• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    攜帶人卵泡刺激素受體的慢病毒載體疫苗的構建及其免疫效應檢測

    2016-10-13 13:20:48馬曉玲劉紅春李江偉
    生物技術通報 2016年3期
    關鍵詞:小鼠

    馬曉玲 劉紅春 李江偉

    (新疆大學生命科學與技術學院 新疆生物資源基因工程重點實驗室,烏魯木齊 830046)

    攜帶人卵泡刺激素受體的慢病毒載體疫苗的構建及其免疫效應檢測

    馬曉玲 劉紅春 李江偉

    (新疆大學生命科學與技術學院 新疆生物資源基因工程重點實驗室,烏魯木齊 830046)

    制備攜帶卵泡刺激素受體的慢病毒載體疫苗,并研究其對小鼠的免疫效應。將卵泡刺激素受體胞外區(qū)(fshr366)基因克隆到慢病毒載體上,采用脂質體轉染法將重組質粒轉染至293T細胞中,包裝并產(chǎn)生含有目的基因的病毒顆粒;分別利用RT-PCR和Western blot檢測感染病毒顆粒的293T細胞中fshr366 在mRNA水平及蛋白水平的表達情況;用攜帶fshr366的病毒顆粒單次腹腔免疫BALB/c小鼠,分別在免疫0、14、21和28 d對小鼠眼眶采血,ELISA法檢測免疫小鼠血清的特異性并測定抗體滴度。酶切和測序結果表明fshr366基因片段成功構建到慢病毒載體上。將包裝產(chǎn)生的攜帶fshr366的慢病毒顆粒感染293T細胞后,RT-PCR和Western blot檢測結果表明細胞在轉錄水平和蛋白水平均表達fshr基因。ELISA結果顯示攜帶fshr366的慢病毒顆粒單次腹腔免疫小鼠后,免疫14 d就激起了機體的體液免疫反應,抗體滴度達到1∶1 600。成功制備了攜帶卵泡刺激素受體的慢病毒載體疫苗,其可以在小鼠體內(nèi)激發(fā)FSHR抗原特異的早期持續(xù)性免疫反應。

    卵泡刺激素受體;慢病毒載體;疫苗;體液免疫反應

    卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone,F(xiàn)SH)在人類生殖過程中發(fā)揮著重要作用,是促進和維持正常的性腺發(fā)育和生殖功能的重要激素[1],其生理功能是通過與卵巢顆粒細胞膜表面的特異性受體即卵泡刺激素受體(follicle-stimulating hormone receptor,F(xiàn)SHR)的結合來發(fā)揮的[2]。FSHR是一種跨膜糖蛋白,屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族中的糖蛋白亞家族成員。人的FSHR由695個氨基酸組成,其中氨基端17個氨基酸為疏水性信號肽,緊接著是FSHR的胞外區(qū)由349個氨基酸構成,其后是264個氨基酸構成的跨膜區(qū),胞內(nèi)區(qū)是65個氨基酸組成的羧基末端[3]。以往對FSHR與腫瘤關系的研究主要集中于卵巢癌,但是最新研究發(fā)現(xiàn)FSHR 除了在卵巢癌中表達,在其他多種實體瘤血管內(nèi)皮細胞中也都有表達,但是在鄰近的正常組織中不表達[7],推測FSH 與其受體FSHR可能通過不同信號途徑參與促進腫瘤血管形成作用[8]。初步研究表明FSHR有可能作為潛在的腫瘤治療靶點和腫瘤診斷以及愈后分子標志物[9,10]。因此,制備基于FSHR靶點的抗體對腫瘤的診斷以及治療都有重要的意義。

    本研究中采用的慢病毒表達載體是以人類免疫缺陷I型病毒(HIV-1)為基礎發(fā)展起來的基因治療載體[11]。它具有可以感染非分裂期細胞、容納外源性大基因片段、基因導入效率及表達水平高等優(yōu)點[12],慢病毒載體介導的轉基因的表達能持續(xù)數(shù)月[13],從而達到良好的基因治療效果。

    本實驗構建了攜帶人卵泡刺激素受體胞外區(qū)的慢病毒載體疫苗,將包裝出的攜帶卵泡刺激素受體胞外區(qū)的慢病毒顆粒單次免疫小鼠研究其體液免疫效應,旨在為進一步研究靶向人卵泡刺激素受體的慢病毒載體疫苗的抗腫瘤機制和效果奠定基礎。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 實驗材料 pCMV-SPORT6-FSHR質粒購自長沙贏潤生物技術有限公司;質粒Lenti-EGFP、pCMV-dR8.91、pCMV-VSVG購自上海斯丹賽生物技術有限公司;大腸桿菌菌株DH5α和293T細胞為新疆生物資源基因工程重點實驗室提供;6-8周BALB/c小鼠,購買于新疆醫(yī)科大學。

    1.1.2 工具酶和主要試劑 Pfx聚合酶為Invitrogen公司產(chǎn)品;T4連接酶、各種限制性內(nèi)切酶和逆轉錄酶為Fermentas公司產(chǎn)品;質粒小提試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、DNA膠回收試劑盒購自上海生工生物工程有限公司;兔抗FSHR多克隆抗體為上海江萊生物科技有限公司產(chǎn)品;抗β-actin鼠單克隆抗體、羊抗兔HRP-IgG單克隆抗體、羊抗鼠HRP-IgG單克隆抗體為北京康為世紀生物科技有限公司產(chǎn)品;Opti-MEM培養(yǎng)基、DMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清購自GIBCO公司。脂質體轉染試劑為Promega公司產(chǎn)品;polybrene為Sigma公司產(chǎn)品;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

