攜帶人卵泡刺激素受體的慢病毒載體疫苗的構(gòu)建及其免疫效應(yīng)檢測(cè)

馬曉玲 劉紅春 李江偉

（新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830046）

攜帶人卵泡刺激素受體的慢病毒載體疫苗的構(gòu)建及其免疫效應(yīng)檢測(cè)

馬曉玲 劉紅春 李江偉

（新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830046）

制備攜帶卵泡刺激素受體的慢病毒載體疫苗，并研究其對(duì)小鼠的免疫效應(yīng)。將卵泡刺激素受體胞外區(qū)（fshr366）基因克隆到慢病毒載體上，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，包裝并產(chǎn)生含有目的基因的病毒顆粒；分別利用RT-PCR和Western blot檢測(cè)感染病毒顆粒的293T細(xì)胞中fshr366 在mRNA水平及蛋白水平的表達(dá)情況；用攜帶fshr366的病毒顆粒單次腹腔免疫BALB/c小鼠，分別在免疫0、14、21和28 d對(duì)小鼠眼眶采血，ELISA法檢測(cè)免疫小鼠血清的特異性并測(cè)定抗體滴度。酶切和測(cè)序結(jié)果表明fshr366基因片段成功構(gòu)建到慢病毒載體上。將包裝產(chǎn)生的攜帶fshr366的慢病毒顆粒感染293T細(xì)胞后，RT-PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果表明細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平均表達(dá)fshr基因。ELISA結(jié)果顯示攜帶fshr366的慢病毒顆粒單次腹腔免疫小鼠后，免疫14 d就激起了機(jī)體的體液免疫反應(yīng)，抗體滴度達(dá)到1∶1 600。成功制備了攜帶卵泡刺激素受體的慢病毒載體疫苗，其可以在小鼠體內(nèi)激發(fā)FSHR抗原特異的早期持續(xù)性免疫反應(yīng)。

卵泡刺激素受體；慢病毒載體；疫苗；體液免疫反應(yīng)

卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）在人類生殖過程中發(fā)揮著重要作用，是促進(jìn)和維持正常的性腺發(fā)育和生殖功能的重要激素［1］，其生理功能是通過與卵巢顆粒細(xì)胞膜表面的特異性受體即卵泡刺激素受體（follicle-stimulating hormone receptor，F(xiàn)SHR）的結(jié)合來發(fā)揮的［2］。FSHR是一種跨膜糖蛋白，屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族中的糖蛋白亞家族成員。人的FSHR由695個(gè)氨基酸組成，其中氨基端17個(gè)氨基酸為疏水性信號(hào)肽，緊接著是FSHR的胞外區(qū)由349個(gè)氨基酸構(gòu)成，其后是264個(gè)氨基酸構(gòu)成的跨膜區(qū)，胞內(nèi)區(qū)是65個(gè)氨基酸組成的羧基末端［3］。以往對(duì)FSHR與腫瘤關(guān)系的研究主要集中于卵巢癌，但是最新研究發(fā)現(xiàn)FSHR 除了在卵巢癌中表達(dá)，在其他多種實(shí)體瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞中也都有表達(dá)，但是在鄰近的正常組織中不表達(dá)［7］，推測(cè)FSH 與其受體FSHR可能通過不同信號(hào)途徑參與促進(jìn)腫瘤血管形成作用［8］。初步研究表明FSHR有可能作為潛在的腫瘤治療靶點(diǎn)和腫瘤診斷以及愈后分子標(biāo)志物［9，10］。因此，制備基于FSHR靶點(diǎn)的抗體對(duì)腫瘤的診斷以及治療都有重要的意義。

本研究中采用的慢病毒表達(dá)載體是以人類免疫缺陷I型病毒（HIV-1）為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體［11］。它具有可以感染非分裂期細(xì)胞、容納外源性大基因片段、基因?qū)胄始氨磉_(dá)水平高等優(yōu)點(diǎn)［12］，慢病毒載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因的表達(dá)能持續(xù)數(shù)月［13］，從而達(dá)到良好的基因治療效果。

