紅提葡萄酒發(fā)酵酵母菌的分離及耐受性研究

賈春鳳，賈志軍，朱維紅，張筱梅*

（1.河北保定學院生化系，河北保定071000；2.河北大學工商學院，河北保定071000）

紅提葡萄酒發(fā)酵酵母菌的分離及耐受性研究

賈春鳳1，賈志軍2，朱維紅1，張筱梅1*

（1.河北保定學院生化系，河北保定071000；2.河北大學工商學院，河北保定071000）

該實驗從紅提葡萄發(fā)酵過程中分離出酵母菌株，并對其耐受性進行研究，旨在提高紅提葡萄酒釀造品質(zhì)。通過培養(yǎng)不同發(fā)酵時期菌株，并用肉眼和顯微鏡分別觀察其菌落和細胞形態(tài)，再測定其發(fā)酵能力、耐糖性、耐酸性、耐酒精度。結(jié)果表明，共分離出酵母菌140株，經(jīng)菌落形狀和細胞形態(tài)鑒定后，獲得典型的三類共6株酵母菌；在發(fā)酵過程中，加入分離菌株比自然發(fā)酵可多發(fā)酵1.6%葡萄糖，多產(chǎn)生0.78%CO2和0.82%vol的酒精，且發(fā)酵趨勢和安琪酵母、自然發(fā)酵過程一致；以安琪酵母為對照，對6株菌進行耐糖性、耐酸性、耐酒精度試驗，得出綜合耐受性較好的酵母菌株為A3、B7和C1。

紅提葡萄；酵母菌；分離；耐受性

紅提葡萄系歐亞種，自1986年引入我國以來，紅提葡萄的生產(chǎn)得到了迅猛發(fā)展，產(chǎn)量逐年提高［1］。紅提個大、色艷、味甜［2］，且營養(yǎng)十分豐富，含有17%以上的葡萄糖和果糖，0.5%～1.5%的蘋果酸、酒石酸、檸檬酸等，0.15%～0.90%的蛋白質(zhì)和豐富的鉀、鈣、鈉、錳等人體必需的微量元素，含有多種維生素、果酸、氨基酸和礦物質(zhì)，比較適合釀酒［3］。隨著人們生活水平的提高，利用紅提、巨峰、馬奶等常見葡萄品種自釀葡萄酒倍受人們歡迎［4］。酵母菌在葡萄酒釀造過程中起著重要作用，不同品種葡萄自身所帶酵母菌發(fā)酵菌株不同，不同發(fā)酵菌株發(fā)酵產(chǎn)物不同［5-8］，優(yōu)良的葡萄釀酒酵母能使發(fā)酵過程易于控制，使葡萄漿果的優(yōu)良品質(zhì)在葡萄酒中得以最大限度的表達，使葡萄酒香氣協(xié)調(diào)、細膩、優(yōu)雅，風格特征突出。研究發(fā)現(xiàn)，國內(nèi)釀酒酵母品種較少，因此，釀酒愛好者家庭自釀葡萄酒過程中污染現(xiàn)象嚴重，且專門用于紅提葡萄酒發(fā)酵的菌種更是鮮有報道［9-11］。

本研究以紅提葡萄為原料，分離發(fā)酵過程中不同時期的酵母菌，力求能夠分離出高性能酵母菌株，既可豐富國內(nèi)釀酒酵母種類，也可為將來自釀紅提葡萄酒提供特定菌種，避免自釀過程中的污染，提高家庭自釀葡萄酒的品質(zhì)。因此，本研究主要以安琪酵母為對照菌株，從紅提葡萄酒自然發(fā)過程中分離不同發(fā)酵時期的酵母菌；對分離酵母菌進行菌落形態(tài)和細胞形態(tài)觀察，對分離菌株進行分類；對選定菌株的發(fā)酵能力進行測定采用可見分光光度計法對已選定菌株的耐糖性、耐酸性、耐酒精度進行研究。力爭得到能夠促進紅提葡萄酒發(fā)酵，且適應能力較強的酵母菌株，為自釀較高質(zhì)量紅提葡萄酒打下基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1原材料

