東北高寒地區(qū)果樹腐爛病病原菌分離、檢測與抑制探究

王 雪，于菁妮，馬現(xiàn)成，蘭 瑩，張躍華*

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東北高寒地區(qū)果樹腐爛病病原菌分離、檢測與抑制探究

王 雪1，于菁妮2，馬現(xiàn)成2，蘭 瑩1，張躍華2*

（1. 佳木斯大學理學院，黑龍江佳木斯 154007；2. 佳木斯大學農(nóng)業(yè)與環(huán)境生物技術研究所，黑龍江佳木斯 154007）

為明確東北高寒地區(qū)蘋果樹腐爛病病原菌的致病力及酚類物質對其抑制效果。以黑龍江省紅興隆管局五九七農(nóng)場林果業(yè)基地為實驗樣地，從患病果樹腐爛病病斑處分離菌株，進行病原菌致病力檢測，并以丁香酚及愈創(chuàng)木酚為抑制劑，探究其對病原菌的抑制作用。共分離出蘋果樹腐爛病致病菌4種，分別記為FA、FB、FC、FD，對4種病原菌進行致病力檢測實驗，結果顯示：FC病斑直徑最大可達2.56 cm，致病率為76.67%；FA病斑直徑最小為1.27 cm，致病力僅為43.33%；由此可知，F(xiàn)C的致病力最高，F(xiàn)A的致病力最低。抑制試驗結果表明，當抑制劑愈創(chuàng)木酚的濃度達到5.5%時，可對4種病原菌進行全面抑制，而丁香酚濃度達到2.0%時就可達到同樣效果，因此，丁香酚、愈創(chuàng)木酚作為抑制劑對蘋果樹腐爛病病原菌均有抑制效果，其中丁香酚的抑制效果優(yōu)于愈創(chuàng)木酚。

高寒地區(qū)；果樹腐爛??；病原菌；致病力；抑制試驗

蘋果樹腐爛病()是我國蘋果樹常見的一種病害，會造成樹勢衰弱、枝干枯死、死樹，甚至毀園，嚴重制約我國蘋果行業(yè)的發(fā)展[1]。該病于1903年在日本首次被發(fā)現(xiàn)，1909年宮部、山田研究證明該病屬于真菌性病害，并將該病的病原菌命名為[2]。我國最早于遼寧省南部發(fā)現(xiàn)[3]，并于1949年和1960年發(fā)生兩次大范圍暴發(fā)[2]。果樹腐爛病會造成果樹大面積減產(chǎn)、降低果農(nóng)收入，使我國果農(nóng)遭受嚴重經(jīng)濟損失[4]。黑龍江五九七農(nóng)場果園有著“中國綠色寒疆果都”之稱，果園面積有1.2萬畝，主要種植蘋果，其品種有金紅蘋果、K9、123、農(nóng)冠等。2015年林茹等人調查得到五九七農(nóng)場果園蘋果樹(K9、123、農(nóng)冠)腐爛病平均發(fā)病率在30.99%~33.44%[5]。

生產(chǎn)上對于蘋果樹腐爛病的防控主要依靠化學農(nóng)藥，然而長期大量使用化學殺菌劑不僅使果園生態(tài)環(huán)境惡化、給食品安全帶來極大隱患，而且容易導致抗藥性菌株的出現(xiàn)，因此，尋求對環(huán)境友好且高效的防治方法已成為亟待解決的問題[6]。針對五九七農(nóng)場果園蘋果樹的腐爛病現(xiàn)狀，本課題組對蘋果樹腐爛病病疤樣品進行采集，選用丁香酚及愈創(chuàng)木酚作為病原菌抑制劑，進行了初步的致病菌分離、致病力檢測及抑制探究，以期得到無殘留高效控制腐爛病病原菌的方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株采集 供試菌種分離于五九七農(nóng)場果園蘋果樹病疤，為避免染菌，菌種采集時，手術刀、剪刀等工具均以火焰灼燒方法滅菌，并用酒精棉擦拭手部和將采集的病變部位；將采集到的患病樹皮病變部位放置于無菌培養(yǎng)皿中，帶回實驗室。實驗室操作過程均為無菌操作。

1.1.2 枝條 枝條均采集于五九七農(nóng)場果園蘋果樹上，為1年生的健康、新鮮枝條，直徑控制在1.0~1.2 cm范圍內，確保枝條長度、粗細均勻一致，用剪刀采集，采集后將枝條兩端切口，以熱熔石蠟密封，防止水分流失。