本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了攜帶人卵泡刺激素受體胞外區(qū)的慢病毒載體疫苗，將包裝出的攜帶卵泡刺激素受體胞外區(qū)的慢病毒顆粒單次免疫小鼠研究其體液免疫效應(yīng)，旨在為進(jìn)一步研究靶向人卵泡刺激素受體的慢病毒載體疫苗的抗腫瘤機(jī)制和效果奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 pCMV-SPORT6-FSHR質(zhì)粒購(gòu)自長(zhǎng)沙贏潤(rùn)生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒Lenti-EGFP、pCMV-dR8.91、pCMV-VSVG購(gòu)自上海斯丹賽生物技術(shù)有限公司；大腸桿菌菌株DH5α和293T細(xì)胞為新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；6-8周BALB/c小鼠，購(gòu)買于新疆醫(yī)科大學(xué)。

1.1.2 工具酶和主要試劑 Pfx聚合酶為Invitrogen公司產(chǎn)品；T4連接酶、各種限制性內(nèi)切酶和逆轉(zhuǎn)錄酶為Fermentas公司產(chǎn)品；質(zhì)粒小提試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、DNA膠回收試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；兔抗FSHR多克隆抗體為上海江萊生物科技有限公司產(chǎn)品；抗β-actin鼠單克隆抗體、羊抗兔HRP-IgG單克隆抗體、羊抗鼠HRP-IgG單克隆抗體為北京康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品；Opti-MEM培養(yǎng)基、DMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自GIBCO公司。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑為Promega公司產(chǎn)品；polybrene為Sigma公司產(chǎn)品；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 FSHR胞外區(qū)的擴(kuò)增 以pCMV-SPORT6-FSHR質(zhì)粒作為PCR擴(kuò)增FSHR胞外區(qū)基因序列的模板，根據(jù)FSHR胞外區(qū)基因序列設(shè)計(jì)引物：P1：5'-GGCCTGATCAGCCACCATGGCCCTGCTCCTGGTCTC-3' 包含BclⅠ酶切位點(diǎn)，P2：5'-CCGGGCTAGCTCTGAGGATGTTGTACCCCATG-3'包含酶切位點(diǎn)NheⅠ，此引物擴(kuò)增的序列為FSHR胞外區(qū)加信號(hào)肽的基因序列（即FSHR第1-366位氨基酸，共1 098 bp，將擴(kuò)增出的片段簡(jiǎn)稱為fshr366）。

1.2.2 基因克隆、構(gòu)建及測(cè)序 用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ（BclⅠ的同尾酶）和NheⅠ雙酶切慢載體Lenti-EGFP，切膠回收載體。用BclⅠ和NheⅠ雙酶切fshr366基因片段。回收純化步驟參考上海生工DNA膠回收試劑盒和PCR產(chǎn)物純化試劑盒說明書。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆，對(duì)PCR以及雙酶切鑒定為陽(yáng)性的重組子進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染及編碼fshr366的慢病毒的包裝 將提取的無菌處理過的重組質(zhì)粒Lentifshr366/Lenti-EGFP∶pCMV-VSVG∶pCMV-dR8.91按4∶2∶3質(zhì)量比例混于37℃預(yù)熱的Opti-MEM，Opti-MEM∶三質(zhì)?？傎|(zhì)量=50∶1（μL/μg）。充分混勻離心后將恢復(fù)到室溫的fugene HD轉(zhuǎn)染試劑與三質(zhì)粒總質(zhì)量的比為3∶1（μL/μg）加到液面下吹打混勻。室溫靜置15 min后，將混合液滴加到預(yù)鋪的293T細(xì)胞中搖勻。分別收集48-96 h的病毒上清，用0.45 μm濾器過濾，過濾后上清即病毒液。得到空白對(duì)照病毒液以及含F(xiàn)SHR基因的病毒液。

