酶法合成RNA的相關技術研究進展

王靜 潘孝明 劉宇 梁興國

（中國海洋大學食品科學與工程學院，青島 266003）

酶法合成RNA的相關技術研究進展

王靜 潘孝明 劉宇 梁興國

（中國海洋大學食品科學與工程學院，青島 266003）

近些年來RNA相關研究發(fā)展迅速，從質和量兩方面對RNA合成技術提出了更高的要求。RNA合成方法包括化學合成和酶法合成兩種。目前已商業(yè)化的RNA化學合成法能夠實現長度小于90個堿基的RNA合成，但合成費用相對較高，使許多研究難以展開。相對于化學合成，酶法合成具有效率高、條件溫和的特性，能夠合成長序列，是一種高效、低耗的RNA合成方案。酶法合成的技術流程包括轉錄和加工兩步，其中轉錄的模型主要分為線性轉錄和滾環(huán)轉錄兩種，不同的模型產生的初始轉錄產物特性不同，需要采用相應的加工方式對其進行處理才能獲得準確的目的RNA產物。近年來研究者們不斷地研究探索RNA的酶法合成，發(fā)現并構建了多種轉錄模型和初始轉錄物的加工方案，將從酶法合成RNA的轉錄模型和加工技術的原理、特點和問題等方面進行概述，以期為后續(xù)酶法合成RNA的進一步研究和選擇性應用提供參考。

RNA；酶法合成；線性轉錄；滾環(huán)轉錄；特異位點剪切

隨著生物化學與分子生物技術的快速發(fā)展，RNA的生物功能被越來越多地發(fā)現與報道，如microRNA（miRNA）［1，2］、small interfering RNA（siRNA）［3，4］和nanostructure RNA［5，6］等幾類RNA的研究均取得了突破性進展。同時，大量開展RNA相關研究從質和量兩方面對RNA的合成技術提出了更高的要求。

RNA材料的合成方式包括化學合成和酶法合成兩種。RNA的化學合成是按照3'→5'磷酸二酯鍵的方向依次連接核苷酸，需采用特定的化學試劑對相應的基團進行適當的加保護和去保護來完成。核酸化學合成起始于20世紀前期［7］，并已在30年前實現了自動化，可滿足長度小于90個堿基的RNA合成。此外，化學合成可以實現RNA的化學修飾，目前仍是一種廣泛應用的RNA合成方法。但由于核糖核苷糖環(huán)的2'-OH和3'-OH反應活性近似，導致特定官能團加保護和脫保護困難［8］，合成收率隨序列長度增加而顯著降低［9］。另外，由于化學合成需要采用固相合成法，合成規(guī)模難以擴大，無法滿足核酸類藥物的研發(fā)與制備要求，許多報道也提出當前化學合成技術不能滿足快速增長的RNA研究的需求［10，11］。

酶法合成RNA是在RNA聚合酶（RNA polymerase，RNAP）體外轉錄基礎上建立的生物制備方法，現已建立了多種模型［12-14］。相對于化學合成的固相合成模式，酶法合成更易于實現較大規(guī)模生產，適合進行一些核酸類藥物的生產，是一種發(fā)展前景良好的RNA合成方法［9，15］。但酶法合成一般較難實現RNA的修飾，仍然有許多技術問題需要解決。深入了解RNA酶法合成相關技術的原理和特性，將有助于上述問題的解決。到目前為止，國內外期刊鮮有酶法合成RNA的相關綜述報道。本文就RNA酶法合成的轉錄模型和加工技術的機制、設計和特點等方面進行概述，以期為后續(xù)RNA酶法合成的研究及其應用范圍的拓展提供參考。

1 RNA酶法合成簡介

酶法合成RNA的制備流程包括轉錄和加工兩個核心部分，轉錄過程要求合成多拷貝，加工過程要求終產物序列同所需的序列完全一致。轉錄是酶法合成的基礎，具有效率高、反應條件溫和的特點，所使用的RNA聚合酶主要包括T7和SP6兩種噬菌體RNA聚合酶。在DNA雙鏈模板轉錄模型中，這兩種RNA酶識別各自的啟動子，在最適條件下可以獲得相對DNA模板幾百倍甚至幾千倍的RNA轉錄產物［12，15］。但高效的轉錄要求起始轉錄的前三位堿基富含嘌呤，特別是+1位必須是鳥嘌呤［16］。T7和SP6 RNA聚合酶還會在完成模板編碼的轉錄產物合成后繼續(xù)在其3'端添加1-3 nt任意堿基，造成產物3'端異質［13］。不同的轉錄模型形成的初始轉錄物不同，線性轉錄模型產生的是模板編碼的RNA產物單體；滾環(huán)模型產生的是模板編碼的RNA首尾串聯而成的聚合物。因此，要得到目的產物，兩種模型轉錄初始產物都需要在后續(xù)加工過程中通過特異性水解酶對其進行切割。本綜述分別從轉錄和加工兩個方面分別進行論述。

