microRNA-483和microRNA-486在克隆和轉(zhuǎn)fat-1基因牛組織中的表達(dá)

呂洋王煜，2孫佳佳弓春玲李光鵬

（1. 內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，呼和浩特 010070；2. 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，呼和浩特 010050）

microRNA-483和microRNA-486在克隆和轉(zhuǎn)fat-1基因牛組織中的表達(dá)

呂洋1王煜1，2孫佳佳1弓春玲1李光鵬1

（1. 內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，呼和浩特 010070；2. 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，呼和浩特 010050）

利用熒光定量PCR比較正常受精牛、克隆牛和轉(zhuǎn)基因牛的心、肝、脾、肺、腎、胎盤、子葉、子宮內(nèi)膜中miR-483和miR-486的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，miR-483和miR-486在正常受精牛、克隆牛和轉(zhuǎn)fat-1基因牛的組織中均有表達(dá)，其中在心臟中表達(dá)量顯著高于其他組織。而轉(zhuǎn)fat-1基因牛心臟中miR-483和miR-486表達(dá)量均低于正常牛。miR-483和miR-486在不同組織中表達(dá)量存在一定差異，在心臟中呈現(xiàn)高表達(dá)，提示miR-483和miR-486表達(dá)降低可能與心肌肥大、心肌梗死等病理生理過程有關(guān)。

miR-483；miR-486；轉(zhuǎn)基因牛；心臟

miRNA表達(dá)分析和功能探索在轉(zhuǎn)基因生物領(lǐng)域中已成為熱點(diǎn)問題。microRNA（miRNA）是一類內(nèi)源性的21-25 nt大小的單鏈非編碼小分子RNA，在生物體內(nèi)廣泛存在，能夠在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，與機(jī)體的生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖、疾病等活動(dòng)相關(guān)［1］。miRNA在不改變基因結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上影響基因的表達(dá)，成為表觀遺傳學(xué)的重要組成部分。目前對(duì)于miRNA 在生殖發(fā)育中的研究已逐步展開，包括對(duì)miRNA 高通量分析，特異性的組織或細(xì)胞中特定 miRNA 的表達(dá)、調(diào)控靶基因和功能研究［2］。fat-1基因來源于秀麗線蟲（Caenorhabditis elegans，C. elegans），又名ω-3多聚不飽和脂肪酸脫氫酶基因。其產(chǎn)物ω-3多聚不飽和脂肪酸脫氫酶以ω-6多聚不飽和脂肪酸（Omega-6 polyunsaturated fatty acids，ω-6 PUFAs）為底物，將其脫氫轉(zhuǎn)化為ω-3多聚不飽和脂肪酸（Omega-3 polyunsaturated fatty acids，ω-3 PUFAs）［3］，ω-3 PUFAs作為重要生物活性物質(zhì)，對(duì)人體健康尤其在預(yù)防和治療心腦血管、癌癥等多種疾病方面有著重要作用。增加膳食中ω-3 PUFAs的含量，能夠顯著減少冠心病發(fā)病率與死亡率，并且能延緩動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展［4］。本研究利用熒光定量PCR分析轉(zhuǎn)fat-1魯西黃牛、克隆牛和正常受精牛主要器官組織中miR-483和miR-486的表達(dá)情況，旨在探討miR-483和miR-486可能的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

轉(zhuǎn)fat-1基因魯西黃牛的制備：構(gòu)建fat-1基因pST200表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染牛胎兒成纖維細(xì)胞，G418篩選后挑選轉(zhuǎn)基因單克隆，核移植獲得供體細(xì)胞，得到轉(zhuǎn)基因克隆胚胎，通過胚胎移植到代孕魯西黃牛體內(nèi)，出生后經(jīng)鑒定為轉(zhuǎn)fat-1基因牛。采集3例正常受精、2例克隆、2例轉(zhuǎn)基因魯西黃牛心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胎盤、子葉、子宮內(nèi)膜組織，迅速放入液氮保存。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)內(nèi)蒙古大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 各組織總RNA的提取 將組織從-80℃取出后，用RNAiso for small RNA kit（TaKaRa）提取組織RNA，取2 μL在1%瓊脂糖凝膠電泳上檢測(cè)總RNA的質(zhì)量并利用Nanodrop測(cè)量濃度并測(cè)定總RNA的A260/A280的值在1.8-2.1之間。

1.2.2 合成cDNA 利用Primer 5.0引物設(shè)計(jì)軟件分別根據(jù)miRBase提供的miR-483和miR-486，以及內(nèi)參U6的序列設(shè)計(jì)microRNA定量引物（表1），根據(jù)One Step PrimeScript? miRNA cDNA Synthesis Kit（TaKaRa）反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA。反應(yīng)結(jié)束后產(chǎn)物保存于-20℃條件下備用。

