電鏡技術(shù)在植物病害研究中的應(yīng)用

馬丹丹 鄧雨青 周彥 周常勇 李中安

（西南大學(xué)柑桔研究所，重慶 400712）

電鏡技術(shù)在植物病害研究中的應(yīng)用

馬丹丹 鄧雨青 周彥 周常勇 李中安

（西南大學(xué)柑桔研究所，重慶 400712）

電子顯微鏡（electron microscopy，EM）是20世紀(jì)最重要的發(fā)明之一，其特有的高分辨率，在植物病害檢測、超微結(jié)構(gòu)及形態(tài)觀察中發(fā)揮了重要作用。對目前常用的透射電子顯微鏡，掃描電子顯微鏡、環(huán)境掃描電子顯微鏡、掃描隧道顯微鏡及原子力顯微鏡等新型電鏡的原理及其在植物病害研究中的應(yīng)用作一介紹，旨在為更好的運用電鏡技術(shù)提供參考。

超微結(jié)構(gòu)；電子顯微鏡；植物病害

植物在生長發(fā)育過程中常受細(xì)菌、真菌、病毒等病原物的危害，以及溫度、濕度等不利環(huán)境因子的脅迫，從而使得植株的細(xì)胞及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，進(jìn)而造成植株生長發(fā)育變緩甚至死亡。電鏡技術(shù)是研究這一病變過程，以及病原物形態(tài)和結(jié)構(gòu)的重要工具。本文就當(dāng)前主要的電鏡類型及其在植物病害研究中的應(yīng)用進(jìn)行概述，以期為更好的運用電鏡技術(shù)提供借鑒。

1 透射電子顯微鏡

透射電鏡（transmission electron microscope，TEM）的原理是電子束照射樣本后，用電磁透鏡收集穿透樣本的電子，并放大成像，進(jìn)而顯示物體內(nèi)部的超微結(jié)構(gòu)。其放大倍數(shù)為40-100萬倍，分辨率達(dá)0.2 nm。因樣品類別和研究內(nèi)容不同，透射電鏡需輔以負(fù)染、超薄切片和免疫電鏡技術(shù)。

1.1 負(fù)染技術(shù)

負(fù)染技術(shù)（negative staining）最早由Brenner和Home在研究番茄叢矮病毒（tomato bushy stunt virus，TBSV）時所提出［1］。其原理是將標(biāo)本包埋在染色物質(zhì)里，借助染色劑增強背景對電子的散射作用而使標(biāo)本在熒光屏上形成暗背景下的亮像。常用的負(fù)染色劑有磷鎢酸、醋酸鈾、甲酸鈾和鉬酸銨等。

由于負(fù)染技術(shù)可顯示生物大分子、細(xì)菌、病毒、分離的細(xì)胞器及蛋白質(zhì)晶體等樣品的形狀、結(jié)構(gòu)特征，且樣品制備簡單，只需用載膜銅網(wǎng)或鎳網(wǎng)直接蘸取組織汁液，負(fù)染，晾干后便可用于電鏡觀察，因此該技術(shù)被廣泛運用于萵筍（圖1-A）、柑橘、煙草、甘薯（圖1-B）等寄主中病原的檢測［2-5］。此外，由于病毒在寄主中分布不均，且含量低，因此為提高檢測的準(zhǔn)確性，常將病毒顆粒經(jīng)超離富集后再進(jìn)行負(fù)染觀察。該方法已成功應(yīng)用于柑橘黃脈病毒（citrus yellow vein clearing virus，CYVCV）、煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，TMV）等的研究［6，7］。

圖1 電鏡負(fù)染圖片

1.2 超薄切片技術(shù)

負(fù)染技術(shù)雖可以通過觀察病原粒子形態(tài)快速診斷病原，但無法觀察病株超微結(jié)構(gòu)的變化及病原在組織中的分布。超薄切片技術(shù)可解決這一難題。通過將樣品固定、脫水、樹脂滲透、包埋、聚合后，制備成50-80 nm的超薄切片，再經(jīng)醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色，便可在電鏡下進(jìn)行觀察。

