基于不同測(cè)序技術(shù)的生物群落結(jié)構(gòu)及功能菌分析

蔡言安,李 冬,畢學(xué)軍,曾輝平,張 杰,3

?

基于不同測(cè)序技術(shù)的生物群落結(jié)構(gòu)及功能菌分析

蔡言安,李 冬2*,畢學(xué)軍1,曾輝平2,張 杰2,3

(1.青島理工大學(xué)環(huán)境與市政工程學(xué)院,山東 青島 266033；2.北京工業(yè)大學(xué)水質(zhì)科學(xué)與水環(huán)境恢復(fù)工程北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100124；3.哈爾濱工業(yè)大學(xué)城市水資源與水環(huán)境國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江 哈爾濱 150090)

分別采用克隆文庫(kù)和高通量測(cè)序技術(shù),解析生物去除鐵錳氨濾池內(nèi)微生物的群落結(jié)構(gòu)和功能菌多樣性,并探討不同測(cè)序手段的差異.高通量測(cè)序獲得15057條有效序列、共32個(gè)分類(lèi)綱,克隆文庫(kù)測(cè)序涵蓋9個(gè)具有明確分類(lèi)地位的綱(75條序列),前者能揭示更為豐富的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性.功能菌(鐵錳氧化細(xì)菌和硝化細(xì)菌)分析過(guò)程中,一些功能菌屬在克隆文庫(kù)中出現(xiàn),而在高通量測(cè)序中未檢測(cè)到,反之亦然.與單一的測(cè)序手段相比,二者相結(jié)合能更好地揭示功能細(xì)菌的分布特點(diǎn).

生物濾池；硝化作用；高通量測(cè)序；克隆文庫(kù)

在生物水處理領(lǐng)域,生物反應(yīng)器內(nèi)的功能微生物是研究的熱點(diǎn).分子生物學(xué)技術(shù)手段的應(yīng)用,使研究者對(duì)生物反應(yīng)器的運(yùn)行效果、內(nèi)在反應(yīng)機(jī)理、微生物群落演替等有了深入地了解.

聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)(PCR)是分子生物技術(shù)分析中至關(guān)重要的一步,其目的是采用引物擴(kuò)增目標(biāo)細(xì)菌的16S rRNA分子片段或功能基因片段,實(shí)現(xiàn)對(duì)微生物樣品中功能細(xì)菌的快速定性定量分析.分子片段特異引物可定向擴(kuò)增某一菌屬內(nèi)的細(xì)菌,而功能基因擴(kuò)增引物卻能擴(kuò)增生態(tài)功能相近、在親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的多個(gè)種屬內(nèi)的細(xì)菌[1].例如,功能基因引物Amoa1F/Amoa2R可擴(kuò)增好氧氨氧化菌AOB菌屬(、)的功能基因片段;NIT3r/338f可定向擴(kuò)增的16S rRNA基因片段、Ntspa685r/338f定性擴(kuò)增的16S rRNA基因片段[2-3].

對(duì)于鐵錳氧化細(xì)菌,采用16S rRNA分子片段特異性引物或功能基因擴(kuò)增引物研究其結(jié)構(gòu)多樣性均存在一定的困難.首先,所設(shè)計(jì)的16S rRNA分子片段擴(kuò)增引物(PS-1/PSP-6)多針對(duì)于屬,無(wú)法同時(shí)分析其他的鐵錳氧化菌屬(包括以及等),并且該引物可非特異性擴(kuò)增非屬的細(xì)菌[4].其次,多銅氧化酶基因()被認(rèn)為是參與生物錳氧化的功能基因,但其擴(kuò)增引物(CumAF/CumARdg)同樣存在非特異性擴(kuò)增的缺陷[5].

因此,考慮到上述鐵錳氧化菌擴(kuò)增引物存在的一系列問(wèn)題,本文基于細(xì)菌通用引物,分別采用克隆文庫(kù)和高通量技術(shù)分析生物濾池內(nèi)鐵錳氧化菌和硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性,并對(duì)比探討了二者的各自分析特點(diǎn).

