早衰因子及其突變對(duì)BACE1活性調(diào)控的研究

李諾敏，邱云潔，慶宏

（北京理工大學(xué)生命學(xué)院，北京，100081）

早衰因子及其突變對(duì)BACE1活性調(diào)控的研究

李諾敏，邱云潔，慶宏*

（北京理工大學(xué)生命學(xué)院，北京，100081）

阿爾茲海默癥（Alzheimer's Disease，AD）是一種以記憶力減退、認(rèn)知功能障礙為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其典型病理特征為神經(jīng)元胞外沉積的大量β淀粉樣蛋白（Amyloid β peptide，Aβ）而形成的老年斑。Aβ是由β-淀粉樣前體蛋白（Amyloid precursor protein，APP）通過β-分泌酶（beta-site amyloid β precursor protein cleaving enzyme 1，BACE1）和γ-分泌酶有序切割產(chǎn)生的。而γ-分泌酶的活性中心早衰因子（Presenilin1，PS1）對(duì)BACE1的調(diào)控作用，可能對(duì)Aβ的產(chǎn)生發(fā)揮重要的作用。通過Western Blot和Real Time PCR的方法探討了PS1缺失情況下，BACE1的表達(dá)水平以及活性，結(jié)果顯示在MEF PS1敲除細(xì)胞中，BACE1的表達(dá)水平會(huì)顯著下降，對(duì)APP的水解切割能力也會(huì)顯著下調(diào)，當(dāng)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染PS1后，這種現(xiàn)象會(huì)被翻轉(zhuǎn)，BACE1的表達(dá)水平和mRNA水平均會(huì)顯著上調(diào)。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)在加入γ-分泌酶抑制劑L-685，458后，也可以很好的翻轉(zhuǎn)MEF PS1-/-PS2-/-細(xì)胞中瞬時(shí)過表達(dá)PS1后所產(chǎn)生的影響。PS1突變L166P和Q223R可以顯著性的增加APP的水解切割過程以及BACE1的表達(dá)水平以及活性，當(dāng)加入γ-分泌酶抑制劑L-685，458后，能顯著性的抑制PS1突變對(duì)BACE1的表達(dá)水平，活性以及mRNA水平。以上結(jié)果表明，PS1能夠調(diào)控BACE1的表達(dá)水平，進(jìn)而影響Aβ的產(chǎn)生。

阿爾茲海默癥； β-分泌酶； 活性中心早衰因子

阿爾茲海默癥（Alzheimer's Disease，AD）是一種以記憶力減退、認(rèn)知功能障礙為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其典型病理特征為神經(jīng)元胞外沉積的大量β淀粉樣蛋白（Amyloid β peptide，Aβ）而形成的老年斑［1］。老年斑的主要組成為淀粉樣蛋白Aβ40和Aβ42，其中Aβ42為毒性成分［2］。Aβ是由β-淀粉樣前體蛋白（Amyloid precursor protein，APP）通過β-分泌酶（beta-site amyloid β precursor protein cleaving enzyme 1，BACE1）和γ-分泌酶有序切割產(chǎn)生的［3］。首先BACE1切割A(yù)PP，生成分泌型的sAPPβ及跨膜的羧基末端C99，切割形成的羧基端片段C99繼續(xù)在γ-分泌酶作用下，產(chǎn)生Aβ［4］。而在非Aβ生成途徑中，APP首先在Aβ部分被α-分泌酶切割產(chǎn)生分泌型sAPPα和C83。C83繼續(xù)被γ-分泌酶切割但不產(chǎn)生Aβ。在正常狀態(tài)下體內(nèi)以非Aβ生成途徑為主

BACE1作為APP水解切割產(chǎn)生Aβ的關(guān)鍵酶，研究發(fā)現(xiàn)在AD病人腦內(nèi)BACE1基因表達(dá)上調(diào)且活性增加［5，6］，這表示BACE1的表達(dá)調(diào)控在AD病理過程中具有重要作用。

γ-分泌酶是一種由多個(gè)亞基構(gòu)成的復(fù)合體，目前已知它包括早衰因子（Presenilin，PS1/2），Nicastrin，Aph1及Pen-2。PS1作為γ-分泌酶的重要組成參與APP的代謝，由PS1基因突變而導(dǎo)致的AD約占家族性AD（Family Alzheimer's Disease，F(xiàn)AD）的90%，家族性AD中的PS突變可能是通過影響PS依賴的γ-分泌酶活性而改變APP水解切割和Aβ產(chǎn)生的，繼而引發(fā)一系列神經(jīng)退行性病變［7］。有研究表明目前已有許多關(guān)于PS1突變的報(bào)道，與家族性AD有關(guān)的大多數(shù)PS1突變位于早衰因子的跨膜區(qū)［8，9］，PS1突變可以調(diào)控BACE1的表達(dá)和活性，增加Aβ42的生成。因此我們選取有關(guān)PS1的兩種家族性突變L166P及Q223R，就其對(duì)BACE1的調(diào)控及其在APP水解切割過程的影響進(jìn)行探究。結(jié)果顯示瞬時(shí)轉(zhuǎn)染PS1-L166P或Q223R 到PS1-/-PS2-/-細(xì)胞后，BACE1的表達(dá)和活性顯著上調(diào)。當(dāng)加入γ-分泌酶抑制劑L-685，458后，可以有效反轉(zhuǎn)PS1-/-PS2-/-細(xì)胞中瞬時(shí)過表達(dá)PS1后所產(chǎn)生的影響。因此我們的結(jié)果表明PS1能夠調(diào)控BACE1的表達(dá)和活性，并且與家族性AD相關(guān)的突變體PS1-L166P、PS1-Q223R可以通過增加BACE1表達(dá)或促進(jìn)BACE1蛋白的活性，影響APP的水解切割過程。