紅提葡萄：購于河北省保定市市場；安琪葡萄酒釀造專用酵母：安琪酵母股份有限公司。

1.1.2化學試劑

瓊脂粉（生化試劑）：天津市大茂化學試劑廠；葡萄糖、酵母浸粉（生化試劑）、蛋白胨（生化試劑）、氯霉素、HCl、NaOH、無水乙醇（均為分析純）：天津市北方天醫(yī)化學試劑廠。

1.1.3培養(yǎng)基［12］

酵母菌分離及保存采用酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（yeast extract peptone dextrose，YEPD）：酵母浸粉1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，瓊脂2%；溶于1 L蒸餾水中（可另加100 mg/L的氯霉素抑制細菌繁殖），115℃滅菌30 min。

耐高糖試驗培養(yǎng)基：酵母膏10 g，蛋白胨20 g，不同含量葡萄糖（100 g、200 g、300 g、400 g、500 g），20 g瓊脂，溶于1 L蒸餾水中，115℃滅菌30 min。

耐高酸試驗培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，酵母膏10 g，不同pH值（1、2、3、4、5、6）溶于1 L蒸餾水中，115℃滅菌30 min。

耐酒精試驗培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，酵母膏10 g，蛋白胨20 g，不同含量乙醇（0、6%、9%、12%、15%、18%）溶于1 L蒸餾水中，115℃滅菌30 min。

1.2儀器與設(shè)備

YY0027-90電勢恒溫培養(yǎng)箱：湖北省黃石市恒馮醫(yī)療器械有限公司；SW-CJ-2F超凈工作臺：蘇凈集團安泰公司；YXQGO2手提式電熱壓力消毒器：山東安得醫(yī)療科技有限公司；BX51 OLYMPUS熒光顯微鏡：奧林巴斯光學工業(yè)株式會社（日本）；JA2002電子天平：上海精天電子儀器儀器有限公司；0-50%手持糖度儀：上海天壘儀器儀表有限公司；HC.TP12A.2架盤藥物天平：北京醫(yī)用天平廠；722N可見分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；DHS-3C酸度計：上海越平科學儀器有限公司。

1.3實驗方法

1.3.1葡萄酒加工工藝流程［13-14］

紅提葡萄→去梗、清洗→浸泡、瀝干→稱質(zhì)量、添加葡萄糖→捏碎、搖勻→加塞、密封→發(fā)酵→換瓶除去沉淀物→澄清→過濾→裝瓶→貯藏

操作說明：將葡萄去梗后，清洗3遍，在水中浸泡30min，瀝干；按照葡萄∶葡萄糖=8∶1的質(zhì)量比添加葡萄糖；將葡萄捏碎至250 mL錐形瓶中，搖晃均勻；加塞，并用保鮮膜包扎密封。將錐形瓶放入已調(diào)整溫度至28℃的恒溫培養(yǎng)箱中進行發(fā)酵釀造，前3 d，每隔24 h，在超凈臺中打開密封，搖勻30 s；每天定時測定發(fā)酵液中的酵母菌種類和數(shù)量、發(fā)酵液中糖含量和酒精度，發(fā)酵液酒精度和糖含量基本不變后，停止發(fā)酵；發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵上清液倒入新瓶中，放入冰箱中冷藏24 h澄清；用6層醫(yī)用紗布過濾，分裝到洗凈的棕色玻璃瓶中，貯藏到0～4℃冰箱中備用。

1.3.2葡萄酵母菌種的分離

每天分別取出樣品0.5 mL，用生理鹽水稀釋樣品、振蕩。第一天稀釋10-1、10-2、10-3，以后根據(jù)前天培養(yǎng)的平板中菌落個數(shù)合理調(diào)整稀釋倍數(shù)，在選取的三個稀釋度中分別取0.1 mL放入培養(yǎng)皿中，倒入酵母菌分離培養(yǎng)基，混菌培養(yǎng)，每個樣品3個平行，分別進行標記，放入設(shè)定溫度為28℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h。隨后，每天分別肉眼觀察酵母菌菌落形態(tài)，挑取代表性菌落、劃線分離，初步顯微鏡鑒定、記錄不同種類酵母菌出現(xiàn)時的發(fā)酵時間，并試管斜面劃線保存不同種類酵母菌，做好標記，備用。