研究人員借助超薄切片技術(shù)研究寄主感病后超微結(jié)構(gòu)的變化，從而揭示了粗檸檬對柑橘黃龍?。╟itrus huanglongbing，HLB）具有較強耐性的原因［8］，明確了苜蓿屬中不同皂苷提高白楊抗病能力的機理［9］，以及植物先天免疫反應(yīng)中細(xì)胞自噬調(diào)控細(xì)胞程序性死亡的過程［10］。同時，運用超薄切片技術(shù)對病原在組織的分布進(jìn)行定位，在馬鈴薯的韌皮部中發(fā)現(xiàn)存在一種與柑橘黃龍病菌十分相似的新型病原細(xì)菌，從而為研究馬鈴薯斑馬片?。╬otatoes zebra chip disease，ZP）這種新發(fā)病害的系統(tǒng)發(fā)育提供了幫助［11］。超薄切片的TEM圖片以黃龍病菌侵染的柑橘樣品組織為例［12］，如圖2所示。

圖2 電鏡觀察柑橘黃龍病組織結(jié)構(gòu)［12］

1.3 免疫電鏡技術(shù)

免疫電鏡技術(shù)（immune electron microscopy，IEM）又稱為免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)（immunocy tochemistry），其原理是通過將免疫學(xué)與超微結(jié)構(gòu)形態(tài)學(xué)相結(jié)合，利用抗原-抗體的特異性結(jié)合對抗原或抗體進(jìn)行精確定位［13］。

根據(jù)標(biāo)記方法的不同，免疫電鏡技術(shù)又分為免疫鐵蛋白技術(shù)、免疫酶標(biāo)技術(shù)和免疫膠體金技術(shù)。但免疫鐵蛋白技術(shù)存在Fe原子的分子量太大，難以透過細(xì)胞膜和組織，只適用于細(xì)胞表面抗原定位等缺點。早期，朱培坤［14］和呂文淵［15］分別將免疫酶標(biāo)技術(shù)應(yīng)用于長葉車前花葉病毒（ribgrass mosaic virus，RMV）和水仙花葉病毒（natcissus mosaic virus，NMV）在植物組織細(xì)胞內(nèi)的分布，該技術(shù)雖可實現(xiàn)對細(xì)胞內(nèi)外的抗原進(jìn)行定位，但因酶反應(yīng)產(chǎn)物比較彌散而分辨率較低。因此，這兩種標(biāo)記方法在植物病害研究中應(yīng)用較少。免疫膠體金技術(shù)因其具有較高靈敏度而被廣泛運用于番茄不孕病毒（tomato aspermy virus，TAV）、黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，CMV）、柑橘鱗皮病毒（citrus psorosis virus，CPsV）、番茄環(huán)紋斑點病毒（tomato zonate spotvirus，TZSV）（圖3）等病害的檢測［5，16，17］。同時，由于免疫膠體金能夠檢測到亞細(xì)胞水平，因此也將該技術(shù)結(jié)合超薄切片技術(shù)被用于大麥條紋花葉病毒（barly strip mosaic virus，BSMV）、廣藿香病毒X（patchouli virus X，PatVX）、甜菜壞死黃脈病毒（beet necrotic yellow vein virus，BNYVV）等病原在寄主細(xì)胞中的定位［18-20］。此外，免疫電鏡技術(shù)還被用于揭示病毒編碼的蛋白在病毒的復(fù)制、癥狀表達(dá)、移動及傳播過程中所發(fā)揮的作用［21］。

圖3 膠體金免疫電鏡觀察到的TZSV病毒粒子［5］

2 電子顯微鏡的類型

2.1 掃描電子顯微鏡

掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）是繼透射電鏡之后發(fā)展起來的一種電子顯微鏡。其原理是利用高能電子束在涂有導(dǎo)電材料的樣本上掃描，通過電子與樣本元素互作，產(chǎn)生包含樣本形態(tài)學(xué)、結(jié)晶學(xué)等信息的圖像。

掃描電鏡與光學(xué)顯微鏡觀察相比，具有分辨率高、立體感強、圖像直觀等優(yōu)點，更適于觀察樣品表面的微小形態(tài)特征。Motamedi［22］和Sadeghi［23］分別通過SEM技術(shù)，觀察到異株蕁麻（Urtica dioica）提取物和銀納米粒子（Ag-NPs）可分別使表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的大小、結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，進(jìn)而明確其殺菌機理。此外，該技術(shù)還應(yīng)用于研究惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）菌株THJ609-3（圖4）、鏈霉菌（Streptomyces aureus）和藍(lán)藻細(xì)菌（Cyanobacteria）等生防菌的抗病機理［24-26］。

圖4 柑橘黑變病菌孢子的掃描電鏡圖片［24］

2.2 其他電子顯微鏡類型

除TEM和SEM這兩種使用最為廣泛的電子顯微鏡外，高壓電子顯微鏡（high-voltage electron microscope，HVEM），以及環(huán)境掃描電子顯微鏡（environmental scanning electron microscope，ESEM）、掃描隧道顯微鏡（scanning tunneling microscope，STM）、原子力顯微鏡（atomic force microscope，AFM）等新型電鏡技術(shù)也是植物病害研究的重要手段。