1.2.4 RT-PCR檢測(cè)慢病毒Lenti-fshr366感染的293T細(xì)胞中FSHR基因的表達(dá) 收集未感染的293T細(xì)胞和感染了攜帶fshr366的慢病毒顆粒的293T細(xì)胞，加入Trizol充分裂解細(xì)胞后提取細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板，fshr366的上游引物為：fshr366-5'-AAATCTTAAGAAGCTGAGGGCCA-3'，下游引物為：fshr366-5'-GATGAAGCTCAGAGATTTGCCG-3'；內(nèi)參基因G3PD的上游引物為：G3PD-5'-AGGTCGGAGTCAACGGATTTGG-3'，下游引物為：G3PD-5'-AGGCTGTTGTGATACTTCTCATGG-3'。PCR擴(kuò)增慢病毒Lenti-fshr366感染的293T細(xì)胞中fshr基因以及內(nèi)參基因的表達(dá)。

1.2.5 Western blot檢測(cè)慢病毒Lenti-fshr366感染的293T細(xì)胞中FSHR蛋白表達(dá) 收集293T細(xì)胞、空載病毒顆粒感染的293T細(xì)胞和攜帶fshr366的慢病毒顆粒感染的293T細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液將細(xì)胞吹散，在冰上裂解10 min后，12 000 r/min離心5 min，棄細(xì)胞碎片，從上清中收集蛋白質(zhì)。上清經(jīng)12%SDSPAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，3% BSA 封閉過夜，PBST洗5次后，加入一抗兔抗人FSHR多克隆抗體，室溫孵育2 h，PBST洗3次，加入二抗HRP-羊抗兔IgG，室溫孵育1 h后化學(xué)發(fā)光顯色，觀察目的蛋白的表達(dá)情況。

1.2.6 重組慢病毒疫苗對(duì)小鼠的免疫效應(yīng)研究 將BALB/c小鼠分為3組，每組7只，分別為A、培養(yǎng)基對(duì)照組；B、空載體慢病毒組；C、攜帶fshr366的慢病毒組。分別單次、腹腔注射：A、100 μL 含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基；B、100 μL含相當(dāng)于500 ng/mL p24抗原的空載慢病毒顆粒；C、100 μL含相當(dāng)于500 ng/mL p24抗原的攜帶fshr366的慢病毒顆粒。分別在免疫第0、14、21和28 d小鼠眼眶取血，分離血清，ELISA檢測(cè)小鼠血清中IgG抗體特異性及抗體滴度。其中FSHR抗原包被濃度為8 μg/mL，一抗為不同稀釋比例的小鼠血清，二抗為HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（H+L），其稀釋比例為1∶5 000。終止后使用酶標(biāo)儀于450 nm處測(cè)量OD值，采用GraphPad Prism5.0進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 目的基因fshr366的PCR擴(kuò)增及純化回收

以pCMV-SPORT6-FSHR質(zhì)粒為PCR模板，用P1、P2引物PCR擴(kuò)增獲得fshr包含信號(hào)肽的胞外區(qū)的目的基因fshr366，電泳結(jié)果（圖1）顯示，在約1 098 bp附近處有明顯條帶。

圖1 PCR擴(kuò)增目的基因fshr366

2.2 目的基因fshr366與載體的酶切、純化回收

用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和NheⅠ對(duì)慢載體Lenti-EGFP進(jìn)行雙酶切，用BclⅠ（BamHⅠ同尾酶），NheⅠ對(duì)目的基因fshr366進(jìn)行雙酶切。凝膠電泳結(jié)果（圖2）顯示，酶切結(jié)果正確（Lenti-EGFP為7.8 kb和911 bp，fshr366為1 098 bp）。將載體和目的基因的酶切產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收，得到條帶大小正確的單一的條帶。