1.3.3菌種的活化

將少量安琪葡萄酒釀造專用酵母顆粒溶于YEPD液體培養(yǎng)基的試管中，加塞，包扎。放置于設(shè)定溫度為28℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，挑取培養(yǎng)液制斜面試管中劃線、培養(yǎng)、保存?zhèn)溆?。將待測分離菌株和斜面安琪酵母接種于YEPD斜面培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)1～2 d，備用。

1.3.4菌懸液的制備

挑取1.3.3已活化菌株1環(huán)菌苔接入2 mL無菌水中，混勻成菌懸液，用可見分光光度計法，調(diào)整菌含量，使其相等，且OD600nm值在0.8左右，待用。

1.3.5分離酵母菌發(fā)酵力試驗

稱量葡萄160 g和葡萄糖20 g各9份，分別放到9個錐形瓶中。將分離、初步篩選出的6株酵母菌根據(jù)其在發(fā)酵過程中的出現(xiàn)時間，于相對應發(fā)酵時間時，加入以上活化菌種溶液1 mL，標號為1，共三個平行。同時在標號為2的三個樣品中分別加入與1號樣品相同濃度的活化的安琪酵母溶液1 mL作為對照。在3號三個樣品中只需加入總量相同的培養(yǎng)液作為對照。將9個錐形瓶放入28℃的恒溫培養(yǎng)箱中進行發(fā)酵。每天用手持測糖度儀測定發(fā)酵液中的糖含量，利用CO2失重法測定分離菌種的發(fā)酵速度，根據(jù)GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》［15］中的密度瓶法測定酒精含量。至糖含量、CO2質(zhì)量、酒精度基本不變?yōu)橹埂?/p>

1.3.6分離酵母菌濃度與其吸光度值關(guān)系

將活化后的安琪葡萄酒釀造專用酵母制成原菌液，將原菌液分別稀釋，使其含量分別為20%、40%、60%、80%、100%，分別用可見分光光度計在波長600 nm處測定其OD600nm值。同時，將各個菌液稀釋倒平板后菌落計數(shù)，測其菌含量。以菌液OD600nm值（x）為橫坐標，以菌濃度（y）為縱坐標作圖，考察二者關(guān)系。

1.3.7分離菌種耐受性試驗

根據(jù)薛波等［16］提到的方法，參考劉向勇等［17-19］試驗方法進行分離菌種耐糖性、耐酸性和耐酒精度測定。具體方法如下：將1.3.4中已制備好的菌懸液，按3%的接種量，分別接種到按1.1.3中方法，已配制好的不同糖含量的耐糖性試驗培養(yǎng)基、不同pH值得耐酸試驗培養(yǎng)基、不同酒精含量的耐酒精度試驗培養(yǎng)基中，在28℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用可見分光光度計法測定每個樣品中的菌含量。

