石榴分子生物學(xué)研究進(jìn)展

苑兆和

(南京林業(yè)大學(xué)南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心/南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，江蘇南京 210037)

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石榴分子生物學(xué)研究進(jìn)展

苑兆和

(南京林業(yè)大學(xué)南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心/南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，江蘇南京 210037)

石榴栽培歷史悠久，是重要的經(jīng)濟(jì)林木，是古老的藥用果樹。果實(shí)富含抗氧化功能物質(zhì)，臨床醫(yī)用和保健價(jià)值高，被譽(yù)為超級(jí)水果。石榴遺傳資源豐富，為育種工作提供大量素材。筆者對(duì)石榴的品質(zhì)發(fā)育，包括安石榴苷代謝、花青苷代謝和木質(zhì)素代謝進(jìn)行綜述，對(duì)遺傳多樣性研究進(jìn)行評(píng)述，并對(duì)NGS時(shí)代石榴分子生物學(xué)研究進(jìn)行展望。

石榴；安石榴苷；花青苷；木質(zhì)素；遺傳多樣性

石榴(Punicagranatum)是千屈菜科(Lythraceae)石榴屬(PunicaL.)落葉果樹[1]，起源中亞，是古老的保健水果，被譽(yù)為超級(jí)水果[2,3]。栽培歷史悠久。石榴適應(yīng)性強(qiáng)，在世界范圍內(nèi)廣泛栽培，被劃為國(guó)家規(guī)劃特色經(jīng)濟(jì)林樹種之一[4]。石榴果實(shí)富含花青苷、黃酮、安石榴苷等多酚類物質(zhì)，特別是安石榴苷等鞣花單寧類物質(zhì)臨床醫(yī)用和保健價(jià)值高，具有潛在的抗氧化、抗癌、抗菌等功能[5,6]。石榴果皮中，鞣花單寧類物質(zhì)含量較高。Han等[7]通過(guò)高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定，發(fā)現(xiàn)果皮中安石榴苷含量高達(dá)4.821mg/g，是果汁中含量的約15倍，籽粒中含量的30倍。隨著果實(shí)發(fā)育成熟，安石榴苷含量逐漸降低，說(shuō)明其代謝途徑中降解能力高于合成能力。對(duì)于安石榴苷等鞣花單寧類物質(zhì)分子代謝通路研究，目前進(jìn)展緩慢，只克隆到合成前期少數(shù)幾個(gè)基因[8]。石榴果實(shí)色澤發(fā)育是研究最深入的方向，目前已克隆到完整的花青苷代謝通路基因[8-10]和轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因[11]，并進(jìn)行擬南芥轉(zhuǎn)化驗(yàn)證，但尚缺乏對(duì)籽粒著色研究以及環(huán)境因素對(duì)MBW復(fù)合物調(diào)控果實(shí)著色影響的研究。籽粒軟硬度是重要的經(jīng)濟(jì)性狀，與木質(zhì)素代謝相關(guān)。張水明等[12]、曹丹琴等[13]分別克隆了石榴籽粒木質(zhì)素合成途徑的關(guān)鍵基因和轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。石榴耐鹽堿能力強(qiáng)，是海濱綠化優(yōu)良樹種。彭媛媛等[14]克隆并驗(yàn)證了石榴耐鹽相關(guān)基因GPX。對(duì)各種性狀的研究是為品種改良和育種做鋪墊，而收集與評(píng)估種質(zhì)資源是育種的前提。世界各國(guó)對(duì)石榴種質(zhì)資源的研究最多，通過(guò)分子標(biāo)記技術(shù)評(píng)估區(qū)域資源遺傳多樣性[15-19]。本課題組開展石榴全基因組測(cè)序項(xiàng)目，將為世界石榴分子遺傳學(xué)、分子代謝研究、發(fā)育生物學(xué)研究和生物信息學(xué)提供大數(shù)據(jù)支持，進(jìn)一步推動(dòng)石榴分子生物學(xué)研究。筆者對(duì)石榴品質(zhì)發(fā)育，包括安石榴苷代謝、花青苷代謝和木質(zhì)素代謝進(jìn)行綜述，對(duì)遺傳多樣性研究進(jìn)行評(píng)述，并對(duì)NGS(Next Gegeration Sequencing,二代測(cè)序或高通量測(cè)序)時(shí)代石榴分子生物學(xué)研究進(jìn)行展望。