2.3 重組質(zhì)粒Lenti-fshr366的鑒定

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，隨機(jī)挑取單克隆進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增鑒定正確重組的基因克隆，如圖3所示。因?yàn)檩d體上的BamHⅠ和基因上的BclⅠ為同尾酶，同尾酶連接后，酶的識(shí)別位點(diǎn)改變，所以選用載體和目的基因上都有的酶切位點(diǎn)EcoR V來進(jìn)行酶切鑒定，載體上在4 253 bp處有EcoR V酶切位點(diǎn)，目的基因在1 074 bp處有EcoR V酶切位點(diǎn)，重組質(zhì)粒酶切后的條帶預(yù)期大小為1.3 kb和7.5 kb，選取PCR鑒定陽(yáng)性的質(zhì)粒用EcoRⅤ進(jìn)行單酶切鑒定，符合預(yù)期片段大小，結(jié)果如圖4所示。對(duì)陽(yáng)性重組基因進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示fshr366已正確連接到慢病毒載體上。

圖2 Lenti-EGFP載體和目的基因fshr366的酶切及回收

圖3 菌液PCR鑒定重組質(zhì)粒Lenti-fshr366

圖4 重組質(zhì)粒Lenti-fshr366的酶切鑒定

2.4 攜帶fshr366的慢病毒顆粒的包裝及感染

采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將Lenti-fshr366/Lenti-EGFP、pCMV-VSVG、pCMV-dR8.91共轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后，收集含有病毒顆粒的培養(yǎng)基，即得到含有目的基因fshr366的病毒和空載的病毒（圖5）。

圖5 空質(zhì)粒Lenti-EGFP（A）和重組質(zhì)粒Lenti-fshr366（B）轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞（10×）

2.5 RT-PCR檢測(cè)fshr366基因在293T細(xì)胞中的表達(dá)

收集未感染的293T細(xì)胞及感染攜帶fshr366的慢病毒顆粒的293T細(xì)胞，提取各組細(xì)胞中的總RNA，反轉(zhuǎn)后進(jìn)行RT-PCR，結(jié)果（圖6）顯示fshr366在攜帶fshr366的慢病毒顆粒感染的293T細(xì)胞中表達(dá)量明顯高于未轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞組。

2.6 Western blot檢測(cè)FSHR366蛋白在293T細(xì)胞中的表達(dá)

分別用空載慢病毒顆粒和攜帶fshr366的慢病毒顆粒感染293T細(xì)胞，感染48 h后收集并裂解細(xì)胞，Western blot結(jié)果（圖7）顯示，與空載慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞相比較，只有攜帶fshr366的慢病毒顆粒感染的293T細(xì)胞中有FSHR366蛋白的表達(dá)。

圖6 RT-PCR檢測(cè)293T細(xì)胞中fshr366的表達(dá)

圖7 Western blot檢測(cè)感染攜帶fshr366的慢病毒顆粒感染的293T細(xì)胞中FSHR366蛋白的表達(dá)

2.7 ELISA檢測(cè)小鼠血清中IgG抗體水平

分別用培養(yǎng)基、空載病毒顆粒、攜帶fshr366的病毒顆粒單次腹腔免疫BALB/c小鼠，在免疫第0、14、21和28天對(duì)小鼠進(jìn)行眼眶取血，用FSHR349蛋白作為抗原，ELISA檢測(cè)血清中IgG抗體特異性及抗體滴度。

利用Graphpad Prism 5對(duì)ELISA結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析后得出，在小鼠血清稀釋比例為1∶200時(shí)，檢測(cè)攜帶fshr366的病毒顆粒免疫的小鼠的血清抗體水平，發(fā)現(xiàn)在第14、21和28天的抗體水平與免疫前相比有顯著差異（P＜0.05）。空載病毒顆粒免疫的小鼠免疫14、21和28天后與免疫前相比抗體水平有顯著差異（P＜0.05），表明空載病毒顆粒對(duì)激起小鼠的體液免疫反應(yīng)有一定的影響。但免疫后14、21和28 d，實(shí)驗(yàn)組與空載病毒組相比差異顯著（P＜0.05），與培養(yǎng)基組相比差異極顯著（P＜0.01）。數(shù)據(jù)結(jié)果（圖8）表明，攜帶fshr366的病毒顆粒單次免疫BALB/c小鼠后能激起小鼠的體液免疫反應(yīng)。根據(jù)抗體滴度測(cè)定結(jié)果（圖9）顯示，實(shí)驗(yàn)組免疫后14 d和21 d抗體的滴度均為1∶1 600，在28 d時(shí)達(dá)到1∶3 200，表明此慢病毒疫苗激起早期的持續(xù)性體液免疫反應(yīng)。