2 RNA酶法合成中的轉錄模型

2.1 線性轉錄模型

根據轉錄模板的類型，轉錄大致可以分為線性轉錄和滾環(huán)轉錄兩種，它們具有不同的啟動子依賴性、轉錄效率、特性及問題［12-14］。線性轉錄模型是指以線性的DNA單鏈或雙鏈為模板進行轉錄，根據模型中啟動子的存在與否，又可以分為啟動子-線性轉錄模型和無啟動子-線性轉錄模型兩類。

最早的啟動子-線性轉錄模型由Melton等［12］在1984年構建，該模型在SP6 RNA聚合酶的作用下能夠轉錄100-6 000個堿基長度的RNA。隨著分子生物技術的進步，該方法也得到改進和完善，成為一種常規(guī)的轉錄方案，具體的技術方案如圖1所示：（1）將用于轉錄的雙鏈模板插入到載體的多克隆位點，要求插入片段連接在相應啟動子的下游和相應酶切位點之間；（2）重組質粒轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞，測序鑒定篩選陽性克隆，提取陽性克隆的重組質粒；（3）采用限制性內切酶在插入片段的下游切割，使載體線性化；（4）采用T7或SP6 RNA聚合酶進行轉錄［17-19］。對于雙鏈RNA的制備可以通過將轉錄模板插入雙反向的啟動子之間和特異酶切位點之間，進行兩向的線性轉錄而實現。2013年，Rouhana等［20］采用該方法制備了雙鏈RNA，并以此作為材料對渦蟲進行RNAi研究。以質粒構建的啟動子-線性轉錄模型已經廣泛應用在許多轉錄或基因表達的相關研究中［21-23］，一般涉及的RNA產物較長，對產物末端準確性要求不高，不需要后續(xù)的加工處理即可使用。

1987年，Milligan等［13］直接用化學合成的兩條分別含有啟動子信息和模板信息的DNA鏈經退火形成雙鏈模板（圖2-A），轉錄合成12-35 nt的RNA，通過優(yōu)化轉錄條件最終能夠獲得毫克級的產物。由于該方法不需要載體的構建和轉化等繁瑣的操作，所以簡單易行，被廣泛應用于相對較短的RNA序列的制備［24，25］。

圖1 質粒構建啟動子-雙鏈轉錄模型的轉錄流程

Milligan等［13］還嘗試構建了一種截短型啟動子-線性轉錄模型（圖2-B），其非模板鏈只含有T7 RNA聚合酶啟動子-17 - +1位的堿基，而模板鏈與非截短型的（圖2-A）相同。結果發(fā)現截短型能夠形成與非截短型雙鏈模板同樣的RNA產物，并且截短的非模板鏈去除-17 - -14和-4 - +2位一個或數個堿基后仍然可以發(fā)生轉錄。2002年，Donzé和Picard借助該模型建立了一個酶法合成siRNA的方案，并成功地運用到哺乳動物細胞RNAi的研究中［26］。2012年，Cheong等［27］聯合該轉錄模型和DNA-親和色譜建立了一種快速制備RNA樣品的方法，合成的RNA可以滿足X-射線、NMR等分析要求。令人意外的是，Sharmeen和Taylor［28］發(fā)現了兩種無啟動子轉錄模型。其中一種是引物模型（圖2-C），由一條短鏈DNA于模板鏈的3'端退火，在完全無啟動子的情況下引發(fā)轉錄。另一種是無啟動子且無引物的單鏈DNA模板轉錄模型（圖2-D），令人費解的是既沒有啟動子又沒有引物的情況下，SP6 RNA聚合酶能夠僅以一條單鏈DNA寡核苷酸鏈為模板進行轉錄，并產生與DNA寡核苷酸鏈相同大小的RNA。但是這種模型的合成效率顯著降低。1988年，Krupp［29］采用不同序列的寡核苷酸鏈實驗該模型的轉錄特性發(fā)現，這種轉錄可能會引發(fā)許多異質產物的產生，不能保證從同一位點起始轉錄。由此可以看出，在啟動子存在的情況下，RNA聚合酶會以啟動子轉錄的機制為主導，而在啟動子缺失的情況下，RNA聚合酶可能是識別DNA的二級結構起始轉錄信號，并以較低的效率完成之后的轉錄［30，31］。

