星點效應(yīng)面法優(yōu)化龍膽苦苷脂質(zhì)體的制備工藝研究

宋艷麗

摘 要：目的：優(yōu)化龍膽苦苷脂質(zhì)體的處方。方法：以包封率為考察指標(biāo)，采用逆向蒸發(fā)法，在單因素的實驗基礎(chǔ)之上采用星點效應(yīng)面法對龍膽苦苷制備工藝進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果 確定龍膽苦苷脂質(zhì)體處方為大豆卵磷脂與膽固醇用量比2.2：1，大豆卵磷脂與龍膽苦苷用量比19：1，磷酸緩沖液pH值為5.8。結(jié)論 在最優(yōu)處方工藝條件下制備的龍膽苦苷脂質(zhì)體包封率為63.78%，脂質(zhì)體外觀成規(guī)則的圓球形，平均粒徑為178 nm，且粒徑分布均勻。

關(guān)鍵詞：龍膽苦苷；脂質(zhì)體；包封率；星點效應(yīng)面

中圖分類號：R286.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1006-8937（2016）24-0179-02

龍膽苦苷是從龍膽、秦艽等龍膽科植物中提取的環(huán)烯醚萜苷類化合物，藥理實驗表明龍膽苦苷具有明顯的保肝利膽[1]。一個比較罕見的天然具有鎮(zhèn)痛抗炎作用的化合物。但龍膽苦苷在生物體內(nèi)吸收快、消除快，在大鼠體內(nèi)代謝的消除半衰期只有0.64 h[2]。脂質(zhì)體具有類細(xì)胞結(jié)構(gòu)，能夠改變被包封藥物的體內(nèi)分布，使藥物主要在肝、脾、肺和骨髓等組織器官中蓄積，從而提高藥物的治療指數(shù)、減少藥物的治療劑量和降低藥物的毒性[3]，本文擬制備龍膽苦苷脂質(zhì)體，目的在于提高藥物療效和生物利用度。

1 儀器和試藥

1.1 儀 器

LC-20AT型高效液相色譜儀（含LC-20AT型泵、SPD-20A型紫外可見雙波長檢測器，日本島津公司）；JEM-2000EX透射電子顯微鏡（日本電子公司）；HSE-D型循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限公司）；

RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；FY-200高壓勻質(zhì)機(jī)（上海儀器廠）；TGL-168GB離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試 藥

龍膽苦苷對照品（純度≧99.9%，批號；100174-2014）；大豆卵磷脂、膽固醇、三氯甲烷（天津博迪化工有限公司）；色譜甲醇（Sigma公司，色譜醇）；其他輔助試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 龍膽苦苷制備方法

精密稱取膽固醇100 mg ，磷脂200 mg，置于250 mL圓底燒瓶中，并加入三氯甲烷25 mL并溶解，再加入含龍膽苦苷

1 mg/mL的pH7.0磷酸鹽緩沖液10 mL，超聲處理15 min，40 ℃水浴減壓蒸發(fā)，除去有機(jī)溶劑，即可得龍膽苦苷脂質(zhì)體。

2.2 龍膽苦苷分析方法的建立

2.2.1 色譜條件

LC-20AT C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，粒徑：5 μm）；柱溫為25 ℃；流動相：甲醇-水（30/70，V/V）；體積流量為1.0 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL；檢測波長為270 nm。

2.2.2 對照品溶液

精密稱取10.05 mg龍膽苦苷對照品，置于10 mL容量瓶內(nèi)用甲醇溶液并定容，配制成質(zhì)量濃度每1 mL含1.005 μg的對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液

吸取脂質(zhì)體溶液1 mL于100 mL容量瓶中，加適量甲醇后，超聲15 min。用甲醇定容，既得供試品溶液。

2.2.4 空白對照品溶液

吸取空白脂質(zhì)體混濁液1 mL于100 mL容量瓶內(nèi)，加適量甲醇后，超聲15 min。用甲醇定容。

2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別精密吸取儲備液制得質(zhì)量濃度為5.025，10.05，20.10，

30.15，40.20μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取上述溶液10μg進(jìn)樣，回歸結(jié)果顯示，龍膽苦苷面積（A）與其質(zhì)量濃度（C）在5.025至40.20μg/mL的范圍線性良好，回歸方程為：