    1.2 方法

    1.2.1 FSHR胞外區(qū)的擴增 以pCMV-SPORT6-FSHR質粒作為PCR擴增FSHR胞外區(qū)基因序列的模板,根據(jù)FSHR胞外區(qū)基因序列設計引物:P1:5'-GGCCTGATCAGCCACCATGGCCCTGCTCCTGGTCTC-3' 包含BclⅠ酶切位點,P2:5'-CCGGGCTAGCTCTGAGGATGTTGTACCCCATG-3'包含酶切位點NheⅠ,此引物擴增的序列為FSHR胞外區(qū)加信號肽的基因序列(即FSHR第1-366位氨基酸,共1 098 bp,將擴增出的片段簡稱為fshr366)。

    1.2.2 基因克隆、構建及測序 用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ(BclⅠ的同尾酶)和NheⅠ雙酶切慢載體Lenti-EGFP,切膠回收載體。用BclⅠ和NheⅠ雙酶切fshr366基因片段?;厥占兓襟E參考上海生工DNA膠回收試劑盒和PCR產(chǎn)物純化試劑盒說明書。連接產(chǎn)物轉化DH5α感受態(tài)細胞,挑取單克隆,對PCR以及雙酶切鑒定為陽性的重組子進行測序。

    1.2.3 重組質粒的轉染及編碼fshr366的慢病毒的包裝 將提取的無菌處理過的重組質粒Lentifshr366/Lenti-EGFP∶pCMV-VSVG∶pCMV-dR8.91按4∶2∶3質量比例混于37℃預熱的Opti-MEM,Opti-MEM∶三質??傎|量=50∶1(μL/μg)。充分混勻離心后將恢復到室溫的fugene HD轉染試劑與三質??傎|量的比為3∶1(μL/μg)加到液面下吹打混勻。室溫靜置15 min后,將混合液滴加到預鋪的293T細胞中搖勻。分別收集48-96 h的病毒上清,用0.45 μm濾器過濾,過濾后上清即病毒液。得到空白對照病毒液以及含F(xiàn)SHR基因的病毒液。

    1.2.4 RT-PCR檢測慢病毒Lenti-fshr366感染的293T細胞中FSHR基因的表達 收集未感染的293T細胞和感染了攜帶fshr366的慢病毒顆粒的293T細胞,加入Trizol充分裂解細胞后提取細胞的總RNA,反轉錄合成cDNA。以cDNA為模板,fshr366的上游引物為:fshr366-5'-AAATCTTAAGAAGCTGAGGGCCA-3',下游引物為:fshr366-5'-GATGAAGCTCAGAGATTTGCCG-3';內(nèi)參基因G3PD的上游引物為:G3PD-5'-AGGTCGGAGTCAACGGATTTGG-3',下游引物為:G3PD-5'-AGGCTGTTGTGATACTTCTCATGG-3'。PCR擴增慢病毒Lenti-fshr366感染的293T細胞中fshr基因以及內(nèi)參基因的表達。

    1.2.5 Western blot檢測慢病毒Lenti-fshr366感染的293T細胞中FSHR蛋白表達 收集293T細胞、空載病毒顆粒感染的293T細胞和攜帶fshr366的慢病毒顆粒感染的293T細胞,加入細胞裂解液將細胞吹散,在冰上裂解10 min后,12 000 r/min離心5 min,棄細胞碎片,從上清中收集蛋白質。上清經(jīng)12%SDSPAGE凝膠電泳,轉膜,3% BSA 封閉過夜,PBST洗5次后,加入一抗兔抗人FSHR多克隆抗體,室溫孵育2 h,PBST洗3次,加入二抗HRP-羊抗兔IgG,室溫孵育1 h后化學發(fā)光顯色,觀察目的蛋白的表達情況。

    1.2.6 重組慢病毒疫苗對小鼠的免疫效應研究 將BALB/c小鼠分為3組,每組7只,分別為A、培養(yǎng)基對照組;B、空載體慢病毒組;C、攜帶fshr366的慢病毒組。分別單次、腹腔注射:A、100 μL 含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基;B、100 μL含相當于500 ng/mL p24抗原的空載慢病毒顆粒;C、100 μL含相當于500 ng/mL p24抗原的攜帶fshr366的慢病毒顆粒。分別在免疫第0、14、21和28 d小鼠眼眶取血,分離血清,ELISA檢測小鼠血清中IgG抗體特異性及抗體滴度。其中FSHR抗原包被濃度為8 μg/mL,一抗為不同稀釋比例的小鼠血清,二抗為HRP標記的山羊抗小鼠IgG(H+L),其稀釋比例為1∶5 000。終止后使用酶標儀于450 nm處測量OD值,采用GraphPad Prism5.0進行分析。

    2 結果

    2.1 目的基因fshr366的PCR擴增及純化回收

    以pCMV-SPORT6-FSHR質粒為PCR模板,用P1、P2引物PCR擴增獲得fshr包含信號肽的胞外區(qū)的目的基因fshr366,電泳結果(圖1)顯示,在約1 098 bp附近處有明顯條帶。

    圖1 PCR擴增目的基因fshr366

    2.2 目的基因fshr366與載體的酶切、純化回收

    用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和NheⅠ對慢載體Lenti-EGFP進行雙酶切,用BclⅠ(BamHⅠ同尾酶),NheⅠ對目的基因fshr366進行雙酶切。凝膠電泳結果(圖2)顯示,酶切結果正確(Lenti-EGFP為7.8 kb和911 bp,fshr366為1 098 bp)。將載體和目的基因的酶切產(chǎn)物進行切膠回收,得到條帶大小正確的單一的條帶。

