxidase production

由圖4可知，接種量為0.1%～1.0%時(shí)，胺氧化酶酶活較高，接種量＞1.0%后，酶活明顯下降。可能是因?yàn)榻臃N量過(guò)多，空間、營(yíng)養(yǎng)不夠，導(dǎo)致菌絲球直徑小，菌種不夠成熟，影響了后面的誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。因此選擇1.0%為最適接種量。在此優(yōu)化的培養(yǎng)條件下，胺氧化酶酶活為1 006.5 U/g。

2.2誘導(dǎo)培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.2.1誘導(dǎo)氮源對(duì)胺氧化酶酶活力的影響

圖5　誘導(dǎo)氮源對(duì)胺氧化酶酶活力的影響Fig.5 Effect of induction nitrogen sources on amine oxidase production

由圖5可知，不同誘導(dǎo)氮源對(duì)胺氧化酶的誘導(dǎo)結(jié)果差異性很大，丙胺、芐胺誘導(dǎo)能力很低，相對(duì)酶活力＜30%。正己胺的誘導(dǎo)能力最好，正丁胺和正戊胺次之。因此選取正己胺為誘導(dǎo)培養(yǎng)基的氮源。

2.2.2正己胺質(zhì)量濃度對(duì)胺氧化酶酶活力的影響

圖6　正己胺質(zhì)量濃度對(duì)胺氧化酶酶活力的影響Fig.6 Effect of different n-hexylamine concentrations on amine oxidase production

由圖6可知，隨著正己胺含量的逐漸升高，酶產(chǎn)量也逐漸升高，當(dāng)正己胺質(zhì)量濃度達(dá)到6 g/L時(shí)，酶活力達(dá)到最高。當(dāng)正己胺質(zhì)量濃度＞6 g/L后，酶活力逐漸開(kāi)始緩慢降低，說(shuō)明高濃度的誘導(dǎo)劑不利于酶的誘導(dǎo)。因此，后續(xù)試驗(yàn)中選用正己胺質(zhì)量濃度為6 g/L。

2.2.3誘導(dǎo)碳源對(duì)胺氧化酶酶活力的影響

圖7　誘導(dǎo)碳源對(duì)胺氧化酶酶活力的影響Fig.7 Effect of different induction carbon sources on amine oxidase production

由圖7可知，6種碳源都有較好的誘導(dǎo)產(chǎn)酶效果，也說(shuō)明菌絲以完成生長(zhǎng)階段，碳源對(duì)產(chǎn)酶影響不顯著，其中葡萄糖對(duì)黑曲霉產(chǎn)胺氧化酶的效果最好，因此選擇葡萄糖為最佳誘導(dǎo)碳源。

2.2.4誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)胺氧化酶酶活力的影響

圖8　誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)胺氧化酶酶產(chǎn)量的影響Fig.8 Effect of induction culture time on amine oxidase production

由圖8可知，誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間為12～36 h時(shí)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)酶活增加；36h時(shí)酶活達(dá)到最高；36～60 h時(shí)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活逐漸降低?？赡苁怯捎谝辉氛T導(dǎo)培養(yǎng)基并不適宜黑曲霉的生長(zhǎng)，在誘導(dǎo)前期，黑曲霉菌種還能繼續(xù)生長(zhǎng)，并為了適應(yīng)一元胺類培養(yǎng)基，逐漸的分泌胺氧化酶來(lái)維持其生長(zhǎng)，因此酶產(chǎn)量一直在增高。到了36 h后，黑曲霉由于無(wú)法完全利用一元胺生長(zhǎng)，導(dǎo)致黑曲霉生長(zhǎng)能力大幅度下降，甚至開(kāi)始出現(xiàn)自溶現(xiàn)象，胺氧化酶也漸漸失活，酶活降低。因此選擇誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間36 h為宜。

2.2.5誘導(dǎo)培養(yǎng)溫度對(duì)胺氧化酶酶活力的影響

圖9　誘導(dǎo)培養(yǎng)溫度對(duì)胺氧化酶酶活力的影響Fig.9 Effect of induction culture temperature on amine oxidase production