A=9.137C+3.853，R=0.9992。

2.2.6 包封率的測定

精密量取1.0 mL龍膽苦苷脂質(zhì)體樣品液，在10 000 r·min-1轉(zhuǎn)速的高速離心機(jī)中離心30 min之后，取其上清液用0.22 μm濾膜過濾， 按“2.2.1”項下色譜條件，進(jìn)樣測定藥物游離濃度（C游）。再另外精密量取1.0mL龍膽苦苷脂質(zhì)體樣品液，加甲醇破乳后用0.22 μm濾膜過濾取其樣品液澄清，按“2.2.1”項下色譜條件測定，即得藥物的總濃度（C總）。

按照下式求算包封率：EE%=（ 1-C游/ C總）×100%平行測定3次，求得平均值。

2.3 星點效應(yīng)面設(shè)計

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)資料及預(yù)實驗結(jié)果確定影響包封率三種主要因素，既大豆卵磷脂與膽固醇用量比（A）、大豆卵磷脂與龍膽苦苷用量比（B）、磷酸緩沖液pH（C）。三個主要因素進(jìn)行星點設(shè)計，大豆卵磷脂與膽固醇用量比（A）分別為1：1、2：1、3：1；大豆卵磷脂與龍膽苦苷用量比（B）分別為25：1、20：1、10：1；磷酸緩沖液pH（C）分別為5.8、7.0、7.8。星點設(shè)計及結(jié)果，見表1。

采用Design-Expert8.05軟件繪制影響因素與和指標(biāo)之間的三位效應(yīng)面結(jié)果，如圖1所示。

以大豆卵磷脂與膽固醇用量比（A）、大豆卵磷脂與龍膽苦苷用量比（B）、磷酸緩沖液pH（C）為自變量，包封率（Y）為因變量進(jìn)行回歸分析。由方差分析可以得出自變量一次項A、B，C、二次項A2、B2顯著（P<0.05）。

選用二次模型，得到多元二次回歸模型為Y=65.37+2.14X1+2.56X2-3.26X3+1.75X1X2-1.68 X1X3+0.68 X2X3-13..85X12-3.45X22+0.99X32（R2=0.9562）；由圖2和Design-Expert 8.05b軟件數(shù)據(jù)分析得知大豆卵磷脂與膽固醇用量比2.2：1、大豆卵磷脂與龍膽苦苷用量比（B）19：1、磷酸緩沖液pH（C）5.8。

2.4 驗證試驗

確定處方和工藝的條件下制備了3批龍膽苦苷脂質(zhì)體（批號分別是150401，150402，150403）進(jìn)行試驗驗證研究，最優(yōu)處方下的實際包封率為（63.8±2.48）%、（64.5± 1.37）%、（63.1±1.95）%

2.5 理化性質(zhì)考查

2.5.1 電 鏡

在電鏡下脂質(zhì)體，脂質(zhì)體呈規(guī)整球形，大多數(shù)為單囊結(jié)構(gòu)，形態(tài)良好。

2.5.2 粒徑大小及分布

將制的脂質(zhì)體置于透射電鏡下，觀察粒子形狀及測定粒子大小。結(jié)果脂質(zhì)體粒徑主要分布在于112～450 nm，平均粒徑

178 nm。

3 討 論

龍膽苦苷為水溶性藥物，為了提高親水性其脂溶性，本文采用將龍膽苦苷制備成脂質(zhì)體的方法，進(jìn)而提高其生物利用度。脂質(zhì)體的包封率通常是考察脂質(zhì)體的重要指標(biāo)，因此本實驗以包封率為考察指標(biāo)選擇大豆卵磷脂與膽固醇用量比、大豆卵磷脂與龍膽苦苷用量比、磷酸緩沖液pH為考察因素。

采用星點效應(yīng)面法得到的最優(yōu)處方為：大豆卵磷脂與膽固醇用量比2.2：1；大豆卵磷脂與龍膽苦苷用量比19：1；磷酸緩沖液pH值為5.8，超聲10 min，溫度40 ℃。

參考文獻(xiàn)：

[1] 江蔚新，薛寶玉.龍膽對小鼠急性肝損傷保護(hù)作用的研究[J].中國中藥 雜志2005，30（14）： 1105- 1107.

[2] 姜少灝，康麗娟，蔣曄，等.龍膽及其復(fù)方中龍膽苦苷在大鼠體內(nèi)的藥動 學(xué)研究[J].中國藥學(xué)雜志，2005，40（3）：212-215.

[3] 陸彬.藥物新劑型與新技術(shù)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1998：14.