表1 microRNA引物序列

1.2.3 microRNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR 使用 SYBR?premix Ex TaqTMⅡ（TaKaRa）檢測(cè)miR-483和miR-486在牛心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胎盤、子葉和子宮內(nèi)膜組織的表達(dá)水平，美國(guó)Bio-Rad 7300公司進(jìn)行定量PCR反應(yīng)參數(shù)為：95℃預(yù)變性30 s；95℃ 5 s，60℃ 31 s熒光檢測(cè)1次，共40循環(huán)。記錄每個(gè)反應(yīng)管中的熒光信號(hào)到達(dá)所設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)Ct值，反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)熔解曲線分析產(chǎn)物特異度，每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，分析 miR-483和 miR-486 的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 以U6 作為內(nèi)參，miRNA的相對(duì)表達(dá)水平的數(shù)值通過2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件 SPSS16.0 進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 miR-483在正常受精、克隆、轉(zhuǎn)基因魯西黃牛不同組織中的表達(dá)

miR-483在心臟中表達(dá)量最高，約為在肺臟中表達(dá)量的10倍，其次在腎臟中的表達(dá)量是肺臟中的6倍左右，在肺臟中的表達(dá)量最低（圖1）。

圖1 miR-483在牛不同組織中的表達(dá)

2.2 miR-486在正常受精、克隆、轉(zhuǎn)基因魯西黃牛不同組織中的表達(dá)

miR-486在心臟中表達(dá)量最高，約為在肝臟中表達(dá)量的13倍（P=0.021，具有顯著差異）；其次在肺臟中表達(dá)量是肝臟中表達(dá)量的2倍左右；在肝臟和子葉中表達(dá)量最低（圖2）。

2.3 miR-483和miR-486在正常受精、克隆、轉(zhuǎn)基因魯西黃牛心臟表達(dá)的比較

miR-483和miR-486在克隆牛、轉(zhuǎn)基因牛心臟中的表達(dá)要低于正常受精牛的心臟（圖3）。

圖2 miR-486在牛不同組織中的表達(dá)（a代表P＜0.05）

圖3 miR-483（A）和miR-486（B）在正常受精、克隆和轉(zhuǎn)基因魯西黃牛心臟表達(dá)（a代表P＜0.05）

3 討論

ω-3 PUFAS能提高心肌細(xì)胞的電穩(wěn)定性，而心肌細(xì)胞的電穩(wěn)定性的提高能防治心率不齊［5］，對(duì)體內(nèi)ω-6/ω-3 PUFAS比值的改變和對(duì)體內(nèi)脂代謝的調(diào)節(jié)，能有效的降低血壓、血脂［6］。武珅等［7］發(fā)現(xiàn)增加fat-1基因在體內(nèi)的表達(dá)是預(yù)防心血管硬化的有效方法。miRNA 的表達(dá)具有時(shí)序性和空間特異性，王家驥等［8］通過對(duì)靶基因進(jìn)行調(diào)節(jié)從而實(shí)現(xiàn)對(duì)動(dòng)物發(fā)育的調(diào)控。隨著研究的不斷深入，人們逐漸認(rèn)識(shí)到miRNA在進(jìn)化過程中的保守性以及在生物進(jìn)化和疾病發(fā)展過程中起著重要的調(diào)控作用，通過抑制靶基因的表達(dá)產(chǎn)生基因沉默的效應(yīng)。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，miRNA參與調(diào)控心臟病理生理過程，推測(cè) miRNA 在心肌肥大、心肌梗死中扮演重要角色［9-11］。目前，在生物體內(nèi)已鑒定出超過6 000個(gè)miRNA 分子，而在人類基因組中約30% 的基因受 miRNA調(diào)控［12］，其在心臟、肝臟及腦等不同組織中都具有特異性表達(dá)，有研究通過分析6個(gè)心衰胎兒和4個(gè)正常胎兒心臟microRNA芯片［13］，獲得110個(gè)顯著差異microRNA，其中miR-483和miR-486表達(dá)量顯著下調(diào)，推測(cè)與胎兒心衰有關(guān)。Sucharov等［14］通過對(duì)6個(gè)非心衰、5個(gè)缺血性擴(kuò)張型心臟病和5個(gè)特發(fā)性擴(kuò)張型心臟病的病人的microRNA芯片分析，也得出miR-483和miR-486在非心衰病人組中表達(dá)量顯著下調(diào)的結(jié)論，證明microRNA可能調(diào)控心肌疾病中關(guān)鍵性重編程重塑基因的表達(dá)，參與到心肌疾病中。郝艷坤等［15］篩查肥胖大鼠心臟microRNA的表達(dá)變化，尋找與肥胖誘發(fā)心肌損傷及心律失常相關(guān)的miRNA，發(fā)現(xiàn)在肥胖模型組的 miRNA 表達(dá)譜中明顯差異表達(dá)的miRNA共有 7個(gè)，其中miR-483表達(dá)下調(diào)，提示miRNA可能參與肥胖誘發(fā)心肌損傷和心律失常的調(diào)節(jié)作用。Zhang等［16］研究發(fā)現(xiàn)miR-483在懷孕和哺乳期喂養(yǎng)母體高脂肪（HF）飲食的子代中表達(dá)顯著降低。