1 材料方法

1.1 生物濾池反應(yīng)器

生物濾池反應(yīng)器由圓柱體有機(jī)玻璃制成,總高度3m、內(nèi)徑185mm;石英砂為濾料、濾層高度130cm,重力流過(guò)濾、液上水頭保持30~40cm.生物濾池已成熟運(yùn)行數(shù)年[6],本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,模擬進(jìn)水鐵、錳、氨氮濃度分別為1.5~2.5mg/L、0.6~ 0.8mg/L、1.0~1.2mg/L,生物濾池對(duì)污染物去除率均保持在95%以上.

1.2 基因組DNA提取

DNA提取過(guò)程:自生物濾層內(nèi)取10g泥砂混合濾料,置于10mL滅菌離心管中,分別加入2.7mLDNA提取液、50μL蛋白酶K (Proteinase K,30g/L)、溶菌酶(lysozyme,20g/L);將離心管在37℃水浴振蕩器中震蕩30min、轉(zhuǎn)速22;隨后加入0.3mL濃度20%的SDS、水浴65℃、2h.

將上述離心管室溫冷卻后8000r/min離心10min,取上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管、記錄體積;加入等體積氯仿/異戊醇(24:1)混合、8000r/min離心10min;吸取上清液至另一離心管.繼續(xù)加入0.6倍體積的異丙醇,–20℃過(guò)夜后10000r/min離心5min;去上清液后繼續(xù)10000r/min、離心5min;再次盡量吸去上清液,將離心管內(nèi)沉淀物置于通風(fēng)櫥內(nèi)晾干;最后,以300~500μLTE緩沖液溶解后,收集至1.5mL離心管保存.

瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)得到的基因組DNA溶液,若DNA分子跑膠拖帶嚴(yán)重,則采用基因組純化試劑盒予以純化.

1.3 PCR擴(kuò)增過(guò)程

以上述所得基因組DNA溶液為模板、1492R(5‘-TACCTTGTTAYGACTT-3’)和27F (5‘-AGAGTTTGATYMTGGCTCAG-3’)為特異引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增.按照TaKaRa酶說(shuō)明書(shū)配制PCR反應(yīng)體系50μL,擴(kuò)增采用降落式PCR程序:初始94℃變性5min、30個(gè)循環(huán)擴(kuò)增:94 ℃變性45s、58℃退火45s(每個(gè)循環(huán)退火溫度降低0.1℃)、72℃延伸1min,72℃延伸7min.

擴(kuò)增均設(shè)3次平行,所獲得PCR反應(yīng)產(chǎn)物片段經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后合并于一只離心管內(nèi).采用純化試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收后,再次采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)回收片段.最終的目的基因片段于4℃條件下保存,并于2d內(nèi)完成后續(xù)克隆測(cè)序試驗(yàn).

1.4 克隆文庫(kù)構(gòu)建

克隆采用的試劑盒與感受態(tài)細(xì)胞試劑盒均購(gòu)自TaKaRa公司,按照操作說(shuō)明書(shū)對(duì)上述所獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆連接.克隆菌株經(jīng)藍(lán)白斑后,選取陽(yáng)性菌株過(guò)夜搖菌培養(yǎng)、菌液送至商業(yè)生物公司測(cè)序(生工,上海).

將測(cè)序序列采用軟件RDP classifier version 2.6進(jìn)行分類(lèi)地位劃分,相似度大于97%的序列被劃分為一個(gè)(OTU),同時(shí)與基因數(shù)據(jù)庫(kù)中序列比對(duì)分類(lèi)地位最接近的菌株(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).Shannon指數(shù)通過(guò)EstimateS軟件計(jì)算獲得.

1.5 高通量測(cè)序

Illumina Miseq測(cè)序平臺(tái)測(cè)序通量高、快速經(jīng)濟(jì),其單個(gè)微生物樣品分析的商業(yè)成本與克隆文庫(kù)相當(dāng).高通量庫(kù)容通常可提供上萬(wàn)條序列數(shù),而克隆文庫(kù)的庫(kù)容卻含有數(shù)十條或數(shù)百條序列,高通量的單個(gè)序列成本遠(yuǎn)低于克隆文庫(kù).