    2.3 重組質粒Lenti-fshr366的鑒定

    將重組質粒轉化入DH5α感受態(tài)細胞中,隨機挑取單克隆進行菌液PCR擴增鑒定正確重組的基因克隆,如圖3所示。因為載體上的BamHⅠ和基因上的BclⅠ為同尾酶,同尾酶連接后,酶的識別位點改變,所以選用載體和目的基因上都有的酶切位點EcoR V來進行酶切鑒定,載體上在4 253 bp處有EcoR V酶切位點,目的基因在1 074 bp處有EcoR V酶切位點,重組質粒酶切后的條帶預期大小為1.3 kb和7.5 kb,選取PCR鑒定陽性的質粒用EcoRⅤ進行單酶切鑒定,符合預期片段大小,結果如圖4所示。對陽性重組基因進行測序,測序結果顯示fshr366已正確連接到慢病毒載體上。

    圖2 Lenti-EGFP載體和目的基因fshr366的酶切及回收

    圖3 菌液PCR鑒定重組質粒Lenti-fshr366

    圖4 重組質粒Lenti-fshr366的酶切鑒定

    2.4 攜帶fshr366的慢病毒顆粒的包裝及感染

    采用脂質體轉染法將Lenti-fshr366/Lenti-EGFP、pCMV-VSVG、pCMV-dR8.91共轉染入293T細胞,轉染24 h后,收集含有病毒顆粒的培養(yǎng)基,即得到含有目的基因fshr366的病毒和空載的病毒(圖5)。

    圖5 空質粒Lenti-EGFP(A)和重組質粒Lenti-fshr366(B)轉染293T細胞(10×)

    2.5 RT-PCR檢測fshr366基因在293T細胞中的表達

    收集未感染的293T細胞及感染攜帶fshr366的慢病毒顆粒的293T細胞,提取各組細胞中的總RNA,反轉后進行RT-PCR,結果(圖6)顯示fshr366在攜帶fshr366的慢病毒顆粒感染的293T細胞中表達量明顯高于未轉染的293T細胞組。

    2.6 Western blot檢測FSHR366蛋白在293T細胞中的表達

    分別用空載慢病毒顆粒和攜帶fshr366的慢病毒顆粒感染293T細胞,感染48 h后收集并裂解細胞,Western blot結果(圖7)顯示,與空載慢病毒顆粒轉染組和未轉染293T細胞相比較,只有攜帶fshr366的慢病毒顆粒感染的293T細胞中有FSHR366蛋白的表達。

    圖6 RT-PCR檢測293T細胞中fshr366的表達

    圖7 Western blot檢測感染攜帶fshr366的慢病毒顆粒感染的293T細胞中FSHR366蛋白的表達

    2.7 ELISA檢測小鼠血清中IgG抗體水平

    分別用培養(yǎng)基、空載病毒顆粒、攜帶fshr366的病毒顆粒單次腹腔免疫BALB/c小鼠,在免疫第0、14、21和28天對小鼠進行眼眶取血,用FSHR349蛋白作為抗原,ELISA檢測血清中IgG抗體特異性及抗體滴度。

    利用Graphpad Prism 5對ELISA結果進行單因素方差分析后得出,在小鼠血清稀釋比例為1∶200時,檢測攜帶fshr366的病毒顆粒免疫的小鼠的血清抗體水平,發(fā)現(xiàn)在第14、21和28天的抗體水平與免疫前相比有顯著差異(P<0.05)??蛰d病毒顆粒免疫的小鼠免疫14、21和28天后與免疫前相比抗體水平有顯著差異(P<0.05),表明空載病毒顆粒對激起小鼠的體液免疫反應有一定的影響。但免疫后14、21和28 d,實驗組與空載病毒組相比差異顯著(P<0.05),與培養(yǎng)基組相比差異極顯著(P<0.01)。數(shù)據(jù)結果(圖8)表明,攜帶fshr366的病毒顆粒單次免疫BALB/c小鼠后能激起小鼠的體液免疫反應。根據(jù)抗體滴度測定結果(圖9)顯示,實驗組免疫后14 d和21 d抗體的滴度均為1∶1 600,在28 d時達到1∶3 200,表明此慢病毒疫苗激起早期的持續(xù)性體液免疫反應。

    圖8 ELISA檢測小鼠血清中IgG抗體水平

    圖9 ELISA測定fshr366的病毒顆粒免疫28 d小鼠血清中抗體的滴度

    3 討論

    人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)來源的慢病毒載體是目前基因治療中研究較多的載體,近來在疫苗研制領域也顯現(xiàn)出極大的應用潛力[14]。與通常使用的腺病毒、腺相關病毒以及逆轉錄病毒載體相比,具有感染非分裂期細胞及容納外源性目的基因片段大和免疫源性低等優(yōu)點。本研究針對FSHR基因構建慢病毒載體疫苗,進一步證明了慢病毒載體可以作為激發(fā)體液免疫反應的有效工具。

    以往基于慢病毒載體的疫苗的研究主要用于產(chǎn)生細胞免疫反應[15-18],作為產(chǎn)生體液免疫反應的應用并不多見,但 Iglesias等[19]通過構建基于西尼羅病毒的E型包膜糖蛋白的慢病毒載體疫苗,首次研究了慢病毒疫苗激起機體特異性和保護性的體液免疫。本研究結果擴展了慢病毒載體疫苗的應用,更有價值的是,在本研究中我們構建的攜帶FSHR胞外區(qū)的慢病毒載體疫苗,僅通過單次小劑量的病毒顆粒免疫小鼠便得到了持續(xù)時間達到28 d的抗體反應,抗體滴度達到1∶3 200。這些結果與Iglesias等[19]的研究相類似,表明慢病毒載體可以激發(fā)早期、持續(xù)性的體液免疫反應。由此顯示,慢病毒載體具有作為一種主動免疫疫苗載體的潛能。