1　 石榴品質(zhì)發(fā)育研究

1.1安石榴苷分子代謝通路研究

石榴是一種抗氧化能力極強(qiáng)的水果，果實(shí)抗氧化劑總濃度11.33mmol/100g，是藍(lán)莓(Vaccinumcorymbosum)的3.11倍，甜橙(Citrussinensis)的9.94倍，蘋果(Maluspumila)的39.07倍[20]。石榴抗氧化能力與總酚含量呈極顯著正相關(guān)(R2 = 0.90，P < 0.01)，其中鞣花單寧類物質(zhì)含量最高[5]，如安石榴苷(Punicalagins)、石榴皮鞣素(Punicalins)、Gallagic acid具有顯著的抗氧化、預(yù)防心血管疾病、抗癌、抗菌、抗感染、抗糖尿病等諸多功效，臨床醫(yī)學(xué)價(jià)值高。在市場(chǎng)消費(fèi)的水果中，石榴擁有最高濃度的安石榴苷[21]，它是已知分子量最大的酚類物質(zhì)，可降解為鞣花酸，每個(gè)分子內(nèi)有16個(gè)酚式羥基，是抗氧化性最強(qiáng)的酚類物質(zhì)，也是石榴果實(shí)中最主要的酚類物質(zhì)[2,6]。

安石榴苷是鞣花單寧代謝途徑的中間產(chǎn)物，鞣花單寧途徑上游與莽草酸途徑上游共用[22](圖1)。在植物質(zhì)體中，磷酸烯醇式丙酮酸和赤蘚糖-4-磷酸在3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶(3-deoxy-D-arabinoheptulosonic acid-7-phosphate synthase，DAHPS)催化下合成3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸(DAHP)?；谛蛄邢嗨菩?，DAHPS分為兩類：I類包含AroF、AroG、AroH、CM-DAHPS；II類包含芳香氨基酸(aromatic amino acids，AAAs)結(jié)合元件，植物中DAHPS屬此類型[22]。I類基因在植物進(jìn)化過(guò)程中缺失[23]。在擬南芥、番茄、土豆和石榴中均分離到DAHPS基因。

3-脫氫奎尼酸合成酶(3-dehydroquinic acid synthase，DHQS)用Co2+和NAD+將DAHP合成3-脫氫奎尼酸，然后在3-脫氫奎尼酸脫氫酶(3-dehydroquinic acid dehydratase，DHQD)作用下生成3-脫氫莽草酸(3-dehydroshikimic acid，DHS)[23]。在鞣花單寧途徑[24,25]中，DHS 在莽草酸脫氫酶(shikimate dehydrogenase，SD)催化下生成沒(méi)食子酸。在細(xì)胞質(zhì)中，沒(méi)食子酸在 UDP 葡糖基轉(zhuǎn)移酶(UDP-glucose:gallate glucosyltransferase，UGT)作用下生成β-葡萄糖沒(méi)食子鞣苷(β-glucogallin)[26,27]。β-葡萄糖沒(méi)食子鞣苷在 β-葡萄糖沒(méi)食子鞣苷O-沒(méi)食子?；D(zhuǎn)移酶(β-glucogallin O-galloyltransferase，GLUG)作用下，生成二沒(méi)食子酰葡萄糖(digalloylglucose)。二沒(méi)食子酰葡萄糖在沒(méi)食子?；D(zhuǎn)移酶(Galloyltransferase，GALT)作用下經(jīng)多次酶促反應(yīng)，生成五沒(méi)食子酰葡萄糖(pentagalloylglucose)。五沒(méi)食子酰葡萄糖在五沒(méi)食子酰葡萄糖氧化還原酶(Pentagalloylglucose oxygen oxidoreductase，POR)作用下合成鞣花單寧[2]。在石榴安石榴苷分子代謝機(jī)制研究中，目前主要集中在部分關(guān)鍵基因的克隆與分析，對(duì)UGT基因進(jìn)行亞細(xì)胞定為分析[26]，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)(RNA-seq)挖掘相關(guān)結(jié)構(gòu)基因[8]。

