香菇多糖增強黃瓜幼苗對炭疽病菌抗性機理

張文華

（包頭輕工職業(yè)技術學院，包頭 014030）

香菇多糖增強黃瓜幼苗對炭疽病菌抗性機理

張文華

（包頭輕工職業(yè)技術學院，包頭 014030）

旨在考察香菇多糖誘導黃瓜（Cucumis sativus L. cv. Jinfeng）幼苗葉片細胞產生防御響應的效果。經0.75 g/L香菇多糖處理后，葉片胞內H2O2和水楊酸濃度迅速增加，分別在10 min和4 h達到峰值，隨后均逐漸下降至誘導前水平。經香菇多糖誘導后，胞內抗性相關蛋白β-1，3-葡聚糖酶、幾丁質酶和苯丙氨酸氨解酶比活性均顯著增加，96 h后酶活力仍然保持較高水平。進一步研究發(fā)現，經香菇多糖誘導后，黃瓜對炭疽病菌（Colletotrichum orbiculare）抗性明顯增強。經2.00 g/L香菇多糖處理后，葉片菌斑面積和數量分別顯著下降至對照水平的53.1%和51.3%，結果表明香菇多糖具有誘導黃瓜細胞產生防御響應的作用。

香菇多糖；黃瓜；防御響應；炭疽病菌

黃瓜（Cucumis sativus L.）是一種世界范圍內廣泛種植的重要經濟作物，但是其產量易受病原微生物如炭疽病菌（Colletotrichum orbiculare）的影響而下降。盡管化學殺菌劑可以有效緩解病害損失，但是農藥的大量使用加重了社會和生態(tài)負擔。

采用誘導劑激活植物細胞防御響應以抵抗病原微生物侵染是一種較為理想的方法［1］。細胞防御響應包含一系列的級聯(lián)過程，包括活性氧粒子的積累、信號分子濃度增加、苯丙素途徑強化以及病程相關蛋白的生成［2，3］。病程相關蛋白包含多種蛋白酶抑制劑及水解酶作用于外源微生物而起到防御作用。苯丙素類物質除激活信號傳導以外，還能夠改變植物細胞壁結構以起到屏障作用［4］。

研究表明，β-葡聚糖能夠激活多種植物的防御響應。如昆布多糖和熱凝膠寡糖分別被證實能夠對煙草和馬鈴薯產生誘導作用［5，6］。香菇多糖（Len-tinan，Ltn）是一種線性β-1，3-葡聚糖，具有潛在的激活植物防御響應的活性，但是其對黃瓜細胞是否具有誘導活性仍需要進一步研究。綜上所述，本研究通過對黃瓜葉片細胞內信號分子濃度以及關鍵酶活性的測定，結合黃瓜對炭疽病菌抗性效果統(tǒng)計結果，對香菇多糖誘導黃瓜細胞防御響應的效果進行考察，旨在為黃瓜病害的生態(tài)防治提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 黃瓜和菌種 黃瓜植株（C. sativus L. cv. Jinfeng）于無菌溫室中培養(yǎng)（培養(yǎng)溫度25℃，光照周期16 h/d）。炭疽病菌（C. orbiculare）購自廣東菌種保藏中心（廣州），菌種培養(yǎng)及孢子收集參照Zhang等［7］的方法。

1.1.2 試劑 香菇多糖，藍色幾丁質（Chitin azure），反式肉桂酸，水楊酸購自Sigma公司（美國）；其余試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司（上海）。

1.1.3 儀器 液相色譜儀Hitachi CM5000 HPLC system（日本）；離心機Sigma 2K5S（美國）。

1.2 方法

1.2.1 不同濃度香菇多糖對炭疽病菌侵染黃瓜幼苗的抑制 分別以0.25、0.75和2.00 g/L香菇多糖溶液均勻噴撒黃瓜幼苗葉片表面，以無菌去離子水作為空白對照（CK）。噴灑24 h后，以濃度為107孢子/mL C. orbiculare孢子懸液均勻噴灑葉片表面。培養(yǎng)168 h后對葉片病斑數量和病斑面積進行統(tǒng)計。每種處理采用10株馬鈴薯幼苗，所有植株培養(yǎng)條件一致。