    本實驗所研究的靶點為FSHR,F(xiàn)SHR以往被認為主要表達在生殖細胞中,其與配體FSH共同作用促進卵巢內(nèi)卵泡的發(fā)育。但由于FSHR本身結構的多態(tài)性及在正常組織及癌變組織中表達的差異性[20],使得FSHR與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展有一定的聯(lián)系。Zhang等[21]通過FSH肽將抗腫瘤藥物紫杉醇靶向導入FSHR陽性的卵巢癌細胞,在體內(nèi)外獲得了顯著的抗腫瘤效應,同樣,董俊等[22]通過FSH肽將卵巢癌發(fā)生發(fā)展相關的趨化因子1(CXCL1)的siRNA靶向導入FSHR陽性的卵巢癌細胞,抑制了卵巢癌細胞的生長、遷移及侵襲,都證明了靶向FSHR的治療方法是可行且有效的。最近又發(fā)現(xiàn)FSHR 在多種實體瘤血管內(nèi)皮細胞內(nèi)特異表達,這強烈提示FSHR可以作為腫瘤治療的一個很好的切入點,激起了研究人員對該蛋白新的研究興趣。Stilley等[23]發(fā)現(xiàn),F(xiàn)SH與其受體結合可以促進HUVEC細胞的血管形成作用。本研究通過構建的攜帶FSHR的慢病毒疫苗初步證明,該疫苗可以激發(fā)持續(xù)的抗FSHR抗體,其產(chǎn)生的抗體有望阻斷腫瘤血管細胞表面FSHR與配體的結合從而可能獲得抗腫瘤效應。關于這一部分工作需要后期進一步的抗腫瘤動物實驗驗證。

    4 結論

    本研究構建了攜帶FSHR的慢病毒載體疫苗,單次腹腔免疫BALB/c小鼠,ELISA結果顯示在免疫28 d時抗體滴度達到1∶3 200,說明疫苗在小鼠體內(nèi)獲得了持續(xù)的體液免疫反應。證明了慢病毒載體疫苗在激起機體體液免疫方面具有的潛在應用價值。

    [1] Pierce JG, Parsons TF. Glycoprotein hormones:structure and function[J]. Annual Review of Biochemistry, 1981, 50(1):465-495.

    [2]任春明, 字向東, 張重慶, 等. 卵泡刺激素的研究進展[J]. 科研前沿, 2006, 10(208):10-13.

    [3] Simoni M, Gromoll J, Nieschlag E. The Follicle-stimulating hormone receptor:Biochemistry, molecular biology, physiology, and pathophysiology 1[J]. Endocrine Reviews, 1997, 18(6):739-773.

    [4]Li Y, Ganta S, Cheng C, et al. FSH stimulates ovarian cancer cell growth by action on growth factor variant receptor[J]. Molecular and Cellular Endocrinology, 2007, 267(1):26-37.

    [5]Parrott JA, Doraiswamy V, Kim G, et al. Expression and actions of both the follicle stimulating hormone receptor and the luteinizing hormone receptor in normal ovarian surface epithelium and ovarian cancer[J]. Molecular and Cellular Endocrinology, 2001, 172(1):213-222.

    [6]Zheng W, Lu JJ, Luo F, et al. Ovarian epithelial tumor growth promotion by follicle-stimulating hormone and inhibition of the effect by luteinizing hormone[J]. Gynecologic Oncology, 2000, 76(1):80-88.

    [7]Radu A, Pichon C, Camparo P, et al. Expression of folliclestimulating hormone receptor in tumor blood vessels[J]. New England Journal of Medicine, 2010, 363(17):1621-1630.

    [8]Stilley JA, Guan R, Duffy DM, et al. Signaling through FSH receptors on human umbilical vein endothelial cells promotes angiogenesis[J]. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 2014, 99(5):E813-E820.

    [9]Gartrell BA, Tsao C, Galsky MD. The follicle-stimulating hormone receptor:a novel target in genitourinary malignancies[C]// Urologic Oncology:Seminars and Original Investigations. Elsevier,2013, 31(8):1403-1407.

    [10]Ghinea N. A novel role for FSH receptor as a tumor endothelial cell marker[J]. Acta Endocrinologica(Buc), 2010, 6(4):507-512.

    [11]柏琦, 那鑫妮, 馮姍姍. 病毒載體的發(fā)展歷程及現(xiàn)狀[J]. 中國醫(yī)藥指南, 2011, 9(23):224-225.

    [12]Palmowski MJ, Lopes L, Ikeda Y, et al. Intravenous injection of a lentiviral vector encoding NY-ESO-1 induces an effective CTL response[J]. The Journal of Immunology, 2004, 172(3):1582-1587.

    [13]李明峰, 候靜, 熊偉民. 攜帶AFP基因慢病毒載體制備并感染樹突狀細胞的實驗研究[J]. 細胞與分子免疫學雜志, 2009,25(9):791-793.

    [14]羅望, 張泓, 許淼, 等. 慢病毒—基因轉移的潛在新載體[J].江蘇藥學與臨床研究, 2006, 14(6):366-371.

    [15]Esslinger C, Chapatte L, Finke D, et al. In vivo administration of a lentiviral vaccine targets DCs and induces efficient CD8(+)T cell responses[J]. J Clin Invest, 2003, 111:1673-1681.