圖8 ELISA檢測(cè)小鼠血清中IgG抗體水平

圖9 ELISA測(cè)定fshr366的病毒顆粒免疫28 d小鼠血清中抗體的滴度

3 討論

人類免疫缺陷病毒-1（HIV-1）來源的慢病毒載體是目前基因治療中研究較多的載體，近來在疫苗研制領(lǐng)域也顯現(xiàn)出極大的應(yīng)用潛力［14］。與通常使用的腺病毒、腺相關(guān)病毒以及逆轉(zhuǎn)錄病毒載體相比，具有感染非分裂期細(xì)胞及容納外源性目的基因片段大和免疫源性低等優(yōu)點(diǎn)。本研究針對(duì)FSHR基因構(gòu)建慢病毒載體疫苗，進(jìn)一步證明了慢病毒載體可以作為激發(fā)體液免疫反應(yīng)的有效工具。

以往基于慢病毒載體的疫苗的研究主要用于產(chǎn)生細(xì)胞免疫反應(yīng)［15-18］，作為產(chǎn)生體液免疫反應(yīng)的應(yīng)用并不多見，但 Iglesias等［19］通過構(gòu)建基于西尼羅病毒的E型包膜糖蛋白的慢病毒載體疫苗，首次研究了慢病毒疫苗激起機(jī)體特異性和保護(hù)性的體液免疫。本研究結(jié)果擴(kuò)展了慢病毒載體疫苗的應(yīng)用，更有價(jià)值的是，在本研究中我們構(gòu)建的攜帶FSHR胞外區(qū)的慢病毒載體疫苗，僅通過單次小劑量的病毒顆粒免疫小鼠便得到了持續(xù)時(shí)間達(dá)到28 d的抗體反應(yīng)，抗體滴度達(dá)到1∶3 200。這些結(jié)果與Iglesias等［19］的研究相類似，表明慢病毒載體可以激發(fā)早期、持續(xù)性的體液免疫反應(yīng)。由此顯示，慢病毒載體具有作為一種主動(dòng)免疫疫苗載體的潛能。

本實(shí)驗(yàn)所研究的靶點(diǎn)為FSHR，F(xiàn)SHR以往被認(rèn)為主要表達(dá)在生殖細(xì)胞中，其與配體FSH共同作用促進(jìn)卵巢內(nèi)卵泡的發(fā)育。但由于FSHR本身結(jié)構(gòu)的多態(tài)性及在正常組織及癌變組織中表達(dá)的差異性［20］，使得FSHR與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展有一定的聯(lián)系。Zhang等［21］通過FSH肽將抗腫瘤藥物紫杉醇靶向?qū)隖SHR陽(yáng)性的卵巢癌細(xì)胞，在體內(nèi)外獲得了顯著的抗腫瘤效應(yīng)，同樣，董俊等［22］通過FSH肽將卵巢癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的趨化因子1（CXCL1）的siRNA靶向?qū)隖SHR陽(yáng)性的卵巢癌細(xì)胞，抑制了卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移及侵襲，都證明了靶向FSHR的治療方法是可行且有效的。最近又發(fā)現(xiàn)FSHR 在多種實(shí)體瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)特異表達(dá)，這強(qiáng)烈提示FSHR可以作為腫瘤治療的一個(gè)很好的切入點(diǎn)，激起了研究人員對(duì)該蛋白新的研究興趣。Stilley等［23］發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SH與其受體結(jié)合可以促進(jìn)HUVEC細(xì)胞的血管形成作用。本研究通過構(gòu)建的攜帶FSHR的慢病毒疫苗初步證明，該疫苗可以激發(fā)持續(xù)的抗FSHR抗體，其產(chǎn)生的抗體有望阻斷腫瘤血管細(xì)胞表面FSHR與配體的結(jié)合從而可能獲得抗腫瘤效應(yīng)。關(guān)于這一部分工作需要后期進(jìn)一步的抗腫瘤動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