圖2 幾種線性轉錄模型

此外，Milligan等［13］在研究中發(fā)現了T7 RNA聚合酶轉錄產物存在3'端異質的問題，這個缺陷極大影響了酶法合成在RNA合成方面的應用。早期Moran等報道提出DNA模板中引入不能與NTP形成堿基配對的核苷類似物修飾，可能誘導轉錄在核苷類似物之前終止。他們研究了3種類似物：4-甲基吲哚 β-脫氧核糖核苷（4-methylindole β-deoxynucleoside）、1-萘基 α-脫氧核糖核苷（1-naphthyl α-deoxynucleoside）和1-芘基 α-脫氧核糖核苷（1-pyrenyl α-deoxynucleoside），結果只有4-甲基吲哚β-脫氧核糖核苷在一定程度有所改善，但仍未完全抑制產物異質［24］。1999年，Kao等［32，33］發(fā)現DNA模板鏈的5'端兩個堿基進行氧甲基化修飾能夠明顯降低未端含單個多余堿基的轉錄產物的產生，但是對含兩個多余堿基的產物沒有改善。而Sherlin等［34］酶法合成tRNA時對模板鏈5'端兩個堿基進行2'-O-甲基化修飾，獲得可用于X-射線晶體分析的RNA樣品?？梢?，對線性轉錄模型的模板適當修飾可以使初始轉錄物更接近準確產物，降低后續(xù)加工的壓力。

2.2 滾環(huán)轉錄模型

1989年，Krupp［12］發(fā)現一種SP6和T7 RNA聚合酶的新型轉錄模型，即滾環(huán)轉錄（Rolling circle transcription，RCT）（圖3-A）。該模型以一種單鏈未成環(huán)的DNA（5'-GCATATTTTAAAGTAATATCGTCCA-3'）為轉錄模板，自其3'端第一個C起始轉錄，到達5'末端后并未終止，而是以DNA的3'端為模板繼續(xù)轉錄，形成繞環(huán)，這是滾環(huán)轉錄的最初模型。猜測可能的機制是鏈內部分氫鍵作用拉近了模板鏈3'末端與5'末端，形成一個近似的連接端和單鏈環(huán)。1995年，Daubendiek等［35］報道了一類化學合成的單鏈環(huán)狀DNA模板的轉錄模型，圖3-B所示為其最初所用的34 nt DNA環(huán)狀模板，該模板環(huán)內無連續(xù)互補序列，幾乎不可能形成雙螺旋的二級結構，最終能夠合成12-260次繞環(huán)的轉錄產物。之后，該研究團隊探索了不同大小（63 nt/73 nt/83 nt）的環(huán)狀DNA，發(fā)現它們均能夠實現轉錄［31，36］。值得注意的是，這些轉錄的模板都沒有啟動子序列。關于單環(huán)模板的轉錄起始機制尚無定論，猜測在缺失啟動子的情況下，雙鏈上的突環(huán)、泡狀結構（bubble）、缺口（gap）和發(fā)卡（hairpin）結構都有可能引發(fā)轉錄的起始［30，37，38］，DNA單環(huán)的構型如何引發(fā)RNA聚合酶起始轉錄還需進一步研究。研究者已將該方法成功地應用到RNA ladder的制作、納米環(huán)載體的構建以及具有催化活性的RNA合成等方面［31，36，39］。2015年，Wang等［40］建立了一種基于滾環(huán)模型的RNA合成方法——滾環(huán)轉錄-特異位點斷聯法（RCT-site-specific disconnection）（圖3-C），該方法以目的RNA的互補DNA鏈為模板，首先以T4 DNA連接酶聯合一條短鏈DNA splint將模板鏈連接成環(huán)，并同時以該splint為引物引發(fā)高效率的滾環(huán)轉錄，合成的初始RNA產物是目的RNA的多串聯產物，然后經后續(xù)特異位點切割處理，形成最終產物。