圖1　石榴鞣花單寧合成途徑簡(jiǎn)圖

1.2花青苷代謝分子機(jī)理研究

石榴果實(shí)色澤是重要的市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)性狀，表皮顏色主要由花青苷類型與含量決定[11, 28, 29]。花青苷是植物液泡中可溶性色素，依賴pH變化而呈現(xiàn)紅色、紫色和藍(lán)色，是果肉[30]、果皮[31]、花[32]、葉[33]中的主要色素。花青苷在果實(shí)成熟階段大量積累，是果實(shí)成熟的重要指標(biāo)[34]，表現(xiàn)為不同顏色，吸引昆蟲覓食[35]。另外花青苷可以抵御生物脅迫與非生物脅迫[36]。

花青苷是類黃酮生物合成途徑花青苷分支的重要產(chǎn)物之一[37,38]。如圖2所示，香豆酰輔酶A在查爾酮合成酶(chalcone synthases，CHS)的作用下合成查爾酮，然后在查爾酮異構(gòu)酶(chalcone isomerase，CHI)的作用下合成柚皮素。在類黃酮3羥化酶(flavonoid 3-hydroxylase，F(xiàn)3H)、類黃酮3’羥化酶(flavonoid 3’-hydroxylase，F(xiàn)3’H)和類黃酮3’5’羥化酶(flavonoid 3’5’-hydroxylase，F(xiàn)3’5’H)的催化下合成二氫黃酮醇，在二氫黃酮醇4還原酶(dihydroflavonol 4-reductase，DFR)的作用下合成無(wú)色花青素，然后在花青素合成酶(anthocyanidin synthase，ANS)和無(wú)色花青素加雙氧酶(leucoanthocyanidin dioxygenase，LDOX)的作用下合成花青素。在尿苷二磷酸葡萄糖類黃酮糖苷轉(zhuǎn)移酶(UDPG-flavonoid glucosyl transferase，UFGT)的催化下合成花青苷，在氧位甲基轉(zhuǎn)移酶(O-methyltransferase，OMT)的催化下合成氧位甲基化的花青苷[39]。

圖2　花青苷代謝途徑 (圖片引自招雪晴博士學(xué)位論文[38] )

在石榴著色基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究方面，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子MBW(MYB-BHLH-WD40)復(fù)合物是影響果皮著色的主要因子。Ono等[8]首次通過(guò)RNA-seq技術(shù)在轉(zhuǎn)錄組水平構(gòu)建了石榴花青苷代謝通路。目前已在石榴果皮中克隆到花青苷途徑全部結(jié)構(gòu)基因[10,40]和轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子MBW復(fù)合物。[11,29]Khaksar等[11]在黑皮石榴中發(fā)現(xiàn)PgMYB轉(zhuǎn)錄水平與果實(shí)色澤度呈正相關(guān)，猜測(cè)該基因可以提高花青苷積累量。紅皮石榴花青素衍生物含量與PgWD40 表達(dá)量呈正相關(guān)，PgWD40轉(zhuǎn)錄水平與PgDFR和PgLDOX表達(dá)水平呈正相關(guān)，而且這三種基因與PgMYB和PgbHLH表達(dá)水平也呈正相關(guān)[29]。Rouholamin等[9]通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)驗(yàn)證MBW基因表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)PgBHLH在白皮和綠皮石榴中表達(dá)量最高，在紅皮和黑皮石榴中最低；PgMYB在綠皮石榴中累積表達(dá)最大，在紅皮中最小；PgDFR基因在黑皮石榴中表達(dá)量最高，在白皮石榴中表達(dá)最低。Ben-Simhon等[41]在白皮石榴中發(fā)現(xiàn)PgLDOX基因編碼區(qū)插入片段導(dǎo)致白皮中無(wú)花青苷積累。此外，Harel-Beja等[17]構(gòu)建了石榴高密度遺傳圖譜，通過(guò)數(shù)量性狀位點(diǎn)(QTL)技術(shù)關(guān)聯(lián)分析果實(shí)性狀，共得到5個(gè)籽粒著色相關(guān)位點(diǎn)(aril color 1-1、aril color 1-2、aril color 2-1、aril color 3-1和aril color 5-1)。