1.1.3 實驗藥品制備 實驗選用抗真菌、毒副作用小、代謝殘留少的丁香酚[7]及愈創(chuàng)木酚作為抑制劑，探究其對病原菌的抑制效果。愈創(chuàng)木酚抑制劑：以無菌水為溶劑，制備以下濃度的愈創(chuàng)木酚抑制劑：2.00%、2.50%、3.00%、3.50%、4.00%、4.50%、5.00%、5.50%，保存?zhèn)溆?；丁香酚抑制劑：以乙醇為溶劑，制備以下濃度的丁香酚抑制劑?.25%、0.50%、1.00%、1.50%、2.00%，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.4 培養(yǎng)基 實驗選用基礎培養(yǎng)基中PDA培養(yǎng)基；含抑制劑培養(yǎng)基：在PDA培養(yǎng)基中以1∶15（V/V）的比例添加不同濃度的抑制劑，配制含不同濃度抑制劑的PDA培養(yǎng)基。

1.2 實驗方法

1.2.1 病原菌分離 將患病部位樹皮組織剪成邊長5 mm左右的正方形，先將患病部位樹皮組織塊在體積分數(shù)為70%酒精溶液中浸泡20 s左右，無菌水沖洗1次，1 g/L HgCl溶液中消毒4 min，無菌水沖洗5次。處理后接在PDA固體培養(yǎng)基上，放在28 ℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)3~5 d后觀察菌落生長情況。選取形態(tài)特征明顯菌落進行繼代培養(yǎng)，直至得到無污染、單一目標培養(yǎng)物為止。

1.2.2 病原菌致病力檢測 參考張美鑫等[8]的室內快速檢測方法。用滅菌的解剖刀、打孔器等處理未染病的新鮮枝條，進行枝條傷口接種操作，在25 ℃恒溫條件下培養(yǎng)，4 d后測定其病斑長度。每一接種設置10個實驗對照，實驗重復3次。

計算公式：

1.2.3 病原菌抑制 選取培養(yǎng)7 d的菌株，在同心圓上裁取直徑為8.5 mm的菌塊，轉接到含有愈創(chuàng)木酚、丁香酚抑菌劑的固體培養(yǎng)基上。以愈創(chuàng)木酚、丁香酚對應溶劑為對照組。每個梯度濃度進行3組平行實驗，每24 h觀察1次。整個試驗重復3次。25℃恒溫條件下培養(yǎng)4 d，觀察記錄菌絲生長情況。觀察記錄菌絲生長情況，整個試驗重復3次。采用十字交叉法進行各組菌絲直徑的確定，通過各組菌絲直徑平均值±方差的方法進行菌絲直徑的計算。抑制率通過計算公式[9]:

2 結果與分析

2.1 菌株培養(yǎng)特性

觀察7 d內不同分離株在PDA培養(yǎng)基上的培養(yǎng)性狀(如表1)，結果表明：各分離株在PDA培養(yǎng)基上均能生長，但培養(yǎng)特征存在差異。其中FA特征明顯，菌落為黑色，且長勢較快，7 d后觀察，菌落直徑達到88.2 mm，邊緣呈羽毛狀，產(chǎn)生黑色茂密氣生菌絲。FB、FC、FD菌落特征相似，菌落初為白色，培養(yǎng)5 d后，菌落背面中心變?yōu)辄S褐色，7 d后觀察，F(xiàn)B菌落為黃褐色，邊緣為放射狀，直徑達到80.7 mm，氣生菌絲灰色稀少；FC菌落仍為黃褐色，呈現(xiàn)羽毛狀邊緣，直徑達到85.4 mm，為白色稀少氣生菌絲；FD菌落為深褐色，邊緣為放射狀，菌絲直徑達到75.7 mm，氣生菌絲灰色稀少。

表1 7 d后分離株在PDA培養(yǎng)基上的菌落特征

2.2 菌株致病力檢測

致病力檢測實驗結果表明（見圖1）：4種分離株均能使果樹枝條患病，培養(yǎng)1 d后觀察現(xiàn)象均為劃痕變色，未見明顯病斑。接種2 d后，F(xiàn)A、FB、FC在傷口處開始出現(xiàn)黃褐色病斑，但每一分離株的平均病斑長度存在差異，F(xiàn)B最為明顯，F(xiàn)D無明顯病斑。接種3 d后，F(xiàn)D病斑長勢明顯，漲幅最大，F(xiàn)A、FB漲勢緩慢。培養(yǎng)4 d后觀察（如表2），結果表明：FC分離株的致病效果最為明顯，病斑直徑可達2.56 cm，F(xiàn)A致病效果較差，病斑直徑僅為1.27 cm，4種分離株接種后枝條的發(fā)病率分別為：43.33%、50.00%、76.67%、66.67%。4種分離株對果樹均有致病效果，其中在4種分離株中FC致病力最高，F(xiàn)A致病力最小。