圖3 滾環(huán)轉錄模型

3 初始轉錄物的加工技術

不同的轉錄模型產生的初始轉錄物特性不同。對于啟動子-線性轉錄模型，由于其具有轉錄起始5'端富嘌呤依賴性和3'端產物異質性，往往對模板進行加長設計，轉錄后形成5'和3'端附含有外序列的初始RNA產物，需將這些多余的序列切除。對于滾環(huán)模型，它的初始轉錄產物是目標RNA的串聯產物，需要在RNA單體首尾連接處進行特異位點剪切。所以，大部分初始轉錄物需用ribozyme、DNAzyme和RNase H等進行酶切處理，以獲得準確的RNA產物。

3.1 Ribozyme 特異位點酶切

Ribozyme在酶法合成RNA研究中的應用相對較多。Wich?acz［41］小組為了解決轉錄終產物3'異質的問題，設計的模板鏈5'端比目的產物長7 nt，采用trans-acting antigenomic delata ribozyme識別并剪切掉這7 nt多余序列。Price等［42］在轉錄產物序列前后分別設計了一個hammerhead ribozyme，能夠對轉錄產物兩端分別進行自剪切，從而獲得準確的RNA產物，并應用到RNA-蛋白復合體的結晶分析。Walker［43］小組在啟動子-線性轉錄模型的基礎之上，構建了一個可常規(guī)應用的質粒載體，在目的模板的上下游分別插入一個hammerhead ribozyme和一個hepatitis delta virus ribozyme相對應的模板，初始轉錄產物左右兩端的ribozyme分別發(fā)揮自剪切功能，形成所需的RNA產物。這種方法需要的模板較長，設計時需考慮較多，不適于大宗的RNA生產。更有意思的是，Daubendiek等［31］在滾環(huán)轉錄模型的應用中將ribozyme設計到環(huán)形DNA模板中，獲得的串聯轉錄物中的ribozyme能夠進行特異位點自剪切而形成ribozyme的單體。

3.2 DNAzyme特異位點酶切

同ribozyme類似，DNAzyme也可以進行特異性剪切。DNAzyme的序列組成包括一個活性中心和兩條用于識別底物的結合臂。目前應用于RNA加工處理較多的是8-17和10-23 DNAzyme兩種［44-47］。Sohail等［48］用8-17 DNAzyme定點剪切初始轉錄物5'端多余序列，獲得的目的siRNA可成功用于MDAMB-231人類乳腺癌細胞I型胰島素樣生長因子受體（IGF1R）mRNA的RNAi研究。Cheong等［27］借助于DNA親和色譜建立了一種制備RNA樣品的方法，即轉錄后得到的初始轉錄物相對于目的產物序列3'端含有一段多余序列，這段多余序列是與親和色譜柱結合的親和標簽，經過親和分離純化后采用10-23 DNAzyme對其剪切加工，再經DNase I水解10-23 DNAzyme獲得目的RNA產物。但是，DNAzyme的剪切特性具有序列偏好性且剪切效率差異較大，譬如10-23 DNAzyme偏好剪切5'-嘌呤-嘧啶-3'之間的磷酸二酯鍵（5'…R↓Y…3'，R=A或G，Y=U或C，其中R不形成堿基配對，Y必須與10-23 DNAzyme形成堿基配對），而8-17 DNAzyme主要識別5'…A↓G…3'，斷裂A與G之間的磷酸二酯鍵［49］。所以核酶特異位點剪切的加工方法在通用性上有其局限性。