1.2.2 香菇多糖對黃瓜的誘抗作用機理

1.2.2.1 黃瓜葉片處理與取樣 以0.75 g/L香菇多糖溶液噴撒培養(yǎng)6周的黃瓜幼苗葉片表面，以無菌去離子水作為空白對照（CK）。然后，分別于噴灑后剪取葉片用于胞內H2O2和水楊酸（salicylic acid，SA）濃度測定或胞內β-1，3-葡聚糖酶、幾丁質酶和苯丙氨酸氨解酶（phenylalanine ammonia lyase，PAL）比酶活測定。每項指標測定均采用不同植株的葉片進行3次重復。

1.2.2.2 各種誘抗物質測定方法 （1）葉片胞內H2O2和水楊酸濃度測定：H2O2與SA的提取及濃度測定分別采用Li等［8］和van Spronsen等［9］報道的方法。（2）胞內蛋白提取方法：稱取200 mg黃瓜葉片并迅速于液氮中研磨成粉末，隨后加入1.0 mL蛋白提取溶液（含有50 mmol/L乙酸鈉緩沖液，5 mmol/L EDTA，2 mmol/L DTT，0.04% 硫代硫酸鈉，0.1%聚乙烯吡咯烷酮，pH5.5）并于4℃震蕩溶解10 min。然后將混合液于4℃，10 000×g離心30 min并收集上清，于-20℃保存。（3）β-1，3-葡聚糖酶活力測定：測定反應體系包含200 μL 10 g/L昆布多糖溶液（溶于50 mmol/L乙酸鈉緩沖液，pH5.0），200 μL 50 mmol/L乙酸鈉緩沖液（pH5.0）和100 μL蛋白提取液。該反應體系于37℃反應2 h，隨后沸水浴10 min終止反應。反應體系中加入預先滅活的蛋白提取液作為空白對照。反應體系中每1 min生成1 μg還原糖的酶量定義為1酶活單位（1 U）。（4）幾丁質酶活力測定：幾丁質酶活力測定采用Ippolito等［10］報道的方法。反應體系包含140 μL 25 g/L藍色幾丁質溶液（溶于50 mmol/L乙酸鈉緩沖液，pH5.0）和70 μL蛋白提取液。該反應體系于37℃反應2 h，隨后加入100 μL 2 mol/L HCl終止反應。（5）苯丙氨酸氨解酶活力測定：PAL活力測定采用Wang等［11］報道的方法。反應體系包含500 μL 20 mmol/L L-苯丙氨酸（溶于50 mmol/L Tris-HCl緩沖液，pH8.5），400 μL 50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH8.5）和100 μL蛋白提取液。該反應體系于37℃反應2 h，隨后加入200 μL 6 mol/L HCl終止反應。

1.2.3 統(tǒng)計方法 數據統(tǒng)計采用SPSS統(tǒng)計軟件（V-er. 18.0，SPSS Inc.，美國）。單因素方差分析（one-way ANOVA）用于各測定指標不同處理組之間的比較。最小顯著差數法（least significant difference，LSD）用于測定指標間顯著性分析（顯著性水平P＜0.05）。

2 結果

2.1 香菇多糖提高黃瓜對炭疽病菌的抗性

三種濃度的Ltn溶液處理黃瓜葉片后對葉片上炭疽病菌侵染形成的菌斑數量和菌斑面積進行統(tǒng)計，結果表明經Ltn處理后黃瓜植株對炭疽病抗性明顯增加，并且抗性效果隨著Ltn濃度增加而逐漸增強。Ltn濃度達到0.75 g/L后，葉片感染面積和病變數量與對照組相比均顯著性下降，而Ltn濃度提高至2.00 g/L時，與對照組相比抗性效力接近50%，表現出較為理想的效果。