1.3.8分析檢測

糖含量：采用手持糖度儀測定；菌體濃度：采用可見分光光度計法；pH值：采用酸度計測定；發(fā)酵速率：采用CO2失重法；酒精度：采用密度瓶法。

1.3.9數(shù)據(jù)處理

每組試驗重復3次，用Excel處理數(shù)據(jù)，最后采用平均值表示。用Sigmaplot 10.0和Excel作圖。

2　結(jié)果與分析

2.1酵母菌的初步分離

在紅提葡萄酒自然發(fā)酵過程中，每天進行酵母菌分離，并經(jīng)菌落形態(tài)和細胞形態(tài)的初步鑒定，到第8天～第10天時，分離得到菌株菌落形態(tài)和細胞形態(tài)與1～7 d中分離得到得基本相似，且7 d后，發(fā)酵液中的菌含量已經(jīng)＜1× 103CFU/mL。因此在進行重復分離菌株、根據(jù)菌落形態(tài)和細胞形態(tài)分類時，只分析了1～7 d分離得到菌株，共140株菌。取前7 d分離所得酵母菌140株，進行菌落形態(tài)和細胞形態(tài)分析，發(fā)現(xiàn)7 d中，典型酵母菌株共3種形態(tài)。根據(jù)分離時間和形態(tài)的典型性，最后保存6株最具代表性菌株，如表1所示。

表1　自然發(fā)酵葡萄酒中分離出的代表菌株Table 1 Representative strains isolated from natural fermented wine

由表1可知，第一類菌種代表字母為A，保存代表菌株分別為第1天分離所得A1、第3天分離所得A3。第二類菌種代表字母為B，從第5天才開始出現(xiàn)，保存菌種分別為第5天分離所得B5、第7天分離所得B7。第三類菌種代表字母為C，保存菌種分別為第1天分離所得C1、第6天分離所得C6。

2.2分離酵母菌發(fā)酵力測定

分離出的菌株是否具能夠促進紅提葡萄酒的發(fā)酵，是考察菌株有沒有價值的重要指標。根據(jù)方法1.3.5，取分離得到的6株菌菌懸液1 mL，按照各自分離對應時間（第1天、第3天、第5天、第6天、第7天）加入樣品發(fā)酵液中；同一時間，在對照發(fā)酵液中加入相同量的安琪酵母，并和自然發(fā)酵過程做對比，測定6株分離菌的綜合發(fā)酵糖能力。

2.2.1分離酵母菌發(fā)酵葡萄糖能力測定

由圖1可知，在葡萄發(fā)酵的第1天，葡萄液的糖含量驟降2%～4%。第2天～第3天糖濃度下降較緩慢，第3～第8天糖濃度下降較快，可見三組葡萄發(fā)酵過程中糖度的變化大體是一致的。第9天～第10天加入分離酵母菌的樣品和自然發(fā)酵對照樣品糖濃度下降趨于平穩(wěn)。到第10天時，加入分離酵母菌的樣品中，共發(fā)酵葡萄糖18.1%；同期，自然發(fā)酵中，共發(fā)酵葡萄糖16.5%，可見分離酵母菌的加入比自然發(fā)酵可多發(fā)酵1.6%的糖，更有利于紅提葡萄酒的釀造。

圖1　發(fā)酵液中葡萄糖含量變化Fig.1 Changes of glucose concentration in the fermentation broth

2.2.2分離酵母菌發(fā)酵速率測定

由圖2可知，三個樣品發(fā)酵產(chǎn)生CO2的趨勢相同。但比較分析發(fā)現(xiàn)，第1天～第8天，和安琪酵母、自然發(fā)酵比較，分離酵母菌發(fā)酵速度較快，到第9～第10天，自然發(fā)酵和分離酵母菌發(fā)酵產(chǎn)生的CO2已基本穩(wěn)定，分離酵母菌可比自然發(fā)酵多產(chǎn)生0.78%CO2，但稍低于安琪酵母發(fā)酵。總體可以看出，分離菌株發(fā)酵速度較快。

圖2　不同酵母菌發(fā)酵速率的比較Fig.2 Comparison of fermentation rate of different yeasts

2.2.3分離酵母菌發(fā)酵生產(chǎn)酒精能力測定

考察發(fā)酵1～10 d中三個樣品中酒精含量的變化。由圖3可知，三個樣品發(fā)酵產(chǎn)生酒精的趨勢相同，且與其發(fā)酵產(chǎn)生CO2結(jié)果相對應。在整個發(fā)酵過程中，分離酵母菌發(fā)酵產(chǎn)生酒精量都明顯高于自然發(fā)酵，到第10天時，比其酒精含量高出0.82%vol，只稍低于安琪葡萄酒釀造專用酵母發(fā)酵產(chǎn)生的酒精度。因此，分離酵母菌發(fā)酵可產(chǎn)生較多酒精。