高通量測(cè)序由商業(yè)服務(wù)公司完成(生工,上海).基于MiSeq測(cè)序平臺(tái)(美國(guó)Illumina公司),以所提取基因組DNA為模板,341F (5‘-CCTACG- GGNGGCWGCAG-3’)和805R (5‘-GACTACH- VGGGTATCTAATCC-3’)為引物,擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因 V3-V4區(qū)序列.共獲得15057條有效序列,將相似度大于97%的序列劃分為一個(gè)OUT,采用mothur軟件(http://www.mothur.org/)計(jì)算Shannon指數(shù)并在線(xiàn)比對(duì)(http://www.arb- silva.de) 分類(lèi)地位最接近的菌株.

2 結(jié)果與討論

2.1 生物群落結(jié)構(gòu)對(duì)比分析

指標(biāo)通常用以估算生物群落結(jié)構(gòu)多樣性,其值高低代表群落結(jié)構(gòu)多樣性的高低.克隆文庫(kù)分析過(guò)程中,通過(guò)EstimateS軟件分析得到的指標(biāo)曲線(xiàn)相對(duì)比較平滑,表明序列條數(shù)已覆蓋樣品內(nèi)的大部分微生物,其Shannon值為3.29;高通量分析過(guò)程中, Shannon曲線(xiàn)不再顯著變化時(shí),其值為5.27.由Shannon值分析可知,采用高通量測(cè)序技術(shù)更能體現(xiàn)微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性.

圖1(a)中,在綱的OTU分類(lèi)水平上,克隆文庫(kù)中克隆子序列(75條)共覆蓋12個(gè)綱、其中9個(gè)綱有明確的分類(lèi)地位:α變形綱(Alphaproteobacteria,30.7%)、β變形綱(Betaproteobacteria,16%)、γ變形綱(Gammaproteobacteria,13.3%)、硝化螺旋菌綱(Nitrospira,12%)、δ變形綱(Deltaproteobacteri- a,5.3%)、黃桿菌綱(Flavobacteria,4%)、酸桿菌綱(Acidobacteria,4%)、豐佑菌綱(Opitutae,2.7%)、鞘脂桿菌綱(Sphingobacteria,1.3%).

圖1(b)中,高通量所得序列(15057條)涵蓋32個(gè)綱,其中15個(gè)綱的序列均比例大于0.6%、占總綱的96.1%,可認(rèn)為此15類(lèi)綱是微生物的優(yōu)勢(shì)類(lèi)群.分析發(fā)現(xiàn),這15個(gè)分類(lèi)綱中包含了克隆文庫(kù)所獲得的9個(gè)分類(lèi)綱;其中α變形綱占23.3%、β變形綱20.5%、γ變形綱6.2%、硝化螺旋菌綱20.2%、δ變形綱1.3%、黃桿菌綱1.2%、酸桿菌綱3.2%、豐佑菌綱0.9%、鞘脂桿菌綱12.4%,占總綱比例為89.2%,表明上述9類(lèi)綱在15個(gè)主導(dǎo)綱中占有主體地位.因此,與克隆文庫(kù)技術(shù)相比,高通量技術(shù)在讀取序列方面具有信息量大的優(yōu)點(diǎn),使群落結(jié)構(gòu)展現(xiàn)出更為豐富的多樣性、且Shannon值顯著提高,但克隆文庫(kù)所獲得的微生物群落結(jié)構(gòu)同樣能體現(xiàn)出微生物群落的主體結(jié)構(gòu),盡管兩者的具體比例值有所不同.