4 結(jié)論

本研究構(gòu)建了攜帶FSHR的慢病毒載體疫苗，單次腹腔免疫BALB/c小鼠，ELISA結(jié)果顯示在免疫28 d時(shí)抗體滴度達(dá)到1∶3 200，說明疫苗在小鼠體內(nèi)獲得了持續(xù)的體液免疫反應(yīng)。證明了慢病毒載體疫苗在激起機(jī)體體液免疫方面具有的潛在應(yīng)用價(jià)值。

［1］ Pierce JG， Parsons TF. Glycoprotein hormones：structure and function［J］. Annual Review of Biochemistry， 1981， 50（1）：465-495.

［2］任春明， 字向東， 張重慶， 等. 卵泡刺激素的研究進(jìn)展［J］. 科研前沿， 2006， 10（208）：10-13.

［3］ Simoni M， Gromoll J， Nieschlag E. The Follicle-stimulating hormone receptor：Biochemistry， molecular biology， physiology， and pathophysiology 1［J］. Endocrine Reviews， 1997， 18（6）：739-773.

［4］Li Y， Ganta S， Cheng C， et al. FSH stimulates ovarian cancer cell growth by action on growth factor variant receptor［J］. Molecular and Cellular Endocrinology， 2007， 267（1）：26-37.

［5］Parrott JA， Doraiswamy V， Kim G， et al. Expression and actions of both the follicle stimulating hormone receptor and the luteinizing hormone receptor in normal ovarian surface epithelium and ovarian cancer［J］. Molecular and Cellular Endocrinology， 2001， 172（1）：213-222.

［6］Zheng W， Lu JJ， Luo F， et al. Ovarian epithelial tumor growth promotion by follicle-stimulating hormone and inhibition of the effect by luteinizing hormone［J］. Gynecologic Oncology， 2000， 76（1）：80-88.

［7］Radu A， Pichon C， Camparo P， et al. Expression of folliclestimulating hormone receptor in tumor blood vessels［J］. New England Journal of Medicine， 2010， 363（17）：1621-1630.

［8］Stilley JA， Guan R， Duffy DM， et al. Signaling through FSH receptors on human umbilical vein endothelial cells promotes angiogenesis［J］. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism， 2014， 99（5）：E813-E820.

［9］Gartrell BA， Tsao C， Galsky MD. The follicle-stimulating hormone receptor：a novel target in genitourinary malignancies［C］// Urologic Oncology：Seminars and Original Investigations. Elsevier，2013， 31（8）：1403-1407.

［10］Ghinea N. A novel role for FSH receptor as a tumor endothelial cell marker［J］. Acta Endocrinologica（Buc）， 2010， 6（4）：507-512.

［11］柏琦， 那鑫妮， 馮姍姍. 病毒載體的發(fā)展歷程及現(xiàn)狀［J］. 中國(guó)醫(yī)藥指南， 2011， 9（23）：224-225.

［12］Palmowski MJ， Lopes L， Ikeda Y， et al. Intravenous injection of a lentiviral vector encoding NY-ESO-1 induces an effective CTL response［J］. The Journal of Immunology， 2004， 172（3）：1582-1587.

［13］李明峰， 候靜， 熊偉民. 攜帶AFP基因慢病毒載體制備并感染樹突狀細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究［J］. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志， 2009，25（9）：791-793.

［14］羅望， 張泓， 許淼， 等. 慢病毒—基因轉(zhuǎn)移的潛在新載體［J］.江蘇藥學(xué)與臨床研究， 2006， 14（6）：366-371.

［15］Esslinger C， Chapatte L， Finke D， et al. In vivo administration of a lentiviral vaccine targets DCs and induces efficient CD8（+）T cell responses［J］. J Clin Invest， 2003， 111：1673-1681.