圖3　不同樣品中的酒精含量變化Fig.3 Changes of alcohol content in different samples

2.3分離酵母菌耐受性測定

2.3.1分離酵母菌濃度與其吸光度值關(guān)系

根據(jù)方法1.3.6，測得安琪葡萄酒釀造專用酵母原菌液含量分別為20%、40%、60%、80%、100%時，對應的菌濃度分別為0.332×107CFU/mL、0.734×107CFU/mL、0.982×107CFU/mL、1.328×107CFU/mL、1.660×107CFU/mL，對應的OD600nm值分別為0.307、0.724、0.833、1.181、1.435。以菌液OD600nm值（x）為橫坐標，以菌濃度（y）為縱坐標作圖，結(jié)果見圖4。由圖4可知，菌液OD600nm值與菌濃度二者關(guān)系曲線回歸方程為y=1.182 6x-0.052 4，相關(guān)系數(shù)R2=0.992 2。結(jié)果表明菌液OD600nm值與菌濃度二者線性關(guān)系良好，樣品中菌濃度可以按照此回歸方程進行計算。

圖4　酵母菌濃度與吸光度值關(guān)系曲線Fig.4 Relationship curve of yeast concentration and absorbance value

2.3.2分離酵母菌的耐糖性

雖然糖是酵母菌發(fā)酵產(chǎn)生酒精的基質(zhì)，也是酵母菌賴以生存的碳源，但高濃度的糖也會抑制酵母菌株的生長，抑制其活性［20］，不同酵母菌株對糖的耐受性不同。分別測定不同菌株在不同糖含量液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h時的生長情況，結(jié)果見表2。

表2　不同葡萄糖含量下紅提葡萄酵母菌的生長情況Table 2 Growth situation of yeast isolated from red grapes under different glucose content×107CFU/mL

由表2可知，所有分離酵母的生長量都隨糖含量的增加而下降，即酵母菌的生長活性都隨著糖含量的增加而降低。這是由于大部分酵母菌生長最適培養(yǎng)基YEPD中，糖含量才為2%，當糖含量為100 g/L時，已經(jīng)遠遠大于最適培養(yǎng)基，因此隨著碳含量的增加，菌含量會逐漸減少。但各菌株對糖的耐受性卻有差別，與安琪酵母相比，分離酵母菌株耐糖性都好，在糖添加量為300 g/L的培養(yǎng)基中，都可以生長，A3和C1的耐糖性甚至稍高于安琪酵母；隨著糖含量的增加，A1、B5和C6菌含量下降較快，因此這三種菌株的耐糖性稍差。結(jié)果表明，耐糖性較好菌株為A3、C1和B7。

2.3.3分離酵母菌的耐酒精度

當酒精含量達到一定濃度時，隨濃度的增加，酵母的活性將被抑制，甚至當酒精含量足夠高時，酵母的發(fā)酵會停止。酵母的發(fā)酵能力在很大程度上取決于它們自身酒精耐受力的大?。?9］，將酵母菌菌懸液接種到不同酒精度的液體培養(yǎng)中，培養(yǎng)24 h時，其菌含量結(jié)果見表3。

表3　不同酒精含量下的紅提葡萄酵母菌的生長情況Table 3 Growth number of yeast isolated from red grapes under different alcohol content×107CFU/mL

從劉向勇等［17］研究中可以看出，安琪酵母菌對酒精有較好的耐受性。以安琪酵母為參考，由表3可知，酵母菌C1耐酒精度最低，在酒精度為12%vol時，菌含量下降最快；菌株A1和C6耐酒精度較低，在酒精度為15%vol時，菌含量較低；菌株A3、B5和B7耐酒精度最高，在酒精度為15%vol時生長較好。因此，菌株A3、B5和B7進一步研究的價值較大。

