梅蘭春酒醅中生香酵母的分離鑒定及其發(fā)酵面包香氣成分分析

王益姝，錢(qián)超，黃衛(wèi)寧*，徐巖，劉若詩(shī)，李寧，李志斌，傅貴華

1(江南大學(xué)，食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122)2(江南大學(xué)，生物工程學(xué)院工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122)3(南京百合貝克生物科技有限公司，江蘇 南京，211000)4(福建省麥都食品發(fā)展有限公司，福建 泉州，362213)

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梅蘭春酒醅中生香酵母的分離鑒定及其發(fā)酵面包香氣成分分析

王益姝1，錢(qián)超2，黃衛(wèi)寧1*，徐巖2，劉若詩(shī)3，李寧3，李志斌4，傅貴華4

1(江南大學(xué)，食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122)2(江南大學(xué)，生物工程學(xué)院工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122)3(南京百合貝克生物科技有限公司，江蘇 南京，211000)4(福建省麥都食品發(fā)展有限公司，福建 泉州，362213)

從梅蘭春酒醅中分離篩選生香酵母菌，經(jīng)26S rDNA D1/D2區(qū)域序列分析法鑒定其種屬，通過(guò)固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC- MS)分析其發(fā)酵液的揮發(fā)性香氣成分，應(yīng)用生香酵母發(fā)酵面團(tuán)制作面包，進(jìn)行感官評(píng)定并利用SPME-GC- MS分析面包香氣成分。結(jié)果表明：分離篩選得到2株產(chǎn)獨(dú)特香氣的酵母菌，兩者的發(fā)酵液均具有強(qiáng)烈的酒香和酯香風(fēng)味，分子鑒定結(jié)果為異常威克漢姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)。酯類(lèi)和醇類(lèi)是該生香酵母菌發(fā)酵液中主體香氣成分，乙酸乙酯、乙酸異戊酯、異戊醇和乙醇是其中相對(duì)含量較高的四種風(fēng)味物質(zhì)，尤其乙酸乙酯相對(duì)含量高達(dá)50%以上。利用生香酵母發(fā)酵面團(tuán)制作的面包，感官評(píng)定得分明顯高于普通酵母面包，其面包芯具有淡淡的怡人清香和果香味。與普通酵母面包相比，生香酵母面包中的醇類(lèi)、酯類(lèi)等各類(lèi)風(fēng)味物質(zhì)的含量都得到了大幅度提升，尤其是異戊醇、乙酸乙酯、乙酸異戊酯、苯乙醇、乙酸苯乙酯等增加幅度尤為明顯。

生香酵母；分離鑒定；發(fā)酵；面包烘焙；香氣成分

生香酵母，泛指能產(chǎn)生香味物質(zhì)的酵母菌[1]，其種類(lèi)較多，目前已報(bào)道的能產(chǎn)生顯著香氣的酵母菌主要包括假絲酵母、畢赤酵母、球擬酵母和漢遜酵母等[2]。不同生香酵母所產(chǎn)生的香味也不盡相同，例如果香、花香、清香、焦糊味和醬香等[2]。因其獨(dú)特的風(fēng)味貢獻(xiàn)，生香酵母已成功應(yīng)用于白酒、葡萄酒、食醋、果酒、黃酒、醬油、香精、香料等行業(yè)[3-9]，但目前關(guān)于生香酵母應(yīng)用于烘焙食品的研究還鮮有報(bào)道。長(zhǎng)久以來(lái)，國(guó)內(nèi)烘焙行業(yè)多是通過(guò)添加香精香料以改善面包風(fēng)味，但香精多為人工合成，長(zhǎng)期攝入對(duì)人體健康不利[10]。隨著人們對(duì)健康天然食品的日益青睞，需要尋求更加自然安全的方法賦予面包獨(dú)特風(fēng)味。

酒醅是目前分離篩選生香酵母的重要來(lái)源之一，已有多位研究者從中分離優(yōu)質(zhì)生香酵母用于改善不同香型白酒的風(fēng)味[11-12]，但鮮有研究者將酒醅中生香酵母應(yīng)用于其他發(fā)酵食品領(lǐng)域。本文選取梅蘭春酒醅作為樣品，旨在從中分離篩選出優(yōu)良的生香酵母，分析其發(fā)酵液的揮發(fā)性香氣成分，并將其應(yīng)用于面團(tuán)發(fā)酵和面包制作，研究生香酵母面包的香氣成分，為改善面包風(fēng)味開(kāi)辟新思路，為生香酵母在烘焙食品領(lǐng)域的商業(yè)化應(yīng)用進(jìn)行初步探索。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