miRNA的差異表達(dá)及對(duì)基因的調(diào)控機(jī)制已成為當(dāng)前科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。miRNA可能參與調(diào)控多個(gè)靶基因，而一個(gè)基因也可能受多個(gè)miRNA調(diào)控。從miRBase數(shù)據(jù)庫中預(yù)測(cè)出人源的miR-483 定位于胰島素樣生長(zhǎng)因子2（insulin-like growth factor 2，IGF2）的第2內(nèi)含子［17］。Zhang等［16］的研究結(jié)果提示miR-483在喂養(yǎng)高脂肪飲食的小鼠后代中表達(dá)量顯著降低，同時(shí)伴隨著IGF2 mRNA表達(dá)水平顯著提高，預(yù)示著IGF2可能是miR-483的靶基因。小鼠胎兒體重可能受IGF2基因上的多態(tài)性的影響［18］，低濃度IGF2可能涉及增重和肥胖［19］。

miR-486在哺乳動(dòng)物中是保守的，富集于心肌、骨骼肌和平滑肌中，肌肉生長(zhǎng)抑制素（Myostatin）是骨骼肌生長(zhǎng)的負(fù)調(diào)控因子，可降低肌肉中蛋白合成，Hitachi等［20］在敲除myostatin小鼠后發(fā)現(xiàn)miR-486表達(dá)水平顯著提高，證實(shí)miR-486可能是連接肌肉生長(zhǎng)抑制素信號(hào)和調(diào)控骨骼肌通路中的調(diào)控分子。Small等［21］證明同源性磷酸酶-張力蛋白（PTEN）可能是miR-486靶位點(diǎn)，PTEN是磷酸肌醇3激酶/ Akt信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控基因，后者是胰島素受體下游的主要通路，推測(cè)miR-486能在骨骼肌中調(diào)節(jié)胰島素依賴的葡萄糖攝取。本研究結(jié)果表明，miR-483和miR-486在正常受精和轉(zhuǎn)fat-1基因牛心臟中差異表達(dá)，提示其表達(dá)變化可能與fat-1表達(dá)有關(guān)。

4 結(jié)論

通過檢測(cè)miR-483和miR-486在正常受精、克隆、轉(zhuǎn)fat-1基因魯西黃牛不同組織中的相對(duì)表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)miR-483和miR-486在正常受精牛、克隆牛和轉(zhuǎn)fat-1基因牛的組織中均有表達(dá)，其中在心臟中表達(dá)量顯著高于其他組織。而轉(zhuǎn)基因牛心臟中miR-483和miR-486表達(dá)量均低于正常受精牛。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Expression of microRNA-483 and microRNA-486 in the Cloned and fat-1-transgenic Bovine

Lü Yang1WANG Yu1，2SUN Jia-jia1GONG Chun-ling1LI Guang-peng1
（1. Research Center for Laboratory Animal Science，Inner Mongolia University，Hohhot 010070；2. The Affiliated Hospital，Inner Mongolia University，Hohhot 010050）

The expression levels of microRNA-483 and microRNA-486 in heart，liver，spleen，lung，kidney，placenta，cotyledons，endometrium from normal，cloned，and transgenic bovine were measured by real time quantitative PCR. The results showed that microRNA-483 and microRNA-486 were expressed in all tissues of normal，cloned and fat-1-transgenic bovine；significantly higher in the heart than other tissues. However，the expression levels of microRNA-483 and microRNA-486 in transgenic bovine were lower than normal one. Further，the expressions of microRNA-483 and microRNA-486 varied in different tissues and high in the heart，indicating that the expressions of microRNA-483 and microRNA-486 may be correlated with pathophysiological process of myocardial hypertrophy and myocardial infarction.

microRNA-483；microRNA-486；transgenic bovine；heart

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.017

2015-06-12

國(guó)家基礎(chǔ)研究計(jì)劃（2012CB722306）；國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201410126034）

呂洋，男，博士研究生，研究方向：哺乳動(dòng)物生殖生物學(xué)；E-mail：lvyang678762006@163.com

李光鵬，男，教授，研究方向：哺乳動(dòng)物生殖生物學(xué)、胚胎生物技術(shù)；E-mail：gpengli@imu.edu.cn