生物濾池內(nèi)的功能細(xì)菌,包括硝化細(xì)菌、鐵錳氧化細(xì)菌,是濾池發(fā)揮效能的關(guān)鍵因子.對(duì)比分析克隆文庫(kù)和高通量測(cè)序技術(shù)在解析微生物群落結(jié)構(gòu)方面差異的同時(shí),仍需探究不同分析方法對(duì)功能菌檢測(cè)的影響作用.

2.2 硝化細(xì)菌分析

硝化細(xì)菌包括好氧氨氧化細(xì)菌(AOB)和亞硝酸鹽氧化細(xì)菌(NOB),是生物濾池內(nèi)氨氮去除的功能細(xì)菌,表1統(tǒng)計(jì)了2種分析方法對(duì)AOB和NOB的檢測(cè)情況.

AOB常見(jiàn)的菌屬包括亞硝化單胞菌屬()和亞硝化螺旋菌屬(),二者均出現(xiàn)在克隆文庫(kù)內(nèi),在高通量分析庫(kù)中卻并未出現(xiàn)與亞硝化螺旋菌屬相關(guān)的細(xì)菌序列.Li等[7]同樣采用克隆文庫(kù)和T-RFLP技術(shù)手段分析了鐵錳氨凈化濾池內(nèi)生物群落結(jié)構(gòu),并沒(méi)有檢測(cè)到AOB,且認(rèn)為氨氮的氧化歸功于其他種類(lèi)的微生物.一方面,本文試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證明了生物濾池內(nèi)存在與氨氮氧化相關(guān)的AOB菌;另一方面,結(jié)果表明不同測(cè)序技術(shù)在功能菌分析方面存在差異.

表1 基于克隆文庫(kù)與高通量測(cè)序的硝化細(xì)菌分析Table 1 Analysis of nitrifiers in the processes of clone library and high throughout sequencing

分析NOB可知,硝化螺旋菌屬()在克隆文庫(kù)和高通量測(cè)序庫(kù)中均占有極高的比例,分別高達(dá)30.7%、20.2%,而常見(jiàn)的硝化菌屬()卻未檢測(cè)到.有研究表明這是由于不同類(lèi)型反應(yīng)器對(duì)菌群不同的優(yōu)勢(shì)選擇造成的[8-9].此外,是一種新型的亞硝酸氧化菌屬[10],在高通量序列中有2.5%的序列劃分在此屬內(nèi);而克隆文庫(kù)中未檢測(cè)到此類(lèi)菌群.

此外,克隆文庫(kù)分析過(guò)程中NOB序列數(shù)所占比例顯著高于AOB,二者比例分別為30.7%、5.3%;高通量分析過(guò)程中二者比例分別為22.7%、7.3%. 由于氨氧化古菌(AOA)亦能將氨氮氧化為亞硝酸鹽氮[11], AOA可能存在于生物濾池內(nèi), 而本研究中未對(duì)AOA予以分析.因此,今后研究AOB、AOA、NOB三者的相對(duì)比例能更好的體現(xiàn)參與硝化過(guò)程的功能微生物.

2.3鐵錳氧化菌分析

中性pH值水體條件下,鐵在濾層內(nèi)以化學(xué)溶解氧接觸氧化去除為主,而錳僅可由生物氧化作用去除,表2統(tǒng)計(jì)了與鐵錳氧化相關(guān)的菌群.

嘉利翁氏菌屬()是一類(lèi)鐵氧化相關(guān)的菌,僅能氧化鐵離子.鐵極易被溶解氧化學(xué)接觸氧化,有研究發(fā)現(xiàn)高達(dá)94%以上的鐵是通過(guò)化學(xué)途徑去除[12],但克隆文庫(kù)中檢測(cè)到嘉利翁氏菌屬,表明生物氧化作用不可忽視,與Michalakos等[13]的反應(yīng)器運(yùn)行數(shù)據(jù)表現(xiàn)一致;但該類(lèi)菌的序列在高通量序列中未檢測(cè)到.