表2 4 d后各分離株致病率及病疤直徑

圖1 4種分離株致病力檢測

2.3 愈創(chuàng)木酚的抑制效果

愈創(chuàng)木酚抑制劑對病原菌抑制試驗結果見圖2，結果表明：愈創(chuàng)木酚對FB及FD抑制效果最為明顯，濃度為2.00%時可見其抑制效果，而濃度為2.00%的愈創(chuàng)木酚抑制劑對FA及FC均無抑制效果。濃度為2.50%時，對FC菌種具有抑制效果。愈創(chuàng)木酚濃度在3.00%~3.50%范圍內，曲線增幅明顯，表明愈創(chuàng)木酚抑制劑在3.00%~3.50%范圍內，抑制效果顯著提高。濃度在3.50%~5.00%范圍內，對FA菌種的抑制效果增長緩慢。當愈創(chuàng)木酚濃度達到4.00%時，對FB、FC、FD菌種皆完全抑制，此時FA仍能生長。當濃度達到5.50%時，對4種菌株完全抑制。

2.4 丁香酚的抑制效果

丁香酚抑制劑對病原菌抑制試驗結果見圖3，結果表明：丁香酚對FA抑制效果最為明顯，濃度為0.25%時可見其抑制效果顯著，高達57.14%，丁香酚濃度在0.25%~0.50%時，對FC的抑制效果顯著提高，對FA、FB、FD抑制效果增加較為緩慢。濃度在0.50%~1.00%范圍內，對FD菌種的抑制效果提高顯著，其余3種抑制效果增幅較小。當丁香酚濃度達到1.00%時，完全抑制FC菌株的生長，當濃度達到1.50%時，對FA、FD菌種皆完全抑制，此時對FB的抑制效果仍為較低水平。當濃度達到2.00%時，對4種菌株完全抑制。

圖2 愈創(chuàng)木酚抑制劑對菌絲長度影響

圖3 丁香酚抑制劑對菌絲長度影響

3 結 論

實驗結果表明，分離出的4種蘋果樹腐爛病病原菌中， FC致病力最高，F(xiàn)A致病力最低，愈創(chuàng)木酚及丁香酚的抑制試驗結果表明，愈創(chuàng)木酚的濃度達到5.50%時，可對4種病原菌進行全面抑制，而丁香酚濃度達到2.00%時就可達到同樣效果。由此可以看出，丁香酚、愈創(chuàng)木酚作為抑制劑對蘋果樹腐爛病病原菌均有抑制效果，其中丁香酚的抑制效果優(yōu)于愈創(chuàng)木酚。

實驗選用丁香酚及愈創(chuàng)木酚作為抑制劑進行果樹腐爛病病原菌的抑制試驗，作為酚類物質，丁香酚及愈創(chuàng)木酚具有揮發(fā)效果好、殘留量少、毒副作用小等突出特點，減少了對樹木的損害及對環(huán)境的不利影響。野外實際應用過程中，因其實際環(huán)境與實驗室環(huán)境存在差異，且丁香酚及愈創(chuàng)木酚具有揮發(fā)性，實際抑制效果與實驗結果將存在較大差異，在此理論依據(jù)基礎上，未來將對實際情況下的抑制條件進行具體研究。

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Separation, Detection and Suppression of Pathogenic Bacteria of Fruit Rot Disease in Heavy Frigid Regions in Northeast China

WANG Xue1, YU Jing-ni2, MA Xian-cheng2, LAN Ying1, ZHANG Yue-hua2*

(1. College of Science, Jiamusi University, Jiamusi 154007, China; 2. College of Life Science, Jiamusi University, Jiamusi 154007, China)

To detect the pathogenic bacterium and inhibition effects of phenolic compounds on fruit rot disease in heavy frigid regions in Northeast China, this experiment was conducted. Taking the horticulture base of 597 Farm in Heilongjiang Province as a case, strains at the lesion were separated and isolated from diseased orchards to detect the pathogen virulence by using eugenol and guaiacol as inhibition agents, and to explore the inhibitory effects on pathogenic bacteria. Altogether 4 pathogenic bacteria of fruit rot disease were separated, which were recorded as FA、FB、FC、FD, and the pathogenicity test experiment were carried out on them. Results showed that FC had the highest inhibitory effect, with its lesion diameter up to 2.56 cm, and the effectiveness of pathogenicity up to 76.67%; FA’s lesion diameter was 1.27 cm, with its pathogenicity only 43.33%. The pathogenic effect of FC was the highest, and the pathogenic effect of FA was the lowest. Inhibition test results also showed that 4 pathogenic bacteria could be fully suppressed. When eugenol concentration reached 2.0%, the same effect could be achieved as when the concentration of guaiacol reached 5.5%. So, eugenol and guaiacol could be used as inhibitors against fruit rot disease, and the inhibitory effect of eugenol was superior to that of guaiacol.

heavy frigid region; fruit rot disease; pathogenic bacterium; virulence; inhibition test

S436.6

A

2095-3704（2016）04-0224-04

2016-09-24

黑龍江省教育科學“十二五”規(guī)劃2015年度重點課題（GJB1215080）和佳木斯大學校長創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)基金項目（xzyf2014-13）

王雪，本科生，主要從事環(huán)境生物學研究，272963208@qq.com；

張躍華，副教授，博士，主要從事農(nóng)業(yè)微生物學研究，zhangyaohua_2008@163.com。