梅蘭春酒醅(MLC)：由江南大學(xué)生物工程學(xué)院提供；YPD培養(yǎng)基：杭州百思生物科技公司；真菌DNA提取試劑盒：天根生化科技(北京)有限公司；PCR Buffer(+Mg2+)、dNTP、EasyTaq酶、ddH2O：北京全式金生物有限公司；Loading Buffer、DNA Maker：大連 Takara公司；引物：上海桑尼生物科技有限公司；面包粉：鵬泰(秦皇島)面粉有限公司；即發(fā)活性干酵母：廣東省梅山馬利酵母有限公司；起酥油：中糧東海糧油工業(yè)(張家港) 有限公司；白砂糖、食鹽：市售。

1.2儀器與設(shè)備

HHS-150B型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，南京恒裕電子儀器廠(chǎng)；LDZX-50KBS 立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng)；SW-CJ-2F 潔凈工作臺(tái)，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；XSP-10C 型電子顯微鏡，上海彼愛(ài)姆光學(xué)儀器制造有限公司；PC300 型PCR 儀，Eppendorf Master personal；凝膠成像儀，BIO-RAD；DYY-8C 型電泳儀，北京六一儀器廠(chǎng)；攪拌機(jī)(SM-25)、醒發(fā)箱(SPC-40SP)、烤箱；無(wú)錫新麥機(jī)械有限公司；57330-U固相微萃取裝置及75 μm碳分子篩/聚二甲基硅氧烷(CAR/PDMS)萃取頭，美國(guó)Supelco公司；GC-MS聯(lián)用儀，美國(guó)Finnigan公司。

1.3方法

1.3.1生香酵母的分離篩選鑒定

1.3.1.1梅蘭春酒醅中酵母菌的分離

富集酵母菌：酒醅樣品取25 g，加入到含225 mL YPD培養(yǎng)基的錐形瓶中，30 ℃ 200 r/min搖床培養(yǎng)24 h。

酵母菌分離：取上述搖勻的培養(yǎng)液1 mL進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)謩e吸取10-4、10-5和10-6梯度的稀釋液100 μL涂布于YPD平板，在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后挑取典型酵母菌菌落接入YPD液體培養(yǎng)基中，經(jīng)2～3次劃線(xiàn)分離、涂片染色鏡檢，得酵母菌純培養(yǎng)物。

1.3.1.2酵母菌的風(fēng)味篩選

將酵母菌以2%接種量接種于含50 mL YPD液體培養(yǎng)基的錐形瓶中置于200 r/min搖床，另外將其劃線(xiàn)接種于YPD平板，平板和液體培養(yǎng)基在30 ℃條件下培養(yǎng)24 h后嗅聞風(fēng)味(以不接菌的YPD平板和液體培養(yǎng)基為空白)，篩選出產(chǎn)獨(dú)特香氣的酵母菌。觀(guān)察生香酵母菌的菌落形態(tài)以及細(xì)胞形態(tài)。

1.3.1.326S rDNA D1/D2區(qū)域序列分析法鑒定生香酵母菌

利用天根真菌DNA提取試劑盒提取酵母菌的DNA，以DNA基因組為模板，以真菌26S rDNA D1 區(qū)通用引物NL1A和LS2為引物，采用50 μL 反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，運(yùn)用凝膠成像儀進(jìn)行拍照分析，然后送往上海桑尼公司進(jìn)行測(cè)序，最后將測(cè)試得到的擴(kuò)增序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST同源性序列比對(duì)分析。根據(jù)同源序列的比對(duì)結(jié)果，從GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)下載相應(yīng)模式菌株，利用MEGA5.1軟件計(jì)算菌株進(jìn)化距離，運(yùn)用NJ(Neighbor-Joining)法構(gòu)建分離出的生香酵母菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3.2生香酵母發(fā)酵液中揮發(fā)性香氣成分分析

固相微萃?。簻?zhǔn)確量取5 mL 發(fā)酵液于15 mL 頂空瓶中恒溫( 60 ℃) 水浴，將50/30 μm DVB /CAR/PDMS 萃取頭插入頂空瓶中平衡5 min 后吸附40 min。然后將萃取頭移入氣相色譜的高溫汽化室中解吸8 min，進(jìn)GC-MS分析，測(cè)定生香酵母發(fā)酵液中的揮發(fā)性香氣成分。