    [16]Breckpot K, Dullaers M, Bonehill A, et al. Lentivirally transduced dendritic cells as a tool for cancer immunotherapy[J]. J Gene Med, 2003, 5:654-667.

    [17]Esslinger C, Romero P, MacDonald HR. Efficient transduction of dendritic cells and induction of a T-cell response by thirdgeneration lentivectors[J]. Hum Gene Ther, 2002, 13:1091-1100.

    [18]Palmowski MJ, Lopes L, Ikeda Y, et al. Intravenous injection of a lentiviral vector encoding NY-ESO-1 induces an effective CTL response[J]. J Immunol, 2004, 172:1582-1587.

    [19] Iglesias MC, Frenkiel MP, Mollier K, et al. A single immunization with a minute dose of a lentiviral vector-based vaccine is highly effective at eliciting protective humoral immunity against West Nile virus[J]. The Journal of Gene Medicine, 2006, 8(3):265-274.

    [20] Wunseh A, AhdaY, Banaz-Yasar F, et al. Single-nucleotide polymorphisms in the promoter region influence the expression of the human follicle-stimulating Hormone receptor[J]. Fertil Steril,2005, 84(2):446-453.

    [21]Zhang X, Chen J, Zheng Y, et al. Follicle-stimulating hormone peptide can facilitate paclitaxel nanoparticles to target ovarian carcinoma in vivo[J]. Cancer Research, 2009, 69(16):6506-6514.

    [22]董俊. 基于卵泡刺激素素受體介導的靶向治療卵巢癌實驗研究[D]. 上海:復旦大學, 2011.

    [23] Stilley JA, Guan R, Duffy DM, et al. Signaling through FSH receptors on human umbilical vein endothelial cells promotes angiogenesis[J]. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 2014,99(5):E813-E820.

    (責任編輯 李楠)

    Development of a Lentivirus Vector-based Vaccine Carrying Folliclestimulating Hormone Receptor and Assay of Its Immunological Effect

    MA Xiao-ling LIU Hong-chun LI Jiang-wei
    (Key Laboratory of Xinjiang Biological Resources and Gene Engineering,College of Life Sciences and Technology,Xinjiang University,Urumqi 830046)

    This work aims to prepare lentivirus vaccine with a follicle-stimulating hormone receptor(FSHR)and investigate the immunological effect of it on mice. The gene(fshr366)of extracellular region of FSHR was cloned into lentivirus vector. The recombinant plasmids were transfected into the 239T cells by the method of lipidosome transfection,and the virus particles(Lenti-FSHR366)with target gene were produced after encapsulation. The expressions of fshr366 mRNA and FSHR366 protein in 293T cells infected by Lenti-FSHR366 were detected by RT-PCR and Western blot. For evaluating the immunological effects,BALB/c mice were intraperitoneally inoculated with single immunization of fshr366-carring virus,collecting the blood samples from the orbits of mice at day 0,14,21 and 28 after immunization,then ELISA method was used to detect the specificity of the sera from immunized mice and determine the titer of the antibody. The RE digestion and DNA sequencing results showed the gene fragment of fshr366 was successfully cloned into lentivirus vector. After transfection to 293T cells with the encapsulated lentivirus particles carrying fshr366,the detection results by RT-PCR and Western blot indicated the expression of gene fshr in the cells at transcription and protein level. The results of ELISA revealed that the humoral immune response in mice rose on day 14 after single immunization through intraperitoneally injection of lentivirus particles carrying fshr366,the titer of antibody was 1∶1 600.

    follicle-stimulating hormone receptor;lentivirus vector;vaccine;humoral response

    10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.024

    2015-09-03

    國家自然科學基金項目(81260333),新疆自治區(qū)高技術研究發(fā)展項目(201110102)