［16］Breckpot K， Dullaers M， Bonehill A， et al. Lentivirally transduced dendritic cells as a tool for cancer immunotherapy［J］. J Gene Med， 2003， 5：654-667.

［17］Esslinger C， Romero P， MacDonald HR. Efficient transduction of dendritic cells and induction of a T-cell response by thirdgeneration lentivectors［J］. Hum Gene Ther， 2002， 13：1091-1100.

［18］Palmowski MJ， Lopes L， Ikeda Y， et al. Intravenous injection of a lentiviral vector encoding NY-ESO-1 induces an effective CTL response［J］. J Immunol， 2004， 172：1582-1587.

［19］ Iglesias MC， Frenkiel MP， Mollier K， et al. A single immunization with a minute dose of a lentiviral vector-based vaccine is highly effective at eliciting protective humoral immunity against West Nile virus［J］. The Journal of Gene Medicine， 2006， 8（3）：265-274.

［20］ Wunseh A， AhdaY， Banaz-Yasar F， et al. Single-nucleotide polymorphisms in the promoter region influence the expression of the human follicle-stimulating Hormone receptor［J］. Fertil Steril，2005， 84（2）：446-453.

［21］Zhang X， Chen J， Zheng Y， et al. Follicle-stimulating hormone peptide can facilitate paclitaxel nanoparticles to target ovarian carcinoma in vivo［J］. Cancer Research， 2009， 69（16）：6506-6514.

［22］董俊. 基于卵泡刺激素素受體介導(dǎo)的靶向治療卵巢癌實(shí)驗(yàn)研究［D］. 上海：復(fù)旦大學(xué)， 2011.

［23］ Stilley JA， Guan R， Duffy DM， et al. Signaling through FSH receptors on human umbilical vein endothelial cells promotes angiogenesis［J］. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism， 2014，99（5）：E813-E820.

（責(zé)任編輯 李楠）

Development of a Lentivirus Vector-based Vaccine Carrying Folliclestimulating Hormone Receptor and Assay of Its Immunological Effect

MA Xiao-ling LIU Hong-chun LI Jiang-wei
（Key Laboratory of Xinjiang Biological Resources and Gene Engineering，College of Life Sciences and Technology，Xinjiang University，Urumqi 830046）

This work aims to prepare lentivirus vaccine with a follicle-stimulating hormone receptor（FSHR）and investigate the immunological effect of it on mice. The gene（fshr366）of extracellular region of FSHR was cloned into lentivirus vector. The recombinant plasmids were transfected into the 239T cells by the method of lipidosome transfection，and the virus particles（Lenti-FSHR366）with target gene were produced after encapsulation. The expressions of fshr366 mRNA and FSHR366 protein in 293T cells infected by Lenti-FSHR366 were detected by RT-PCR and Western blot. For evaluating the immunological effects，BALB/c mice were intraperitoneally inoculated with single immunization of fshr366-carring virus，collecting the blood samples from the orbits of mice at day 0，14，21 and 28 after immunization，then ELISA method was used to detect the specificity of the sera from immunized mice and determine the titer of the antibody. The RE digestion and DNA sequencing results showed the gene fragment of fshr366 was successfully cloned into lentivirus vector. After transfection to 293T cells with the encapsulated lentivirus particles carrying fshr366，the detection results by RT-PCR and Western blot indicated the expression of gene fshr in the cells at transcription and protein level. The results of ELISA revealed that the humoral immune response in mice rose on day 14 after single immunization through intraperitoneally injection of lentivirus particles carrying fshr366，the titer of antibody was 1∶1 600.

follicle-stimulating hormone receptor；lentivirus vector；vaccine；humoral response

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.024

2015-09-03

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81260333），新疆自治區(qū)高技術(shù)研究發(fā)展項(xiàng)目（201110102）

馬曉玲，女，碩士研究生，研究方向：腫瘤免疫診斷和治療的分子基礎(chǔ)研究；E-mail：1239598355@qq.com

李江偉，男，教授，研究方向：腫瘤免疫診斷和治療的分子基礎(chǔ)研究；E-mail：jwli67@sina.com