GC條件[13]：DB-5MS毛細(xì)管色譜柱(60 m×0.32 mm，1 μm)；升溫程序：起始溫度40 ℃，保留1 min，然后以6 ℃/min升溫至160 ℃，接著以10 ℃/min升溫至250 ℃，保留10 min。MS條件：電子電離源；電子能量70 eV；進(jìn)樣孔溫度250 ℃；發(fā)射電流200 μA；離子源溫度200 ℃；采集方式設(shè)定為全掃描；質(zhì)量掃描范圍m/z33～495。 通過(guò)GC-MS數(shù)據(jù)分析軟件系統(tǒng)完成實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理，未知化合物經(jīng)電腦計(jì)算機(jī)檢索，并與NSIT譜庫(kù)和RTLPEST譜庫(kù)相匹配，僅報(bào)道匹配度大于800( 最大值為1 000) 的物質(zhì)，并采用峰面積歸一化法定量計(jì)算出各揮發(fā)性香氣成分的相對(duì)含量。

1.3.3生香酵母發(fā)酵面包的感官評(píng)定及香氣成分分析

將生香酵母接種于YPD液體培養(yǎng)基中活化至穩(wěn)定期，取菌液5 000 r/min 離心15 min，收集菌體，無(wú)菌生理鹽水沖洗2次后，接種至小麥粉∶水=1∶3(w/w)的面團(tuán)中，使得菌種的初始接入量均為106CFU/g，放入30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中搖床150 r/min培養(yǎng)24 h后進(jìn)行面包制作，以普通活性干酵母面包為對(duì)照組，2種面包具體配方如表1所示，制作步驟參照張思佳等的方法[14]。

表1　面包制作配方

注：-表示未添加，DYB表示活性干酵母發(fā)酵制作的面包，WAB表示添加Wickerhamomycesanomalus發(fā)酵面團(tuán)制作的面包。

將酵母菌面團(tuán)與糖、鹽、水、活性干酵母和起酥油投入打面缸攪打成面團(tuán)，取出覆蓋保鮮膜松弛10 min后分割為90 g /個(gè)，搓圓整型，于38 ℃相對(duì)濕度85%的醒發(fā)箱內(nèi)醒發(fā)90 min，上火溫度為170 ℃下火溫度為210 ℃，烘焙23 min后取出脫模，室溫冷卻2 h。取面包芯5 g于樣品瓶中，運(yùn)用SPME-GC-MS分析揮發(fā)性風(fēng)味并利用峰面積歸一化法計(jì)算相對(duì)含量，方法同1.3.2。

感官評(píng)定小組由30位經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的人員(15名女性，15名男性)組成。評(píng)定方法采用9分嗜好評(píng)分法[13]，對(duì)面包的外觀(guān)、色澤、風(fēng)味、口感、內(nèi)部結(jié)構(gòu)以及整體可接受度進(jìn)行評(píng)分。其中1～9分別代表極度不喜歡、非常不喜歡、正常不喜歡、略微不喜歡、不喜歡也不討厭、略微喜歡、正常喜歡、非常喜歡以及極度喜歡。

1.4數(shù)據(jù)分析

采用SPSS16.0及Microsoft Office Excel 2013軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，運(yùn)用方差分析法(ANOVA) 進(jìn)行顯著性分析，顯著差異水平取P<0.05。

2　結(jié)果與討論

2.1生香酵母的分離篩選

經(jīng)富集培養(yǎng)，平板涂布，劃線(xiàn)分離和涂片鏡檢，從梅蘭春酒醅樣品中共分離得到35株酵母菌。通過(guò)嗅聞YPD平板和液體發(fā)酵液的風(fēng)味，篩選出2株產(chǎn)特殊香氣的酵母菌M-4和M-5，其風(fēng)味特征如表2所示，菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)如圖1所示。

表2　生香酵母菌的篩選

注：+++++表示風(fēng)味極強(qiáng)，++++風(fēng)味較強(qiáng)，+++風(fēng)味中等，++風(fēng)味較弱，+風(fēng)味極弱。

圖1　生香酵母的菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)Fig.1　Colony and cell morphology of aroma-producing yeasts

由表2結(jié)果發(fā)現(xiàn)，M-4和M-5的風(fēng)味特征一致，固體平板均體現(xiàn)出極強(qiáng)的酯香，發(fā)酵液則表現(xiàn)為強(qiáng)烈的酒香和酯香，且M-4發(fā)酵液的風(fēng)味要強(qiáng)于M-5。有文獻(xiàn)指出生香酵母原稱(chēng)產(chǎn)酯酵母，酯香是其重要的特征香氣[2]。