由圖9可知，隨著誘導(dǎo)培養(yǎng)溫度的升高，酶活呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，培養(yǎng)溫度為30℃時(shí)，酶產(chǎn)量最高?？赡苁且?yàn)榘费趸傅恼T導(dǎo)分泌跟黑曲霉的生長(zhǎng)情況有密切的關(guān)系，在30℃時(shí)，黑曲霉的生長(zhǎng)代謝最旺盛，分泌的胺氧化酶酶活力也最高。因此選擇誘導(dǎo)培養(yǎng)溫度30℃為宜。

2.2.6搖床轉(zhuǎn)速對(duì)胺氧化酶酶活力的影響

圖10　搖床轉(zhuǎn)速對(duì)胺氧化酶酶活力的影響Fig.10 Effect of shaking speed on amine oxidase production

由圖10可知，隨著搖床轉(zhuǎn)速的增加，酶活逐漸升高，搖床轉(zhuǎn)速＞160 r/min后，酶活趨于穩(wěn)定。說(shuō)明培養(yǎng)達(dá)到一定轉(zhuǎn)速后，滿足了黑曲霉生長(zhǎng)所需的氧氣量。因此選擇搖床轉(zhuǎn)速160 r/min為宜。

2.2.7誘導(dǎo)初始pH對(duì)胺氧化酶酶活力的影響

由圖11可知，初始pH對(duì)產(chǎn)酶量的影響較顯著，pH≥7.5或pH≤6.0的時(shí)候都不利于胺氧化酶的產(chǎn)生，在初始pH值為7.0的時(shí)候是最利于胺氧化酶的產(chǎn)生的，因此選擇初始pH值為7.0的培養(yǎng)基。通過(guò)誘導(dǎo)產(chǎn)酶條件的優(yōu)化，胺氧化酶酶活達(dá)到1 422.4 U/g。

圖11　誘導(dǎo)pH對(duì)胺氧化酶酶活力的影響Fig.11 Effect of induction pH on amine oxidase production

3　結(jié)論

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得出黑曲霉產(chǎn)胺氧化酶的最佳菌體生長(zhǎng)培養(yǎng)條件：氮源為NaNO3，碳源為麥芽糖，接種量1.0%，培養(yǎng)時(shí)間24 h；誘導(dǎo)產(chǎn)酶培養(yǎng)的最佳條件：誘導(dǎo)氮源為6g/L正己胺，誘導(dǎo)碳源為50 g/L葡萄糖，誘導(dǎo)時(shí)間36 h，溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速160 r/min，pH 7.0。胺氧化酶酶活力從誘導(dǎo)前的1 006.5 U/g提升至1 422.4 U/g，提高幅度為41.3%。

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ZHOU Xiaohu1，ZHU Xia1，WANG Lei1，JIAO Mengran1，HUANG Yao1，F(xiàn)U Caixia2，CAO Yueze3，GAO Bing1，WANG Chao1，LI Dongsheng1，XU Ning1*
（1.Hubei Cooperative Innovation Center for Industrial Fermentation，Research Center of Food Fermentation Engineering and Technology of Hubei，Hubei University of Technology，Wuhan 430068，China；2.Research Center of Fermentation flavouring Engineering and Technology of Hubei，Hubei Tulaohan Flavouring and Food Co.，Ltd.，Yichang 443000，China；3.Hubei Shunxi Biological Food Co.，Ltd.，Shiyan 442300，China）

Amine oxidase can be produce by inducedAspergillus niger，and has the characteristic of catalyzing biogenic amines to their corresponding aldehydes，H2O2and NH3.There are two stages duringA.nigeramine oxidase production，including cell growth and enzyme induction.Single factor experiments were adopted to optimize the liquid fermentation medium and induction conditions for amine oxidase production byA.niger.The optimum fermentation conditions were nitrogen source NaNO3，carbon source maltose，inoculum 1%，culture time 24 h.The optimum induction conditions were induction nitrogen source 60 g/L normal hexyl amine，carbon source glucose，culture time 36 h，temperature 30℃，rotate speed 160 r/min，and initial pH 7.0.The amine oxidase activity increased from 1 006.5 U/g to 1 422.4 U/g after induction，which increased 41.3%.

Aspergillus niger；amine oxidase；biogenic amine；optimizing condition

TS264.2

0254-5071（2016）06-0096-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.06.020

2016-03-21

國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（20130500009）；湖北省教育廳項(xiàng)目（Q20141409）

周小虎（1993-），男，本科生，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)與工程。

徐寧（1979-），男，講師，博士，研究方向?yàn)樯锕こ獭?/p>