    馬曉玲,女,碩士研究生,研究方向:腫瘤免疫診斷和治療的分子基礎研究;E-mail:1239598355@qq.com

    李江偉,男,教授,研究方向:腫瘤免疫診斷和治療的分子基礎研究;E-mail:jwli67@sina.com

    猜你喜歡
    小鼠
    晚安,大大鼠!
    萌小鼠,捍衛(wèi)人類健康的“大英雄”
    科學大眾(2021年6期)2021-07-20 07:42:44
    視神經(jīng)節(jié)細胞再生令小鼠復明
    科學(2020年3期)2020-11-26 08:18:30
    小鼠大腦中的“冬眠開關”
    今天不去幼兒園
    清肝二十七味丸對酒精性肝損傷小鼠的保護作用
    中成藥(2018年2期)2018-05-09 07:19:34
    米小鼠和它的伙伴們
    高氟對C57BL/6J小鼠睪丸中AQP1、AQP4表達的影響
    Avp-iCre轉基因小鼠的鑒定
    加味四逆湯對Con A肝損傷小鼠細胞凋亡的保護作用
    a级一级毛片免费在线观看| 99九九线精品视频在线观看视频| 国产真实乱freesex| 直男gayav资源| 国产伦在线观看视频一区| 国产精品一区二区性色av| 国产一区二区在线观看日韩| 黄色视频,在线免费观看| 国产淫片久久久久久久久| 亚洲不卡免费看| 不卡视频在线观看欧美| 国产一区二区在线观看日韩| 男女视频在线观看网站免费| 中出人妻视频一区二区| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 美女大奶头视频| 国产成年人精品一区二区| 久久久久国内视频| 国产探花极品一区二区| 日本与韩国留学比较| 国产亚洲91精品色在线| 日韩 亚洲 欧美在线| 久久人妻av系列| 国产精品人妻久久久久久| 免费一级毛片在线播放高清视频| a级毛片免费高清观看在线播放| 久久久精品94久久精品| 久久久精品94久久精品| 色播亚洲综合网| 男女边吃奶边做爰视频| 欧美性感艳星| 国产精品久久久久久av不卡| 老司机影院成人| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 看片在线看免费视频| 久久久欧美国产精品| 看十八女毛片水多多多| 22中文网久久字幕| 精品一区二区免费观看| 偷拍熟女少妇极品色| 久久午夜福利片| 六月丁香七月| 简卡轻食公司| 色尼玛亚洲综合影院| 特级一级黄色大片| 久久久久久九九精品二区国产| 日韩欧美三级三区| 欧美激情在线99| 禁无遮挡网站| 一级黄片播放器| 国产乱人偷精品视频| 精品久久久久久久久久免费视频| 亚洲国产精品合色在线| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 中文字幕av成人在线电影| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 变态另类丝袜制服| 露出奶头的视频| 1024手机看黄色片| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 别揉我奶头 嗯啊视频| 亚洲第一电影网av| 成人永久免费在线观看视频| 亚洲精品亚洲一区二区| 免费高清视频大片| 男女视频在线观看网站免费| 六月丁香七月| 美女 人体艺术 gogo| 国产在视频线在精品| 精品福利观看| 大型黄色视频在线免费观看| 男人舔女人下体高潮全视频| 欧美性猛交黑人性爽| 一区二区三区免费毛片| 秋霞在线观看毛片| 免费人成在线观看视频色| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 亚洲成人精品中文字幕电影| 九色成人免费人妻av| 男女之事视频高清在线观看| 69av精品久久久久久| 久久99热6这里只有精品| 真实男女啪啪啪动态图| 亚洲av五月六月丁香网| 亚洲精品日韩在线中文字幕 | 插逼视频在线观看| 亚洲美女黄片视频| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 美女免费视频网站| 亚洲美女视频黄频| 精品乱码久久久久久99久播| 精品久久国产蜜桃| 岛国在线免费视频观看| 男人和女人高潮做爰伦理| 中文在线观看免费www的网站| 99久久九九国产精品国产免费| 一级黄色大片毛片| ponron亚洲| 欧美bdsm另类| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 六月丁香七月| 夜夜夜夜夜久久久久| 精品久久久久久久久久免费视频| 少妇高潮的动态图| 久久久久久九九精品二区国产| 欧美bdsm另类| 国产精品精品国产色婷婷| 久久九九热精品免费| 亚洲美女搞黄在线观看 | or卡值多少钱| 老司机影院成人| 亚洲国产精品国产精品| 又黄又爽又免费观看的视频| av在线观看视频网站免费| 午夜亚洲福利在线播放| 午夜久久久久精精品| 国产午夜福利久久久久久| 国产亚洲91精品色在线| 国产精品久久久久久久久免| 国产成人精品久久久久久| 亚洲精品粉嫩美女一区| 亚洲av电影不卡..在线观看| 国产成人精品久久久久久| 97在线视频观看| 啦啦啦啦在线视频资源| 熟女电影av网| 九九热线精品视视频播放| 欧美3d第一页| 国产熟女欧美一区二区| 日韩强制内射视频| 亚洲国产精品国产精品| 99国产极品粉嫩在线观看| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 久久精品夜色国产| 亚洲三级黄色毛片| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 精品午夜福利在线看| 国产精品人妻久久久影院| 日本免费a在线| 久99久视频精品免费| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 欧美激情国产日韩精品一区| 男人舔奶头视频| 亚洲精品日韩在线中文字幕 | 国语自产精品视频在线第100页| 成人三级黄色视频| 久久精品国产清高在天天线| 国产精品女同一区二区软件| 一本久久中文字幕| 色av中文字幕| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 久久久久久久久中文| 欧美区成人在线视频| 搡老岳熟女国产| 日韩三级伦理在线观看| 天天躁日日操中文字幕| 午夜爱爱视频在线播放| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄 | 久久久久免费精品人妻一区二区| 免费电影在线观看免费观看| 欧美色欧美亚洲另类二区| 又黄又爽又免费观看的视频| 色综合站精品国产| 日本在线视频免费播放| 亚洲精品日韩在线中文字幕 | 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 大香蕉久久网| 亚洲精品成人久久久久久| 丝袜喷水一区| 欧美高清成人免费视频www| 色综合色国产| 男人舔奶头视频| 少妇的逼好多水| 亚洲精品久久国产高清桃花| 晚上一个人看的免费电影| 中国美白少妇内射xxxbb| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 日本精品一区二区三区蜜桃| 97热精品久久久久久| 国产精品久久久久久久久免| 91狼人影院| 中文字幕av成人在线电影| 天堂动漫精品| videossex国产| 午夜精品国产一区二区电影 | 男插女下体视频免费在线播放| 久久久欧美国产精品| 男人舔女人下体高潮全视频| 在线看三级毛片| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 久久精品综合一区二区三区| 亚洲不卡免费看| 日韩人妻高清精品专区| 在线观看午夜福利视频| 亚洲,欧美,日韩| 日韩制服骚丝袜av| 