觀(guān)察2株菌的菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)，發(fā)現(xiàn)M-4和M-5的形態(tài)完全相同。菌落直徑2 mm左右，乳白色不透明，球形凸起，邊緣整齊，干燥無(wú)光澤，液體培養(yǎng)有菌膜。通過(guò)顯微鏡觀(guān)察，細(xì)胞形態(tài)為卵圓形。

2.226S rDNA D1/D2區(qū)域序列分析法鑒定生香酵母菌

2株生香酵母菌 26S rDNA D1/D2區(qū)序列比對(duì)結(jié)果如表3所示，菌株M-4、M-5與WickerhamomycesanomalusGU138438.1的同源性分別達(dá)到100%和99%。根據(jù)NCBI同源性比對(duì)結(jié)果，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果如圖2所示。

表3　生香酵母菌 26S rDNA D1/D2區(qū)序列比對(duì)結(jié)果

圖2　生香酵母菌26S rDNA D1/D2 區(qū)序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2　Phylogenetic tree based on the 26S rDNA D1/D2 gene sequences of aroma-producing yeasts

由圖2可知，M-4、M-5WickerhamomycesanomalusGU138438.1有極高的親緣關(guān)系。通過(guò)以上結(jié)果，可將酵母菌M-4和M-5鑒定為異常威克漢姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)，根據(jù)發(fā)酵液風(fēng)味強(qiáng)度，后續(xù)選擇M-4酵母菌進(jìn)行分析和應(yīng)用。

W.anomalus是目前分離得到的常見(jiàn)生香酵母之一。明紅梅等[15]從濃香型大曲中成功分離得到產(chǎn)香菌異常威克漢姆酵母。黃光建等[16]從豉香型白酒酒餅中分離獲得高產(chǎn)乙酸乙酯的酵母菌J10，鑒定該菌為異常畢赤酵母(與W.anomalus同物異名)。本研究是從食源性樣品酒醅中分離篩選得到1株W.anomalus，酒醅主要包含多種谷物糧食，這與面粉基質(zhì)類(lèi)似，所以認(rèn)為W.anomalus用于發(fā)酵面團(tuán)制作面包具有一定的可行性和安全性，而張國(guó)華[17]從不同地區(qū)的傳統(tǒng)面團(tuán)發(fā)酵劑中分離鑒定出異常畢赤酵母(與W.anomalus同物異名)也表明W.anomalus可在面團(tuán)發(fā)酵中應(yīng)用。

2.3生香酵母發(fā)酵液中揮發(fā)性香氣成分分析

培養(yǎng)基對(duì)照組與W.anomalus發(fā)酵液的氣相色譜圖如圖3所示，GC-MS的統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表4 所示。結(jié)果顯示，W.anomalus經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)生多種風(fēng)味物質(zhì)，主要包括醇類(lèi)(4種)和酯類(lèi)(5種)，這兩者占風(fēng)味物質(zhì)總含量的90%以上，此外還有少量酸類(lèi)(1種)。各種風(fēng)味物質(zhì)的相對(duì)含量具有明顯差異，經(jīng)協(xié)調(diào)作用使W.anomalus發(fā)酵液具有獨(dú)特的酯香和酒香香氣。

圖3　W. anomalus發(fā)酵液中揮發(fā)性香氣物質(zhì)GC-MS總離子流色譜圖Fig.3　GC-MS total ion current chromatogram of volatile substances from fermentation broth of W. anomalus

保留時(shí)間/min風(fēng)味物質(zhì)名稱(chēng)峰面積×106相對(duì)含量/%3.304乙酸乙酯3169257.0114.118乙醇580410.4394.731乙酸丙酯2580.4655.486乙酸異丁酯6631.1948.174乙酸異戊酯32685.87710.859異戊醇1175921.1516.359乙酸1620.29219.51-壬醇1660.29921.403乙酸-2-苯乙酯1240.22322.463苯乙醇13902.505

W.anomalus發(fā)酵液中4種醇類(lèi)物質(zhì)分別是乙醇(10.439%)、異戊醇(21.15%)、苯乙醇(2.505%)和1-壬醇(0.299%)，乙醇和異戊醇是發(fā)酵液中最主要的2種醇類(lèi)物質(zhì)。異戊醇呈現(xiàn)水果香和花香特征[18]，在醇類(lèi)物質(zhì)中含量最高，它是白酒中雜醇油的主要成分，是白酒重要的呈香物質(zhì)之一[19]。苯乙醇具有花香香氣，廣泛存在于白酒中[18]。