在蛋白組學(xué)方面，目前發(fā)現(xiàn)細(xì)胞色素b6-f復(fù)合體(sport 0013)、葉綠素 a/b 結(jié)合蛋白(sport 5108)和果糖激酶2-like(sport 0503)可能與果皮顏色變化相關(guān)；半胱氨酸合酶1(sport 1402)可能對(duì)提高石榴的抗氧化脅迫能力起到了重要作用[42]。

1.3木質(zhì)素分子合成途徑研究

石榴籽粒軟硬程度是重要的果實(shí)品質(zhì)，軟籽石榴價(jià)值高，需求量大。籽粒軟硬度涉及木質(zhì)素代謝過(guò)程。木質(zhì)素是儲(chǔ)存在特殊細(xì)胞細(xì)胞壁中的多酚聚合物。植物進(jìn)化中木質(zhì)素的出現(xiàn)，與泥盆紀(jì)時(shí)期(Devonian)維管植物的出現(xiàn)一致。木質(zhì)素的合成與物種類型、發(fā)育時(shí)期和細(xì)胞類型相關(guān)。在不同細(xì)胞類型分化中或應(yīng)對(duì)特殊環(huán)境變化時(shí)，細(xì)胞壁出現(xiàn)木質(zhì)化。木質(zhì)素在正確時(shí)間儲(chǔ)存在不同類型細(xì)胞中，是植物適應(yīng)環(huán)境和行使功能所必需。種子發(fā)育過(guò)程中，珠被會(huì)分化成由特殊細(xì)胞組成的不同細(xì)胞層，用于保護(hù)種皮或外種皮。種皮細(xì)胞發(fā)育成木質(zhì)化次生細(xì)胞，以強(qiáng)化外種皮表面。

木質(zhì)素單體前體是由苯丙氨酸在質(zhì)體中合成[43](圖3)。肉桂酸在肉桂酸-4-羥化酶(cinnamate 4-hydroxylase，C4H)催化下合成對(duì)香豆酸，然后在4-香豆酰輔酶A連接酶(4-coumarate:CoA ligase，4CL)催化下合成4-香豆酰輔酶A。對(duì)羥化肉桂?；o酶A：奎尼酸/莽草酸對(duì)羥化肉桂酰基輔酶A轉(zhuǎn)移酶(p-hydroxycinnamoyl-CoA:quinate/shikimate p-hydroxycinnamoyltransferase，HCT)催化4-香豆酰輔酶A合成對(duì)羥化肉桂酰基奎尼酸/莽草酸。咖啡?？崴?莽草酸在對(duì)香豆酸3-羥化酶(p-coumarate 3-hydroxylase，C3H)催化下由對(duì)羥化肉桂酰基奎尼酸/莽草酸合成，然后在HCT催化下合成咖啡酰輔酶A?？Х弱］o酶A在咖啡酰輔酶A 氧位甲基化轉(zhuǎn)移酶(caffeoyl-CoA O-methyltransferase，CCoAOMT)催化下合成阿魏酰輔酶A，在肉桂酸輔酶A還原酶(cinnamoyl-CoA reductase，CCR)催化下合成咖啡酰乙醛?？Х弱Ｒ胰┰谌夤鹚岽蓟摎涿?(cinnamyl alcohol dehydrogenase，CAD)催化下合成咖啡酰乙醇，然后在咖啡酸氧位甲基化轉(zhuǎn)移酶(caffeic acid O-methyltransferase，COMT)催化下合成松柏醇。松柏醇先后在阿胃酸5-羥化酶(ferulate 5-hydroxylase，F(xiàn)5H)和COMT催化下合成芥子醇。松柏醇在尿苷二磷酸-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(UDP-glucosyltransferase，UGT)催化下合成木質(zhì)素G單元，芥子醇在UGT催化下合成木質(zhì)素S單元。