2.2.1 高壓電子顯微鏡 HVEM 的原理與TEM基本相同，但前者的加速電壓為200-1 000 kV，遠(yuǎn)高于后者的50-100 kV，因此所檢測的切片厚度最大可達(dá)1 μm，制片過程較TEM簡單［27］。該技術(shù)不僅用于觀察細(xì)菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)，還因其強穿透能力、高分辨率、低損傷和占用空間小等優(yōu)點，被用于研究植物中亞細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)差異［28］。

監(jiān)測結(jié)束后,讀取數(shù)據(jù)庫,對固定周期(2 min)檢測器和變周期數(shù)據(jù)傳輸檢測器每次發(fā)送的數(shù)據(jù)分別進(jìn)行提取,記錄并累加數(shù)據(jù)字符的長度,每天統(tǒng)計一次。兩種模式下,數(shù)據(jù)字符長度累加情況如圖11所示。

2.2.2 環(huán)境掃描電子顯微鏡 ESEM是一種掃描式電子光學(xué)儀器，其樣品室壓力為10-2 700 Pa的高氣壓低真空環(huán)境［29］。生物樣品可不經(jīng)脫水、干燥、導(dǎo)電等處理而直接觀察，避免了操作過程中樣本的損傷，實現(xiàn)了樣本結(jié)構(gòu)的活體觀察［30］。Fan等［31］運用該技術(shù)研究水稻稻曲病菌（Ustilaginoidea virens，Uv）時發(fā)現(xiàn)，Uv菌絲可穿透擬南芥和煙草表皮的角質(zhì)層，并觀察到其分生孢子到厚壁孢子的轉(zhuǎn)變。而D'Aquino等［32］在柑橘綠霉病菌（Penicillium digitatum）的研究中，利用該技術(shù)觀察經(jīng)噻苯咪唑（thiabendazole，TBZ）處理的柑橘表皮的結(jié)構(gòu)變化。此外，Zankel等［33］通過該技術(shù)對天竺葵葉片表皮細(xì)胞上腺毛的頂端細(xì)胞進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，在代謝非?；钴S的細(xì)胞中內(nèi)含大量的細(xì)胞器和小液泡，這為今后深入研究植物內(nèi)部生理代謝活動及植株抗病性等都有重要意義。

2.2.3 掃描隧道電子顯微鏡 STM是IBM蘇黎世實驗室于1981年發(fā)明的，其主要原理是利用電子隧道效應(yīng)，在分子、甚至原子水平上觀察物體表面結(jié)構(gòu)［34］。該技術(shù)可用于明確生物分子的結(jié)構(gòu)特征，從而為研究病原菌的侵染機理，以及植株的抗性提供技術(shù)支持。如張玉忠等［35］將該技術(shù)應(yīng)用于棉花纖維的研究中，因其高分辨率可清晰地觀察到纖絲的超微結(jié)構(gòu)。而Masai等［36］在研究嗜熱細(xì)菌H+-ATPase亞基復(fù)合物時發(fā)現(xiàn)，利用STM比TEM等更適于觀察H+-ATPase分子的結(jié)構(gòu)。

2.2.4 原子力顯微鏡 AFM是在STM的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型電鏡技術(shù)，與STM最大的差別在于利用原子間的范德華力作用，而非量子力學(xué)隧道效應(yīng)來呈現(xiàn)樣品的表面特征，其優(yōu)勢在于樣品不受導(dǎo)電性質(zhì)的影響，且具有高分辨率，可對感染病毒后的細(xì)胞表面形態(tài)的改變進(jìn)行研究［37］。Imai等［38］利用AFM直接對TMV的二維成核生長過程進(jìn)行了研究，避免了STM樣本電涂層對內(nèi)部細(xì)微結(jié)構(gòu)觀察的影響。而Drygin等［39］利用AFM對TMV高分子量的RNA分子和核糖核蛋白進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，TMV中存在因RNA分子突起造成的局部裸露結(jié)構(gòu)。

3 不足與改進(jìn)