酯類(lèi)是常見(jiàn)的呈香化合物，大部分表現(xiàn)為水果香和花香[20]。W.anomalus發(fā)酵液中檢測(cè)出的5種酯類(lèi)物質(zhì)是乙酸乙酯(57.011%)、乙酸異戊酯(5.877%)、乙酸丙酯(0.465%)、乙酸異丁酯(1.194%)和乙酸-2-苯乙酯(0.223%)。其中乙酸乙酯的相對(duì)含量在50%以上，是W.anomalus發(fā)酵液中相對(duì)含量最高的風(fēng)味物質(zhì)，占首要地位。與此相同的是，黃光健等[16]從豉香型白酒酒餅中分離獲得的異常畢赤酵母(W.anomalus同物異名)也表現(xiàn)出高產(chǎn)乙酸乙酯的特性。有研究表明乙酸乙酯呈現(xiàn)菠蘿香，蘋(píng)果香，水果香，是中國(guó)清香型白酒的主體香氣成分[21]。發(fā)酵液中另一重要酯類(lèi)是乙酸異戊酯，它具有香蕉香、甜香和蘋(píng)果香，其閾值極低具有很高的香氣活力[22]，雖含量不高但可能對(duì)W.anomalus發(fā)酵液的獨(dú)特風(fēng)味有較大貢獻(xiàn)。與此類(lèi)似的還有乙酸苯乙酯，其閾值也較低，具有玫瑰花香和蜂蜜香的特征香氣[22]。

具體分析W.anomalus發(fā)酵液的GC-MS結(jié)果發(fā)現(xiàn)，酯類(lèi)和醇類(lèi)是發(fā)酵液中主體香氣成分，這兩者具有花香和果香的特征香氣。乙酸乙酯、乙酸異戊酯、異戊醇和乙醇是其中相對(duì)含量較高的4種香氣成分，尤其乙酸乙酯相對(duì)含量高達(dá)50%以上。

2.4生香酵母發(fā)酵面包的感官評(píng)定結(jié)果

如圖4所示，生香酵母發(fā)酵面團(tuán)制作的面包WAB在風(fēng)味和整體可接受度方面要優(yōu)于普通酵母面包DYB。尤其是在風(fēng)味評(píng)定方面，WAB獲得8.5分，明顯高于DYB的7.0分，可見(jiàn)對(duì)于消費(fèi)者來(lái)說(shuō)，生香酵母面包的風(fēng)味更佳。據(jù)感官評(píng)定者描述，DYB面包芯具有普通面包的風(fēng)味，且略帶感官不佳的酵母味，而WAB面包芯則呈現(xiàn)淡淡的怡人清香和果香味。此外，WAB在外觀(guān)、色澤、口感方面的評(píng)分也略高于DYB。所以就整體感官評(píng)定結(jié)果而言，WAB面包更受消費(fèi)者喜愛(ài)，其風(fēng)味更受青睞。

圖4　生香酵母面包和普通酵母面包的感官評(píng)定雷達(dá)圖Fig.4　Sensory characteristics of aroma-producing yeast bread and control bread

2.5生香酵母發(fā)酵面包的香氣成分分析

由表5、表6可知，添加生香酵母發(fā)酵的面包(WAB)與普通酵母面包(DYB)的揮發(fā)性香氣物質(zhì)的種類(lèi)和含量有顯著差異。普通酵母面包檢測(cè)出34種風(fēng)味物質(zhì)，而生香酵母面包則檢測(cè)出37種。兩種面包的風(fēng)味物質(zhì)主要分為醇類(lèi)、酯類(lèi)、酸類(lèi)、醛類(lèi)、酮類(lèi)和芳香雜環(huán)類(lèi)，但比較發(fā)現(xiàn)，經(jīng)生香酵母發(fā)酵后，面包中的各類(lèi)風(fēng)味物質(zhì)的含量都得到了大幅度提升，酯類(lèi)、醛類(lèi)等風(fēng)味物質(zhì)的種類(lèi)也有所增加，這些可能是感官評(píng)定結(jié)果WAB風(fēng)味要優(yōu)于DYB的原因。