3.3 RNase H 特異位點酶切

目前為止，還沒有發(fā)現能夠識別RNA序列的限制性內切酶。RNase H是一類核酸內切酶，能夠水解RNA-DNA雜合子中RNA的磷酸二酯鍵，而不水解雙鏈RNA或單鏈RNA。而1987年，Inoue等［50］發(fā)現RNase H能識別雙鏈RNA-DNA雜合子中3個連續(xù)2'-O-甲基化修飾的核苷酸和連續(xù)4個無修飾的核苷酸的序列，從而只切割2'-O-甲基化修飾和無修飾核苷酸之間的磷酸二酯鍵。之后，氧甲基化修飾的DNA被應用于輔助RNase H特異位點剪切，包括RNA轉錄產物的加工處理中［51］。Miller等［52］設計轉錄了一個3'端加長25 nt序列的初始tRNALys，3產物，采用氧甲基化修飾的DNA輔助RNase H對其進行特異酶切，結果證明該方法酶切的產物與化學合成的tRNALys，3大小一致。Wang等［40］對該技術中DNA氧甲基化修飾的參數進行了優(yōu)化，結合滾環(huán)轉錄和RNase H的特異位點酶切實現了miRNA的準確合成，可得到DNA模板4×103倍以上的miRNA，是目前最具潛力的酶法合成RNA方案之一。

4 結語

高效、準確的RNA合成方式是RNA相關研究的基礎和根本，目前已有的轉錄和加工技術已經能夠合成準確的RNA材料，研究者可根據研究需求選擇合適的合成方案。相對于化學合成法，酶法合成具有技術門檻低、成本低和反應條件溫和等優(yōu)勢，然而，在特殊堿基修飾和序列通用性兩個方面仍難以滿足研究需求。就目前而言，對于特定堿基的基團修飾基本上只能依賴于化學合成，酶法合成難以實現。酶法合成的通用性相對較低，主要原因在于不同目的RNA的轉錄起始效率和剪切效率都因序列位點不同而存在較大差異，需要有針對性地進行設計和優(yōu)化，對于多種RNA的合成負擔相對較大。因此，應針對轉錄和加工過程中的序列反應特性進一步研究。

此外，由于酶法合成需要進行加工處理才能獲得準確的RNA產物，相對增加了制備的成本和產物降解的風險，根本問題還是在于T7和SP6 RNA聚合酶的轉錄特性。2007年，科學家們對一種海洋藍細菌的噬藍藻體Syn5進行基因組測序、蛋白結構分析［53，54］，成功純化獲得Syn5 RNA聚合酶，2013年報道發(fā)現該聚合酶具有較顯著的轉錄優(yōu)勢：（1）對轉錄初始堿基富嘌呤的偏好性明顯低于T7 RNA聚合酶；（2）不具有在準確轉錄產物3'端添加任意堿基的能力，能夠形成準確的轉錄物［55，56］。這無疑是一項重要的發(fā)現，但仍需對其轉錄的準確性進一步驗證。在酶法合成方面，分子技術仍有可能繼續(xù)改進其高效性和準確性，所以期待更為高效、低耗的酶法合成技術為RNA合成提供新途徑，使RNA相關研究得以更廣泛地展開。

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（責任編輯 狄艷紅）

Research Progress on Enzymatic Synthesis of RNA

WANG Jing PAN Xiao-ming LIU Yu LIANG Xing-guo
（College of Food Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao 266003）

With the rapid development of RNA related studies，RNA synthesis technology is further challenged from two aspects of quality and quantity. At present there are mainly two methods for RNA synthesis，chemical synthesis and enzymatic synthesis. By the commercialized chemical way，the synthesis of RNA with ＜ 90 bases is achieved；however，the cost of the synthesis is relatively high，which leads the initiation of many researches in difficulty. Compared to the chemical way，the enzymatic synthesis presents the characteristics of the high efficiency and mild reaction conditions，and by it a long sequence of RNA can be synthesized，thus，it is an efficient and lowcost measure for RNA synthesis. The enzymatic production of RNA is in two steps，transcription and processing of initial transcripts. The transcription may be further classified into the linear transcription and the rolling circle transcription model，with which the characteristics of initial transcripts vary，and the corresponding processing methods should adapted to the varied initial transcripts，thereby，the accurate target RNA products may be obtained. Recently，as the exploration of enzymatic synthesis continues，many novel transcription and processing strategies have been developed. In this review，the mechanisms，characteristics and problems of the transcription models and processing methods in enzymatic synthesis were summarized，aiming at providing the

for further study and selective utilization of enzymatic synthesis of RNA.

RNA；enzymatic synthesis；linear transcription；rolling circle transcription；site-specific cleavage

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.008

2015-05-19

國家自然科學基金項目（31201327，31301420）

王靜，女，博士，研究方向：核酸化學與生物技術；E-mail：wodejia_sun@126.com

梁興國，男，博士，研究方向：核酸化學與生物技術；E-mail：liangxg@ouc.edu.cn