電鏡技術(shù)在植物病害研究中發(fā)揮越來越重要的作用。雖然各類電鏡具有其特有的技術(shù)優(yōu)勢（表1），但仍面臨如下問題。

表1 電鏡在植物病害研究中的應(yīng)用

3.1 負(fù)染色靈敏度問題

負(fù)染色檢測技術(shù)雖可快速檢測病原，但其靈敏度受載網(wǎng)支持膜上病原數(shù)量和分布的影響。尤其是在植物病原含量低時，如果直接粗提取負(fù)染則不易檢出。為此，宋敬東等［40］提出利用超速離心濃度樣本、提高載網(wǎng)吸附病原能力及改變病原在載網(wǎng)支持膜上分布均勻度等改進(jìn)方法。

3.2 TEM中樣品制備問題

TEM樣品制作步驟環(huán)環(huán)相扣，任何一個環(huán)節(jié)的失誤，均會影響電鏡照片的質(zhì)量，即無法客觀真實的觀察植物病害誘發(fā)的寄主超微結(jié)構(gòu)病理變化及病原的組織定位。為此，李博［41］針對載網(wǎng)支持膜污染、切片污染及染色污染等環(huán)節(jié)提出了相應(yīng)的改進(jìn)措施。而Neweomb等和Kuntsche等［42，43］建立的超低溫快速冷凍技術(shù)可有效解決常規(guī)化學(xué)固定因其作用時間長導(dǎo)致的生物組織結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而影響超微結(jié)構(gòu)分析的難題。此外，楊瑞等［44］還根據(jù)材料的滲透性差異，比較了不同的樹脂類型，并對樣品的包埋方法進(jìn)行了改進(jìn)，以便獲得高質(zhì)量的包埋塊。

膠體金標(biāo)記技術(shù)在操作過程中仍存在標(biāo)記效率不高和特異性不強等問題，嚴(yán)重影響植物病原診斷的準(zhǔn)確性。為此，Roberts等［45］對預(yù)處理條件進(jìn)行了探索，提出樣品使用戊二醛單獨固定、玻片用Decon75預(yù)處理等改進(jìn)方法。

3.4 SEM的成像問題

SEM通常捕獲的是灰色圖像，缺乏視覺感染力，且圖像信息貧乏。Sim等［46，47］通過將Canny邊緣檢測技術(shù)和現(xiàn)有的優(yōu)化著色技術(shù)相結(jié)合，發(fā)展出的Canny自適應(yīng)優(yōu)化技術(shù)不僅可提供彩色圖像，還提高了圖像的質(zhì)量。此外，新近出現(xiàn)的偽映射技術(shù)，進(jìn)一步提高了SEM圖像輸出格式轉(zhuǎn)換的靈活性［48］。

4 小結(jié)

自世界上第一臺電鏡問世至今，經(jīng)過半個多世紀(jì)的發(fā)展，電鏡技術(shù)已取得了重大的突破。今后隨著多種技術(shù)的相互協(xié)作，尤其計算機技術(shù)的不斷融合，將使電鏡技術(shù)得到不斷的完善，同時隨著電鏡樣品制備技術(shù)的不斷發(fā)展，電鏡技術(shù)將在植物病害研究中發(fā)揮更為重要的作用。

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［47］Sim KS， Ting HY， Lai MA， et al. Improvement to the scanning electron microscope image colorization by adaptive tuning［J］. Journal of Microscopy， 2009， 234（3）：243-250.

［48］Lo TY， Sim KS， Tso CP， et al. Improvement to the scanning electron microscope image adaptive Canny optimization colorization by，pseudo-mapping［J］. Scanning， 2014， 36（5）：530-539.

（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Application of Electron Microscopy Technology in the Research of Plant Diseases

MA Dan-dan DENG Yu-qing ZHOU Yan ZHOU Chang-yong LI Zhong-an
（Citrus Research Institute，Southwest University，Chongqing 400712）

Electron microscopy（EM）is the most important invention in the 20th century. The EM plays a great role in detection of the plant disease and observation of ultrastructure and morphology because of its high resolution. The principles of electron microscopes commonly used at present and their applications in the plant disease research were introduced in this article，including transmission electron microscope（TEM），scanning electron microscope（SEM），environmental scanning electron microscope（ESEM），scanning tunneling microscope（STM）and atomic force microscope（AFM）. This article is aimed to provide reference for the better utilization of electron microscopy.

ultrastructure；electron microscope；plant diseases

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.007

2015-05-18

國家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201203076），國家科技支撐子課題（2012BAD19B06），重慶市兩江學(xué)者項目，中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費（XDJK2014A001）

馬丹丹，女，碩士研究生，研究方向：細(xì)胞生物學(xué)；E-mail：dandanmxz@163.com

李中安，男，研究員，研究方向：分子植物病理學(xué)，細(xì)胞生物學(xué)；E-mail：zhongan@cric.cn