表5　生香酵母面包和普通酵母面包的SPME-GC-MS分析

續(xù)表5

編號(hào)保留時(shí)間/min風(fēng)味物質(zhì)相對(duì)含量/(×106)DYBWAB2516.4651-辛烯-3-醇21.3-2616.576正庚醇24.036.72717.596苯甲醛54.166.92817.822(E)-反式-2-壬烯醛29.225.72917.8872,3-丁二醇27.91053018.164正辛醇4.3516.63118.258異丁酸41.31153218.6121,2-丙二醇12.111.73319.277癸酸乙酯9.01-3419.646異戊酸19.837.93519.854(Z)-順-3-壬烯-1-醇11.79.253620.2693-甲硫基丙醇-7.203720.554丁酰乳酸丁酯14.111.83821.392(E,E)-反,反-2,4-癸二烯醛-7.883921.449乙酸苯乙酯-13.34021.725正己酸19.639.84122.104苯甲醇9.079.894222.503苯乙醇93.72724322.773γ-辛內(nèi)酯-6.67

注：-表示未檢出。

表6　生香酵母面包和普通酵母面包中揮發(fā)性香氣物質(zhì)的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

醇類(lèi)是WAB和DYB中含量最高的風(fēng)味物質(zhì)，醇類(lèi)物質(zhì)雖然閾值較高，但在面包風(fēng)味中所占比例也最大，所以是賦予面包香味的重要物質(zhì)[23]。表6顯示醇類(lèi)物質(zhì)中乙醇和異戊醇占主導(dǎo)地位，其次是異丁醇、正戊醇和苯乙醇等。而WAB中異戊醇和苯乙醇的含量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于DYB，這可能是由于生香酵母發(fā)酵面粉基質(zhì)后，異戊醇和苯乙醇得到大量積累。異戊醇對(duì)面包風(fēng)味有積極作用，其含量越高則面包風(fēng)味更受消費(fèi)者喜愛(ài)[24]。苯乙醇可賦予面包愉快的玫瑰香、紫蘿蘭香、茉莉花香等多種香味[25]。

酯類(lèi)物質(zhì)雖含量不高，但因其閾值較低，所以對(duì)面包風(fēng)味具有較大的貢獻(xiàn)[23]。WAB中酯類(lèi)物質(zhì)的種類(lèi)和含量明顯高于DYB，經(jīng)生香酵母發(fā)酵后的WAB中乙酸乙酯的含量顯著提高，尤其還產(chǎn)生了DYB不具有的乙酸異戊酯、乙酸苯乙酯和γ-辛內(nèi)酯，由本文2.3可知乙酸乙酯、乙酸異戊酯和乙酸-2苯乙酯都是W.anomalus發(fā)酵液中主要的香氣物質(zhì)。乙酸乙酯的蘋(píng)果香和香蕉香氣對(duì)面包風(fēng)味有益[26]，乙酸異戊酯可賦予面包類(lèi)似香蕉、梨、蘋(píng)果的酸甜味[26]，乙酸苯乙酯可使面包具有花香[27]。另外，γ-辛內(nèi)酯賦予面包蜂蜜、奶酪香氣[28]。

酸類(lèi)可增強(qiáng)面包的滋味和口感[23]，乙酸、異丁酸、異戊酸和正己酸是WAB和DYB中共有的酸類(lèi)物質(zhì)，其中乙酸含量最高。WAB中乙酸含量明顯高于DYB，本文2.3的結(jié)果也顯示乙酸是W.anomalus的主要代謝物質(zhì)之一。

醛酮類(lèi)和雜芳環(huán)類(lèi)在面包中雖含量較低，但香氣貢獻(xiàn)能力較強(qiáng)。DYB和WAB中均含有苯甲醛，它具有杏仁香、櫻桃香及堅(jiān)果香[29]。兩面包中均檢測(cè)到雜芳環(huán)類(lèi)物質(zhì)2-戊基呋喃，主要具有豆香、泥土香及類(lèi)似蔬菜的香味[30]。

3　結(jié)論

(1)從梅蘭春酒醅樣品中，通過(guò)平板涂布分離、風(fēng)味嗅聞篩選得到2株產(chǎn)獨(dú)特香氣的酵母菌，兩株酵母菌的發(fā)酵液具有強(qiáng)烈的酒香和酯香風(fēng)味，經(jīng)26S rDNA D1/D2區(qū)域序列分析法鑒定為異常威克漢姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)。