啦啦啦啦在线视频资源| ponron亚洲| 免费搜索国产男女视频| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 五月玫瑰六月丁香| 欧美3d第一页| 久久精品人妻少妇| 97热精品久久久久久| 亚洲中文日韩欧美视频| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 免费在线观看成人毛片| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 99九九线精品视频在线观看视频| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 午夜福利在线在线| 美女内射精品一级片tv| 欧美人与善性xxx| 黑人高潮一二区| 国产精品伦人一区二区| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 免费看美女性在线毛片视频| 国产高清三级在线| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 能在线免费观看的黄片| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 一夜夜www| 久久久久久久亚洲中文字幕| 精品国产三级普通话版| 啦啦啦啦在线视频资源| 97碰自拍视频| 最近在线观看免费完整版| 亚洲最大成人中文| 国产精品精品国产色婷婷| 最近最新中文字幕大全电影3| 无遮挡黄片免费观看| 给我免费播放毛片高清在线观看| 亚洲av二区三区四区| 淫秽高清视频在线观看| 日韩欧美国产在线观看| 午夜福利18| 亚洲欧美日韩高清专用| 一级黄色大片毛片| 日本爱情动作片www.在线观看 | 国国产精品蜜臀av免费| 又爽又黄无遮挡网站| 不卡一级毛片| 午夜老司机福利剧场| 欧美激情国产日韩精品一区| 91久久精品国产一区二区三区| 久久久久精品国产欧美久久久| 亚洲美女黄片视频| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 听说在线观看完整版免费高清| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 国产三级在线视频| 一进一出抽搐动态| 国内精品美女久久久久久| av在线播放精品| 免费一级毛片在线播放高清视频| 波多野结衣高清作品| 中文字幕免费在线视频6| 神马国产精品三级电影在线观看| 简卡轻食公司| 国产视频一区二区在线看| 一夜夜www| 免费一级毛片在线播放高清视频| 十八禁网站免费在线| 国产精品久久电影中文字幕| 成人三级黄色视频| 韩国av在线不卡| 不卡一级毛片| 免费观看的影片在线观看| 亚洲美女视频黄频| 中文字幕免费在线视频6| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 成人av在线播放网站| 亚洲av二区三区四区| 免费看美女性在线毛片视频| 国产亚洲精品av在线| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 成熟少妇高潮喷水视频| 日韩欧美精品v在线| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 欧美日韩综合久久久久久| 日韩欧美免费精品| 欧美高清成人免费视频www| 精品午夜福利在线看| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 国产三级在线视频| 国产日本99.免费观看| 12—13女人毛片做爰片一| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 欧美人与善性xxx| 国产黄a三级三级三级人| 别揉我奶头 嗯啊视频| 成人三级黄色视频| 啦啦啦啦在线视频资源| 欧美日本亚洲视频在线播放| 一级黄片播放器| 99视频精品全部免费 在线| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 女人被狂操c到高潮| av在线蜜桃| 亚洲最大成人av| 一本精品99久久精品77| 丰满的人妻完整版| 在线播放国产精品三级| 国产精品av视频在线免费观看| 成人鲁丝片一二三区免费| 欧美一区二区精品小视频在线| 亚洲欧美清纯卡通| 全区人妻精品视频| 俺也久久电影网| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 搡老妇女老女人老熟妇| 一个人看视频在线观看www免费| 少妇的逼好多水| 久久久久久久久久久丰满| 精品久久久久久久久亚洲| 色视频www国产| 久久热精品热| 51国产日韩欧美| 我的老师免费观看完整版| 性色avwww在线观看| 亚洲色图av天堂| 国产黄色小视频在线观看| 人人妻人人看人人澡| 少妇的逼好多水| 精品久久久久久久久久免费视频| 久久中文看片网| 高清毛片免费看| 欧美bdsm另类| 午夜福利成人在线免费观看| 精品久久久久久久久亚洲| 又爽又黄无遮挡网站| 亚洲精品一区av在线观看| 人妻少妇偷人精品九色| 免费在线观看影片大全网站| 欧美色视频一区免费| 日本成人三级电影网站| 夜夜爽天天搞| 亚洲av二区三区四区| 免费观看人在逋| 真人做人爱边吃奶动态| 97在线视频观看| 可以在线观看毛片的网站| 亚洲18禁久久av| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 国产精品人妻久久久影院| 真实男女啪啪啪动态图| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 欧美潮喷喷水| 97在线视频观看| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 可以在线观看毛片的网站| 久久精品影院6| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 国产精品免费一区二区三区在线| 国产精品永久免费网站| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 九九爱精品视频在线观看| 久久国产乱子免费精品| 极品教师在线视频| 色噜噜av男人的天堂激情| 国产v大片淫在线免费观看| 午夜影院日韩av| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 男人舔奶头视频| 亚洲成人久久爱视频| 国产午夜福利久久久久久| 亚洲最大成人手机在线| av在线蜜桃| 麻豆国产av国片精品| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 麻豆成人午夜福利视频| 日韩精品青青久久久久久| 精品人妻熟女av久视频| 神马国产精品三级电影在线观看| 最新在线观看一区二区三区| 美女免费视频网站| 亚洲不卡免费看| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 国产乱人偷精品视频| 久久久久久久久大av| 天堂影院成人在线观看| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 日韩欧美国产在线观看| 亚州av有码| 日韩欧美国产在线观看| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 成人精品一区二区免费| 一级毛片久久久久久久久女| 国产探花极品一区二区| 嫩草影院入口| 精品不卡国产一区二区三区| 亚洲av免费高清在线观看| 精品不卡国产一区二区三区| 1024手机看黄色片| 亚洲精品日韩在线中文字幕 | 免费av观看视频| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 