表2 基于克隆文庫(kù)與高通量測(cè)序的鐵錳細(xì)菌分析Table 2 Analysis of Fe- and Mn-related bacteria in the processes of clone library and high throughout sequencing

泉發(fā)菌屬()、纖發(fā)菌屬()與生絲微菌屬()是常見(jiàn)的錳氧化菌屬,三者同時(shí)出現(xiàn)在高通量序列中,而僅有泉發(fā)菌屬出現(xiàn)克隆文庫(kù)中.Hope等[14]認(rèn)為纖發(fā)菌屬是反應(yīng)器內(nèi)錳氧化的主體優(yōu)勢(shì)菌屬,但Burger等[15]基于四座實(shí)際規(guī)模生物濾池分析了錳氧化細(xì)菌,認(rèn)為錳的去除與纖發(fā)菌屬的存在沒(méi)有直接聯(lián)系、其他菌屬亦可完成錳的去除,這與本文高通量測(cè)序結(jié)果相一致,即泉發(fā)菌屬、纖發(fā)菌屬、生絲微菌屬共同參與了錳氧化過(guò)程.

另外,一些與鞘氨醇單胞菌屬()、黃桿菌屬()、紫色桿菌屬()、不動(dòng)桿菌屬()相關(guān)的細(xì)菌被發(fā)現(xiàn)具有錳氧化能力,并且這些細(xì)菌多被發(fā)現(xiàn)在錳沉積物或錳礦環(huán)境中[16-17],在凈水領(lǐng)域中鮮有報(bào)道.與這些菌屬相關(guān)的細(xì)菌均出現(xiàn)在克隆文庫(kù)中,而僅有黃桿菌出現(xiàn)在高通量序列中.

總體而言,在功能菌分析過(guò)程中,一些菌屬在克隆文庫(kù)中出現(xiàn),而在高通量測(cè)序中未出現(xiàn),反之亦然.分析其原因,這兩種測(cè)序技術(shù)不能完全將其表達(dá);其次,由PCR擴(kuò)增過(guò)程的隨機(jī)性和擴(kuò)增效率不同造成的.因而,采用克隆文庫(kù)和高通量測(cè)序相結(jié)合的技術(shù)手段可以相互彌補(bǔ)、更全面的解析功能菌的多樣性.

3 結(jié)論

3.1 與克隆文庫(kù)技術(shù)相比,高通量技術(shù)測(cè)序數(shù)量大、微生物分類(lèi)豐富,更能體現(xiàn)微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性,但前者仍能體現(xiàn)微生物的優(yōu)勢(shì)群落結(jié)構(gòu).單一的技術(shù)手段在解析功能細(xì)菌(硝化細(xì)菌和鐵錳氧化細(xì)菌)方面存在差異,克隆文庫(kù)與高通量技術(shù)相結(jié)合可更全面了解功能細(xì)菌的分布.

3.2 亞硝化單胞菌與亞硝化螺旋菌參與了氨氮氧化,硝化螺旋菌屬與新型的硝化菌屬參與了亞硝酸鹽的氧化.一些在凈水領(lǐng)域鮮有報(bào)道的鐵錳氧化菌屬,如鞘氨醇單胞菌屬、黃桿菌屬、紫色桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬等在本研究中均被檢測(cè)到.

梁麗華,左劍惡.反硝化功能基因-檢測(cè)反硝化菌種群結(jié)構(gòu)的分子標(biāo)記 [J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2009,(4):627-633.

劉 濤.基于亞硝化的全程自養(yǎng)脫氮工藝(CANON)效能及微生物特征研究 [D]. 哈爾濱:哈爾濱工業(yè)大學(xué), 2013.

Regan J M, Harrington G W, Noguera D R.-and nitrite-oxidizing bacterial communities in a pilot-scale chloraminated drinking water distribution system [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2002,68(1):73-81.

Siering P, Ghiorse W.-targeted probes for detection of iron-and manganese- oxidizing sheathed bacteria in environmental samples [J]. Applied and Environmental Microbiology, 1997,63(2):644- 651.

Francis C A, Tebo Bmulticopper oxidase genes from diverse Mn(II)-oxidizing and non-Mn(II)-oxidizingstrains [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2001,67(9): 4272-4278.