(2)利用GC-MS測(cè)定生香酵母菌發(fā)酵液的揮發(fā)性香氣成分，發(fā)現(xiàn)酯類(lèi)和醇類(lèi)是發(fā)酵液中主體香氣成分。乙酸乙酯、異戊醇、乙醇和乙酸異戊酯是其中相對(duì)含量較高的四種風(fēng)味物質(zhì)，尤其乙酸乙酯相對(duì)含量高達(dá)50%以上。

(3)生香酵母發(fā)酵面團(tuán)制作面包，其面包芯則具有淡淡的怡人清香和果香味，感官評(píng)定得分明顯高于普通酵母面包。

(4)GC-MS統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，與普通酵母面包相比，生香酵母面包中的醇類(lèi)、酯類(lèi)等各類(lèi)風(fēng)味物質(zhì)的含量都得到了大幅度提升，酯類(lèi)、醛類(lèi)等風(fēng)味物質(zhì)的種類(lèi)也有所增加，尤其是異戊醇、乙酸乙酯、乙酸異戊酯、苯乙醇、乙酸-2-苯乙酯等增加幅度尤為明顯，這些都是異常威克漢姆酵母發(fā)酵液中主要的香氣成分，由此可知生香酵母發(fā)酵對(duì)面包風(fēng)味具有顯著的改善作用。

[1]王國(guó)良,宋俊梅,曲靜然.生香酵母及其應(yīng)用[J].食品工業(yè), 2004(3): 16-17.

[2]段葆蘭.生香酵母與發(fā)酵食品的香氣[J].食品科技,1979(8): 7.

[3]熊子書(shū).中國(guó)釀酒酵母菌的研究—不同酒類(lèi)酵母篩選與應(yīng)用紀(jì)實(shí)(下)[J].釀酒科技,2002(5):19-21.

[4]PLATA C,MILLAN C,MAURICIO J C,et al. Formation of ethyl acetate and isoamyl acetate by various species of wine yeasts[J].Food Microbiology,2003,20(2):217-224.

[5]張安寧,王傳榮,夏如柏,等.生香活性干酵母提高食醋質(zhì)量的應(yīng)用試驗(yàn)[J].釀酒科技,2007(12):90-92.

[6]古其會(huì),劉四新,李從發(fā).番木瓜酒產(chǎn)香酵母的篩選與鑒定[J].食品科學(xué),2013,34(21):193-197.

[7]趙惠明,蔡麗玲.生香酵母在黃酒生產(chǎn)中的應(yīng)用研究[J].當(dāng)代生態(tài)農(nóng)業(yè),2001(3):122-125.

[8]李學(xué)偉,陳強(qiáng),朱新貴.添加生香酵母改善醬油風(fēng)味的研究[J].中國(guó)釀造,2014,33(3):121-124.

[9]陳一,潘婷婷,肜霖,等.生香酵母發(fā)酵無(wú)花果制備特色煙用香料的研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,50(23):4 923-4 926.

[10]劉士濤,劉玉環(huán),阮榕生,等.食用香精的呈味特征結(jié)構(gòu)與潛在危害性分析[J].食品工業(yè)科技,2012,33(9):426-430.

[11]王曉丹,龐博,陳孟強(qiáng),等.醬香白酒酒醅中產(chǎn)香酵母分離與鑒定[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào),2014(6): 1 799-1 808.

[12]許玲,張秋月.幾株生香酵母的分離篩選及應(yīng)用[J].釀酒科技,2010(12):48-49.

[13]程曉燕,孫銀鳳,劉娜,等.傳統(tǒng)酸面團(tuán)中植物乳桿菌發(fā)酵饅頭抗氧化特性及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)特征[J].食品科學(xué),2015,36(12):87-92.

[14]張思佳,張薇,蘇曉琴,等.乳桿菌發(fā)酵對(duì)蕎麥面包抗氧化及烘焙特性影響[J].食品工業(yè)科技,2015,36(19):49-53.

[15]明紅梅,郭志,周健,等.濃香型大曲中產(chǎn)香微生物的篩選及鑒定[J].現(xiàn)代食品科技,2015,31(4):186-191.

[16]黃光建,徐學(xué)鋒,郭梅君,等.豉香型白酒酒餅中高產(chǎn)乙酸乙酯酵母菌的分離鑒定及發(fā)酵性能研究[J].食品工業(yè)科技,2015,36(11):153-158.

[17]張國(guó)華.不同地區(qū)傳統(tǒng)面食發(fā)酵劑中菌群結(jié)構(gòu)及優(yōu)勢(shì)菌種代謝的研究[D]. 杭州:浙江大學(xué),2014.