亚洲无线观看免费| av在线播放精品| 三级经典国产精品| 免费观看的影片在线观看| 三级国产精品欧美在线观看| 最近的中文字幕免费完整| 此物有八面人人有两片| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 日韩制服骚丝袜av| 午夜精品一区二区三区免费看| 亚洲av成人av| 欧美高清成人免费视频www| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 欧美成人a在线观看| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 日本欧美国产在线视频| 日韩一本色道免费dvd| 韩国av在线不卡| 亚洲国产精品sss在线观看| 极品教师在线视频| 日日撸夜夜添| 中文字幕久久专区| 中国国产av一级| 91狼人影院| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 亚洲经典国产精华液单| 99久久精品国产国产毛片| 成人毛片a级毛片在线播放| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 欧美日韩在线观看h| 精品久久久久久成人av| 日韩欧美三级三区| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 亚洲av第一区精品v没综合| 国语自产精品视频在线第100页| 午夜免费激情av| 我的老师免费观看完整版| 午夜激情欧美在线| 五月伊人婷婷丁香| 观看免费一级毛片| 亚洲无线在线观看| 久久鲁丝午夜福利片| 成人无遮挡网站| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 少妇熟女欧美另类| 搡老岳熟女国产| 亚洲第一电影网av| 有码 亚洲区| 亚洲性久久影院| 久久韩国三级中文字幕| 国产午夜福利久久久久久| 欧美xxxx性猛交bbbb| 日韩欧美精品v在线| 精品久久久久久久末码| av.在线天堂| 久99久视频精品免费| 在线观看66精品国产| 日本一二三区视频观看| 波多野结衣高清无吗| 精品午夜福利视频在线观看一区| 99热网站在线观看| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 国产精品1区2区在线观看.| 午夜精品在线福利| 日本与韩国留学比较| 日本三级黄在线观看| 在线免费观看的www视频| 日韩一区二区视频免费看| 俄罗斯特黄特色一大片| av天堂中文字幕网| 成人性生交大片免费视频hd| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 伊人久久精品亚洲午夜| 久久久久国内视频| 嫩草影视91久久| 老司机福利观看| 黑人高潮一二区| 亚洲欧美成人精品一区二区| 色播亚洲综合网| 国产成人精品久久久久久| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国产不卡一卡二| 精品一区二区三区av网在线观看| 久久久精品欧美日韩精品| 看十八女毛片水多多多| 亚洲国产精品成人久久小说 | 日日干狠狠操夜夜爽| 国产精品久久久久久久电影| 一级黄片播放器| 成人国产麻豆网| 亚洲三级黄色毛片| 日本a在线网址| 99视频精品全部免费 在线| 亚洲人与动物交配视频| av在线观看视频网站免费| 别揉我奶头 嗯啊视频| 九色成人免费人妻av| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 91在线精品国自产拍蜜月| 全区人妻精品视频| 夜夜夜夜夜久久久久| 国产成人91sexporn| 成人精品一区二区免费| av卡一久久| 两个人的视频大全免费| 国产单亲对白刺激| 国产成年人精品一区二区| av在线亚洲专区| 97热精品久久久久久| 欧美+亚洲+日韩+国产| 成年av动漫网址| 床上黄色一级片| 亚洲欧美日韩东京热| 国产精品嫩草影院av在线观看| 国产一区二区三区av在线 | 亚洲第一区二区三区不卡| 久久99热6这里只有精品| 亚洲av.av天堂| 免费av观看视频| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 日韩av不卡免费在线播放| 国产精品久久电影中文字幕| 久久久久久国产a免费观看| 免费无遮挡裸体视频| 99在线视频只有这里精品首页| 深夜a级毛片| 久久人妻av系列| 深爱激情五月婷婷| 国产精品国产高清国产av| 中国美女看黄片| 免费av不卡在线播放| 97热精品久久久久久| av.在线天堂| 国产精品一区www在线观看| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 高清毛片免费看| 丰满乱子伦码专区| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 少妇人妻精品综合一区二区 | 国产一区二区在线av高清观看| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 麻豆成人午夜福利视频| avwww免费| 日韩一区二区视频免费看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 一个人看的www免费观看视频| 最近的中文字幕免费完整| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 少妇的逼水好多| 一边摸一边抽搐一进一小说| 欧美日本亚洲视频在线播放| 亚洲av成人精品一区久久| 日本免费a在线| 麻豆久久精品国产亚洲av| 欧美成人免费av一区二区三区| 精品久久久久久久久av| 亚洲经典国产精华液单| aaaaa片日本免费| 97超视频在线观看视频| 亚洲最大成人中文| 乱系列少妇在线播放| 草草在线视频免费看| 麻豆一二三区av精品| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 国产三级在线视频| 天堂网av新在线| 一区二区三区四区激情视频 | 亚洲精品国产成人久久av| 在线观看免费视频日本深夜| 国产69精品久久久久777片| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 99久久九九国产精品国产免费| 久久精品夜色国产| 色吧在线观看| 搞女人的毛片| 久99久视频精品免费| 国产精品久久久久久精品电影| 国产成人一区二区在线| 麻豆国产av国片精品| 日韩精品有码人妻一区| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 欧美一级a爱片免费观看看| 69av精品久久久久久| 亚洲精品日韩在线中文字幕 | 日本黄大片高清| 校园春色视频在线观看| 亚洲最大成人av| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 人妻久久中文字幕网| 91久久精品国产一区二区三区| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 久久人人爽人人片av| 久久久久久久久久黄片| 黄色一级大片看看| 三级毛片av免费| 黑人高潮一二区| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 国产视频内射| 亚洲av成人av| av天堂中文字幕网| 国产单亲对白刺激| 国国产精品蜜臀av免费| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| or卡值多少钱| 国产精品一区二区性色av| 国产精品永久免费网站| 日韩成人av中文字幕在线观看 | 亚洲av不卡在线观看| 亚洲最大成人av|