圖3　木質(zhì)素合成途徑 (引自Jaime Barros et al.[43])

COMT是木質(zhì)素途徑下游酶，實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 分析表明，PgCOMT在‘紅玉石籽’、‘粉皮’、‘會(huì)理軟籽’、‘蒙自甜’和‘突尼斯軟籽’石榴種皮中的相對(duì)表達(dá)量與石榴籽粒硬度較為一致；隨著石榴種皮的發(fā)育其表達(dá)量先下降后上升[12]。曹丹琴等[13]克隆了石榴種皮木質(zhì)素合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因PgMYB，并進(jìn)行表達(dá)分析。

2　遺傳多樣性研究

2.1分子標(biāo)記開發(fā)與應(yīng)用

目前在石榴遺傳多樣性研究中使用的分子標(biāo)記有：AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphisms，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性)[44-49]、SNP(Single-Nucleotide Polymorphism，單核苷酸多態(tài)性)[17,50]、SSR(Simple Sequence Repeats，簡(jiǎn)單重復(fù)序列)[51]、ISSR(Inter Simple Sequence Repeat，簡(jiǎn)單重復(fù)序列間隔)[18]、RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA，隨機(jī)擴(kuò)增 DNA 多態(tài)性)[52]、隨機(jī)擴(kuò)增微衛(wèi)星多態(tài)性(Random Amplified Microsatellite Polymorphism，RAMP)[53]、SRAP(Sequence Related Amplified Polymorphism，序列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性)[54]和DNA條形碼技術(shù)[15]。RAMP適合對(duì)遺傳背景模糊的物種進(jìn)行遺傳分析。在第二代標(biāo)記技術(shù)中，AFLP相較于其他標(biāo)記可以掃描全基因組，多態(tài)性高、可重復(fù)性好，但操作復(fù)雜。SNP是第三代分子標(biāo)記技術(shù)，基于PCR擴(kuò)增和序列測(cè)序，探測(cè)范圍廣，多態(tài)性更高，操作簡(jiǎn)單。各種標(biāo)記技術(shù)，在石榴種質(zhì)資源遺傳多樣性、遺傳圖譜等方面應(yīng)用廣泛(表1)。

2.2石榴遺傳資源特點(diǎn)

石榴起源中亞，適應(yīng)性強(qiáng)，分布廣。世界石榴遺傳多樣性豐富，總體分為兩大類群。Ophir等[50]使用SNP標(biāo)記對(duì)采自以色列、印度、伊朗、中國(guó)、美國(guó)、土耳其、西班牙、地中海地區(qū)等106個(gè)石榴栽培品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)中國(guó)、印度和伊朗地區(qū)的石榴品種和不可食用觀賞石榴Nana聚為G1，其它地區(qū)石榴聚為G2。G2組分為2個(gè)亞組：G2.1包含Wonderful相關(guān)品種，G2.2又分為2個(gè)次亞組(G2.2.1和G2.2.2)。起源地中海流域、中亞和卡利福尼亞地區(qū)的石榴聚為G2.2.1。G2.2.2可能是雜交群體，如‘早紅甜’石榴具有深紅色皮和籽、甜度高和軟籽粒優(yōu)良性狀。石榴兩大組分類也與地區(qū)分布相關(guān)(圖4)。此外，Al-Sadi等的研究也支持地理起源證據(jù)。阿曼位于石榴兩大中心起源地也門和伊朗之間，是重要的石榴產(chǎn)區(qū)。Al-Sadi等[44]運(yùn)用AFLP標(biāo)記技術(shù)對(duì)5個(gè)阿曼地區(qū)的石榴品種、5個(gè)伊朗品種、1個(gè)也門品種、1個(gè)印度品種、1個(gè)黎巴嫩品種和1個(gè)西班牙品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)這些品種可能擁有共同起源，在過(guò)去國(guó)際貿(mào)易中引種傳播。