2.3.4分離酵母菌的耐酸性

在酸性條件下，可抑制很多有害微生物的生長，耐酸性較好的酵母菌株應用范圍必定較廣，但如果pH值過于低，將會抑制所有微生物的生長［16］，因此，在野生酵母菌菌株的選育中，所選菌株的耐酸性是其留取的主要指標。對分離所得6株酵母菌的耐酸性進行測定，結(jié)果見表4。

表4　不同pH值下紅提葡萄酵母菌的生長情況Table 4 Growth number of yeast from red grapes under different pH value×107CFU/mL

由表4可知，在pH值為4～6時，所有菌株生長都比較好，除了安琪酵母，所測菌株的最適pH值都在6附近。通過和安琪酵母比較，發(fā)現(xiàn)各菌株耐酸性卻不同：在pH值為1時，C1生長最好，其次依次為A3、C6、B7，A1和B5兩菌株生長量很少；A1和B5兩菌株適合生長pH值范圍較窄，當pH值低于4，生長非常弱；B7較A1和B5耐酸性稍強，但比較適合生長的pH值也集中在4～6。因此，在pH值為1～6，耐酸性較好的菌株為C1、A3、C6，菌株B7次之，菌株A1和B5耐酸性最差。

3　結(jié)論

總結(jié)以上結(jié)果可以得出以下結(jié)論：對紅提葡萄自然發(fā)酵過程中的酵母菌進行分離，共得到140株菌，經(jīng)菌落形態(tài)和細胞形態(tài)初步分析后，獲得三類典型酵母菌，共6株。當6株菌混合發(fā)酵時，以紅提葡萄酒自然發(fā)酵為對照，和安琪酵母作比較，分離酵母菌發(fā)酵糖產(chǎn)生CO2和酒精的利用趨勢相同，且比自然發(fā)酵可多發(fā)酵1.6%葡萄糖，多產(chǎn)生0.78%CO2和0.82%vol的酒精，分離酵母菌的發(fā)酵能力較強。以安琪酵母為對照，對6株菌進行耐受性試驗，發(fā)現(xiàn)菌株A3、B7和C1耐糖性比較好；菌株A3、B5、B7能耐較高酒精度；菌株A3、C1和C6耐酸性較好。綜合評價可以得出：耐性最好的菌株為A3；其次為B7；由于菌株C1的耐酸性和耐糖性是最好的，耐酒精度為12%vol，也可和菌株A3、B7一起作為下一步重點研究的對象。

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JIA Chunfeng1，JIA Zhijun2，ZHU Weihong1，ZHANG Xiaomei1*
（1.Department of Biochemistry，Baoding University，Baoding 071000，China；2.Industrial and Commercial College，Hebei University，Baoding 071000，China）

Yeast strains were isolated from red grapes fermentation process，and its tolerance properties were researched in order to improve the brewing quality of red grape wine.Through cultivating strains in different fermentation period，colony and cell morphology of strains were observed by naked eye and microscope，respectively.The fermentation ability and the tolerance properties against sugar，acid and alcohol of stains were determined.The results showed that 140 strains of yeasts were isolated.By colony shape and cell morphology identification，three typical type's yeasts（total six strains）were obtained.During the fermentation process，the glucose，CO2and alcohol content in red grapes wine fermented by the separated strains were 1.6%，0.78%and 0.82%vol more than that of the natural fermentation，and the fermentation trend was consistent with angel yeast and natural fermentation process.With angel yeast as contrast，the tests results of six strains tolerance properties against sugar，acid and alcohol showed that strain A3，B7 and C1 had good comprehensive tolerance properties.

red grapes；yeast；isolation；tolerance properties

TS261.1

0254-5071（2016）06-0076-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.06.016

2016-02-15

保定市科學技術(shù)研究與發(fā)展指導計劃項目（14ZN017）；院級自然課題（2012Z09）

賈春鳳（1979-），女，副教授，碩士，研究方向為食品微生物及發(fā)酵工程。

張筱梅（1957-），女，教授，本科，研究方向為食品發(fā)酵技術(shù)。