表1 香菇多糖誘導黃瓜葉片對炭疽病的抗性效果

2.2 香菇多糖濃度對誘抗效果的影響

采用Ltn處理黃瓜葉片24 h后，胞內SA濃度隨著Ltn濃度提高而迅速增加（圖1）。采用0.75 g/L Ltn處理葉片后，胞內SA達到1.785 μg/g，而繼續(xù)提高Ltn濃度，胞內SA水平保持穩(wěn)定。結果表明，Ltn濃度0.75 g/L是達到穩(wěn)定誘導效果的臨界水平，后續(xù)實驗均在此水平條件下進行。

圖1 香菇多糖處理黃瓜葉片24 h后胞內水楊酸濃度變化

2.3 香菇多糖提高黃瓜胞內信號分子濃度

測定經Ltn誘導后黃瓜葉片細胞內H2O2和SA濃度變化趨勢。結果（圖2）顯示，經Ltn誘導后胞內H2O2濃度急劇升高，至10 min后達到峰值，隨后迅速下降。盡管誘導30 min后H2O2濃度仍高于誘導前水平但是兩者之間無顯著性差異。60 min后胞內H2O2濃度恢復至誘導前水平。胞內SA濃度變化趨勢與H2O2類似。胞內SA水平迅速增加至誘導4 h后達到峰值，隨后逐漸下降至120 h后恢復至誘導前水平。

圖2 香菇多糖處理后黃瓜葉片胞內H2O2（A）和水楊酸（B）濃度變化曲線

2.4 香菇寡糖增強黃瓜胞內抗性蛋白比活性

由圖3可知，與空白對照（CK）相比，經0.75 g/L Ltn處理24 h后胞內β-1，3-葡聚糖酶比酶活顯著增加至115 U/mg，誘導96 h后酶活下降至89 U/mg，但是仍顯著高于CK水平。另一方面，經炭疽病菌（CO）處理后，胞內β-1，3-葡聚糖酶的酶活水平同樣出現了顯著上升，但低于Ltn處理組的水平。經Ltn和CO聯(lián)合處理（Ltn+CO）的葉片胞內酶活與Ltn組處于同一水平。結果表明，Ltn處理能夠模擬炭疽病菌的侵染作用而提高胞內β-1，3-葡聚糖酶的比酶活，且在96 h后仍然處于較高水平。測定表明，Ltn、CO和Ltn+CO組胞內幾丁質酶活性相比于對照組均有了顯著增加，且3種處理方式間并無顯著性差異。該結果與β-1，3-葡聚糖酶測定結果一致，即Ltn能夠誘導胞內病程相關蛋白的表達。分別經Ltn和CO處理后，黃瓜葉片胞內PAL活性均產生了顯著的增加，且96 h后仍然保持較高活性。該結果與β-1，3-葡聚糖酶和幾丁質酶測定結果一致。

圖3 處理方式對黃瓜葉片胞內β-1，3-葡聚糖酶（A）、幾丁質酶（B）和苯丙氨酸氨解酶（C）活力測定影響

3 討論

水楊酸（SA）作為胞內信號分子在植物組織建立系統(tǒng)性的防御響應過程中起到關鍵作用［12，13］。因此，以胞內SA積累濃度作為評價指標考察了香菇多糖（Ltn）濃度對黃瓜葉片組織誘抗效果的影響。植物細胞膜表面受體識別到誘導子后迅速激活氧代謝爆發(fā)產生活性氧中間體（ROI），如O2-和H2O2，并進一步激活依賴ROI的防御響應二級信使水楊酸和防御相關基因的表達以及抗菌代謝產物的合成［3，14］。因此，胞內信號分子H2O2和SA積累水平產生顯著變化是確定細胞防御響應發(fā)生的關鍵指標。另一方面，胞內一級和二級信號分子H2O2和SA，濃度分別在10 min和4 h時達到最高水平，表明胞內信號放大存在一定的時間滯后效應，該現象與前述研究結果一致［5，15］。胞內SA濃度在4-96 h均顯著高于誘導前水平，表明Ltn處理能夠在較長時間內對黃瓜葉片細胞的防御響應產生誘導作用。