蔡言安,李 冬,曾輝平,等.[J]. 中國(guó)環(huán)境科學(xué), 2014,34(8):1993-1997.

Li X K, Chu Z R, Liu Y J, et al.-scale biofilters treating iron, manganese and ammonia containing groundwater in Harbin, China [J]. Bioresource Technology, 2013(147):234-239.

Regan J M, Harrington G W, Baribeau H, et al.-scale chloraminated distribution systems [J]. Water Research, 2003,37(1):197-205.

Liu T, Li D, Zeng H, et al. Distribution and genetic diversity of functional microorganisms in different CANON reactors [J]. Bioresource Technology, 2012(123):574-580.

Alawi M, Lipski A, Sanders T, et al. Cultivation of a novel cold-adapted nitrite oxidizing betaproteobacterium from the Siberian Arctic [J]. ISME Journal, 2007,1(3):256-264.

鮑林林,陳永娟,王曉燕.北運(yùn)河沉積物中氨氧化微生物的群落特征 [J]. 中國(guó)環(huán)境科學(xué), 2015,35(1):179-189.

Tekerlekopoulou A G, Vayenas D V. Ammonia, iron and manganese removal from potable water using trickling filters [J]. Desalination, 2007,210(1-3):225-235.

Michalakos G D, Nieva J M, Vayenas D V, et al. Removal of iron from potable water using a trickling filter [J]. Water Research, 1997,31(5):991-996.

Hope C K, Bott T R. Laboratory modelling of manganese biofiltration using biofilms of[J]. Water Research, 2004,38(7):1853-1861.

Burger M S, Krentz C A, Mercer S S, et al. Manganese removal and occurrence of manganese oxidizing bacteria in full-scale biofilters [J]. Journal of Water Supply Research and Technology, 2008,57(5):351-359.

Carmichael M J, Carmichael S K, Santelli C M, et al. Mn (II)-oxidizing bacteria are abundant and environmentally relevant members of ferromanganese deposits in caves of the upper Tennessee River Basin [J]. Geomicrobiology Journal, 2013,30(9): 779-800.

Miller A Z, Hernández-Mariné M, Jurado V, et al. Enigmatic reticulated filaments in subsurface granite [J]. Environmental Microbiology Reports, 2012,4(6):596-603.

* 責(zé)任作者, 教授, cya_yanan@163.com

Analysis of microbial community structure and functional bacteria in a biofilter with different sequencing technologies

CAI Yan-an1, LI Dong2*, BI Xue-jun1, ZENG Hui-ping2, ZHANG Jie2,3

(1.School of Environmental and Municipal Engineering, Qingdao University of Technology, Qingdao 266033, China；2.Key Laboratory of Beijing Water Quality Science and Water Environment Recovery Engineering, Beijing University of Technology, Beijing 100124, China；3.State Key Laboratory of Urban Water Resource and Environment, Harbin Institute of Technology, Harbin 150090, China)., 2016,36(6)：1830~1834

Effects of the technologies of clone library and high throughout sequencing for revealing microbial community structure and functional bacteria in a biofilter which simultaneously removes iron, manganese and ammonia were compared. 15057 sequences with 32 classifications in class level were obtained after the high throughout sequencing process, while there are 9classified groups in clone library. The former revealed more diversity of bacterial community structure. However, in the functional bacteria analysis process, some nitrifiers or iron and manganese bacteria which were detectable in one sequencing analysis process were not appeared in the other process. Comparing with using these two technologies individually in the analysing process, the combined using can compensate for each other and reveal the functional bacteria better.

biofilter；nitrification；high throughout sequencing；clone library profiling

X522

A

1000-6923(2016)06-1830-05

蔡言安(1986-),男,山東高密人,講師,博士,主要從事水污染控制與水質(zhì)保障技術(shù)研究.發(fā)表論文13篇.

2015-11-28

國(guó)家自然科學(xué)基金優(yōu)秀青年科學(xué)基金(51222807)