圖4　世界石榴遺傳群體分布圖(引自O(shè)phir等[50])

雖然對(duì)世界石榴栽培品種遺傳多樣性研究較多，但對(duì)野生群體的研究較少。Singh等[51]使用SSR標(biāo)記對(duì)印度地區(qū)51個(gè)野生石榴品種和37個(gè)栽培品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)栽培群體與喜馬拉雅山麓處自然生長(zhǎng)的群體親緣關(guān)系更近。該研究補(bǔ)充了世界石榴野生群體與栽培群體間親緣關(guān)系的空白，為石榴育種提供了寶貴的資料。

中國(guó)是石榴栽培最多的國(guó)家之一，苑兆和研究團(tuán)隊(duì)[2]依據(jù)石榴產(chǎn)區(qū)地理、氣候及生態(tài)條件，將石榴栽培區(qū)劃分為山東栽培區(qū)、河南栽培區(qū)、安徽栽培區(qū)、陜西栽培區(qū)、四川栽培區(qū)、新疆栽培區(qū)、云南栽培區(qū)和河北栽培區(qū)。Yuan等[55]利用熒光標(biāo)記 AFLP對(duì)中國(guó)山東、安徽、陜西、河南、云南和新疆 6 個(gè)栽培石榴群體的 85 個(gè)品種類型進(jìn)行遺傳多樣性研究，發(fā)現(xiàn)群體間的遺傳分化系數(shù)為0.2018，群體間的遺傳多樣性依次為河南群體>新疆群體>陜西群體>安徽群體>山東群體>云南群體。

此外，石榴高密度遺傳圖譜的建立將為分子輔助育種提供平臺(tái)。Harel-Beja等[17]通過(guò)SNP標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建了首張高密度石榴遺傳圖譜，并通過(guò)QTL技術(shù)關(guān)聯(lián)分析果實(shí)大小、風(fēng)味、色澤和籽粒軟硬度等果實(shí)品質(zhì)性狀。Singh等[51]鑒定了4個(gè)與果實(shí)重量、酸度、白葉枯病性狀的關(guān)聯(lián)標(biāo)記。

3　展望

NGS時(shí)代，基因組和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)應(yīng)用越來(lái)越多，石榴分子生物學(xué)研究將會(huì)達(dá)到新的高度。苑兆和研究團(tuán)隊(duì)完成了石榴全基因組測(cè)序項(xiàng)目，為深入研究石榴功能基因提供大數(shù)據(jù)支持，將有力推動(dòng)世界石榴分子生物學(xué)研究。

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2016-06-30

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31272143)；南京林業(yè)大學(xué)高層次人才科研啟動(dòng)基金(GXL2014070)；江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(KYLX16_0857)；南京林業(yè)大學(xué)優(yōu)秀博士學(xué)位論文創(chuàng)新基金項(xiàng)目; 江蘇省高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程項(xiàng)目(PAPD)。

苑兆和(1963-)，男，山東招遠(yuǎn)人，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)榻?jīng)濟(jì)林培育與分子生物學(xué)研究。E-mail: zhyuan88@hotmail.com

S665.4

A

1002-2910(2016)05-0001-08