為進一步驗證Ltn對黃瓜細胞防御抗性的誘導作用，本研究考察了經Ltn處理后胞內3種與防御相關的典型蛋白的酶活性的變化情況。葡聚糖酶因能夠水解致病性真菌細胞壁的主要組分β-1，3-葡聚糖而具有較高的抗真菌活性，屬于病程相關蛋白PR-2家族［16］。同時，β-1，3-葡聚糖水解后的寡糖能夠進一步作為誘導子強化植物的防御響應［17］。幾丁質酶屬于病程相關蛋白PR-3、-4、-8和-11家族［16］，作用于病原菌細胞壁以保護植物自身組織［18］。苯丙氨酸氨解酶（PAL）催化L-苯丙氨酸脫氨基生成反式-肉桂酸，是苯丙素途徑的關鍵酶［19］。而苯丙素途徑的產物和中間物除作為物理和化學屏障以防御病原菌侵染外，還能夠激活局部信號通路以強化誘導基因的表達［4］。因此，PAL活性是評價植物防御響應的重要指標。分析表明，香菇多糖處理能夠顯著激活黃瓜胞內抗性相關蛋白的活性。

測定結果表明，Ltn處理能夠顯著提高黃瓜葉片胞內信號分子濃度，同時對細胞防御響應相關蛋白的表達產生顯著促進作用。采用Ltn處理黃瓜葉片后，胞內防御相關蛋白的表達與經炭疽病菌處理組具有相同水平。由此可知，預先采用Ltn處理黃瓜葉片具有增強植物防御炭疽病菌侵染的潛在作用。而炭疽病菌侵染實驗表明，經Ltn處理后葉片感染面積和病變數量與對照組相比均顯著性下降。

4 結論

香菇多糖Ltn處理能夠顯著提高黃瓜葉片胞內信號分子濃度，對細胞防御響應產生激活作用，能夠顯著激活黃瓜胞內抗性相關蛋白的活性，并能顯著降低葉片被病原菌感染面積和病變數量。由上可知，香菇多糖預處理明顯提高黃瓜對炭疽病菌的抗性。作為一種環(huán)境安全性的生物多糖，香菇多糖具有發(fā)展成環(huán)境友好型生物農藥的潛力，進一步拓展了其應用范圍。

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（責任編輯 馬鑫）

The Mechanism of Lentinan Enhancing the Resistance of Cucumber Seedlings to Colletotrichum orbiculare

ZHANG Wen-hua
（Baotou Light Industry Vocational Technical College，Baotou 014030）

This study is to investigate the inducing effect of lentinan on the defense responses of cucumber（Cucumis sativus L. cv. Jinfeng）seedling leaves. The seedlings were treated with 0.75 g/L of lentinan. The concentration of H2O2and salicylic acid in cells of leaves increased rapidly and reached the peak levels at 10 min and 4 h，respectively. Afterwards，the levels of both H2O2and salicylic acid gradually declined to the ones before treatment. Moreover，the activities of defense related proteins，including β-1，3-glucanase，chitinase，and phenylalanine ammonia lyase，significantly increased after lentinan induction，and still kept stable after 96 hours. In addition，the resistance of cucumber treated with lentinan to Colletotrichum orbiculare was notably enhanced after lentinan induction. Both the number and area of lesions on cucumber leaves significantly decreased to 53.1% and 51.3% in comparison with the control，respectively，which indicated that lentinan played a role in inducing the defense responses of cucumber cells.

lentinan；Cucumis sativus L. cv. Jinfeng；defense response；Colletotrichum orbiculare

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.015

2015-06-09

張文華，女，講師，研究方向：微生物技術與應用；E-mail：1072418227@qq.com