[18]范文來(lái),徐巖.白酒79個(gè)風(fēng)味化合物嗅覺(jué)閾值測(cè)定[J].釀酒,2011,38(4):80-84.

[19]孫金旭.醬香型白酒發(fā)酵過(guò)程中異戊醇的控制研究[J].現(xiàn)代食品科技,2012,28(11):1 541-1 544.

[20]SUMBY K M,GRBIN P R,JIRANEK V. Microbial modulation of aromatic esters in wine: current knowledge and future prospects[J].Food Chemistry,2010,121(1):1-16.

[21]吳國(guó)峰,海倫,賈樹(shù)彪,等.中國(guó)蒸餾酒中幾種酯的問(wèn)題[J].釀酒科技,2008(6):80-81.

[22]高文俊.青稞酒重要風(fēng)味及其酒醅中香氣物質(zhì)研究[D].無(wú)錫：江南大學(xué),2014:68-70.

[23]POZO-BAYON M A,FUICHARD E,CAYOT N. Flavor control in baked cereal products[J].Food Reviews Internatinal,2006,22(4):335-379.

[24]PATERSON A,PIGGOTT J R. Flavour in sourdough breads: a review[J].Trends in Food Science & Technology, 2006, 17(10): 557-566.

[26]RAVYTS F,DE VUYST L. Prevalence and impact of single-strain starter cultures of lactic acid bacteria on metabolite formation in sourdough[J].Food Microbiology,2011,28(6):1 129-1 139.

[27]JENSEN S,OESTDAL H,SKIBSTED L H,et al. Chemical changes in wheat pan bread during storage and how it affects the sensory perception of aroma,flavour,and taste[J].Journal of Cereal Science,2011,53(2):259-268.

[28]BIRCH A N,MIKAEL A P,Arneborg N,et al. Influence of commercial baker's yeasts on bread aroma profiles[J].Food Research International,2013,52(1):160-166.

[29]BIRCH A N,PETERSEN M A,HANSEN ? S. The aroma profile of wheat bread crumb influenced by yeast concentration and fermentation temperature[J].LWT-Food Science and Technology,2013,50(2):480-488.

Isolation and identification of aroma-producing yeast from Meilanchun fermented grain and analysis on aroma components of fermented bread

WANG Yi-shu1,QIAN Chao2,HUANG Wei-ning1*,XU Yan2,LIU Ruo-shi3,LI Ning3,LI Zhi-bin4,FU Gui-hua4

1(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)2(Key Laboratory of Industrial Biotechnology of Ministry of Education, School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi 214122, China)3(Nanjing Baihobake Biotechnology International Co. Ltd., Nanjing 211000, China)4(Fujian Maidu Food Development Co. Ltd., Quanzhou 362213, China)

Aroma-producing yeasts were isolated from Meilanchun fermented grains, which were identified by 26S rDNA D1/D2 gene sequences analysis. Solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry (SPME-GC-MS) was used to determined volatile aroma components of fermentation broth. The aroma-producing yeasts were applied in dough fermentation and bread-making. The aroma components of different breads were studied by sensory analysis and SPME-GC-MS. Results showed that two aroma-producing yeasts were selected, whose fermentation liquor had wine and ester aroma. They were identified asWickerhamomycesanomalus. Alcohol and ester were the main aroma components in fermentation broth, including ethyl acetate, isoamyl acetate, isoamylol and ethanol with high relative amounts, 50% high content of ethyl acetate especially. Compared with common yeast bread, bread made with aroma-producing yeast had higher sensory score, whose crumb showed pleasant fresh and fruity aroma. Contents of alcohol and ester in bread made with aroma-producing yeast were highly increased, particularly those of isoamylol, ethyl acetate, isoamyl acetate, phenethyl alcohol and phenethyl acetate.

aroma-producing yeast; isolation and identification; fermentation; bread baking; aroma components

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201609008

碩士研究生(黃衛(wèi)寧教授為通訊作者,E-mail:wnhuang@jiangnan.edu.cn)。

江蘇省產(chǎn)學(xué)研聯(lián)合創(chuàng)新基金--前瞻性聯(lián)合研究項(xiàng)目(BY2014023-16)；國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31071595，31571877)；泉州市科技"燎原計(jì)劃"項(xiàng)目(2015G46)；張家港市科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(ZKN1301)；蘇州市科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(SNG201401)；中澳國(guó)際合作項(xiàng)目(201618)

2016-01-14，改回日期：2016-04-13