1　材料與方法

1.1試劑與耗材

DMEM（Dulbecco's modified Eagle's medium）培養(yǎng)基（高糖型，含L-谷氨酰胺和丙酮酸鈉）、Opti-MEM、胎牛血清購自美國(guó)Gibco公司；100×雙抗（10kU/ml青霉素+ 10mg/ml硫酸鏈霉素）、0.25%胰酶-EDTA購自北京索來寶公司，γ-分泌酶抑制劑L-685，458購自美國(guó)Sigma公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 購自Invitrogen 公司；RNA抽提試劑Trizol Reagent購自invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄使用RNasin Plus RNase Inhibitor、RNase-free water、Oligo（dT）15 Primer、dNTP、M-MLV Reverse Transcriptase購自美國(guó)Promega公司；2×TransStart Top Green qPCR SuperMix購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；抗BACE1小鼠單抗購自美國(guó)R&D公司；兔源抗體C20（抗APP C端）為加拿大哥倫比亞大學(xué)宋偉宏教授惠贈(zèng)；抗β-actin小鼠單抗購自美國(guó)Sigma公司；HRP標(biāo)記山羊抗小鼠二抗、HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；IMMOBILON WESTERN CHEMILUM HRP化學(xué)發(fā)光底物購自美國(guó)Millipore公司；Human Aβ42試劑盒，HumanAβ40試劑盒購自美國(guó)Thermo公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染與抑制劑處理

MEF（PS1-/-PS2-/-，PS1+/+PS2+/+，PS1-/-）細(xì)胞來源于小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，細(xì)胞在含有10%胎牛血清、1%NEAA（非必需氨基酸）和1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，細(xì)胞于37℃，5% CO2的條件下培養(yǎng)。

細(xì)胞培養(yǎng)于60mm培養(yǎng)皿，待細(xì)胞密度達(dá)到70～80%時(shí)，按照質(zhì)粒與lipofectamine2000 1:2的比例稀釋于Opti-MEM培養(yǎng)基中，靜置20min，將混合液加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，輕輕混勻，4～6h后更換為完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48h后收集細(xì)胞。γ-分泌酶抑制劑為細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后加入，10μM處理90min。

1.3Western blot檢測(cè)

細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后，胰酶消化，離心收集細(xì)胞，加入適量含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液于冰上裂解30min，超聲破碎，4℃ 12000rpm離心10min，取上清，Bradford法進(jìn)行蛋白定量。取50μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳完畢后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，PVDF膜置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%脫脂牛奶中室溫封閉1h，一抗（C20 1：10000，BACE1 1:1000，β-acting 1:8000）4℃孵育過夜；TBST洗6次，每次10min，加入對(duì)應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（山羊抗小鼠，山羊抗兔1:5000）室溫孵育2h，TBST洗6次每次10min，ECL顯影，灰度分析使用Image Lab軟件。APP-CTF使用16.5% Tris-tricine膠檢測(cè)。

1.4RNA提取與Real-time PCR檢測(cè)

細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后，使用Trizol Reagent（invitrogen）抽提總RNA，根據(jù)測(cè)定的RNA濃度，計(jì)算5μg RNA體積進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；Real-time PCR檢測(cè)BACE1基因（Forward：TGGAGGGCTT TGGAGGGCTTCTACGTTGTCTT，Reverse:CATCATGGAAGGTTT CTATGTCGTCTTC），內(nèi)參GAPDH（Forward:GACTTCAACAGCAACTCCCACTCTTCC，Reverse:TGG GTGGTCCAGGGTTTCTTACTCCTT）。

1.5ELISA檢測(cè)

Aβ檢測(cè)根據(jù)Aβ ELISA試劑盒說明書操作。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后，收集細(xì)胞上清液為待測(cè)樣品；試劑盒室溫平衡20min，在樣品孔中加入10μL樣品和40μL稀釋液的混合液，在標(biāo)準(zhǔn)孔中加入50μL不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)照孔加入50μL的未培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基，Blank孔中不加入任何液體，隨后在各孔中加入檢測(cè)抗體50μL，室溫孵育3h；孵育完成后，棄去孔內(nèi)的液體，用wash buffer洗四次，每次1min；在孔內(nèi)加入100μL Anti-Rabbit IgG HRP溶液，室溫孵育30min；孵育完成后，棄去孔內(nèi)的液體，用wash buffer洗四次，每次1min；在孔內(nèi)加入100μL的Stabilized Chromogen，這時(shí)孔中液體逐漸變藍(lán)，在室溫下避光孵育30min；孔中加入100μL的終止液，待孔中液體變黃，30min內(nèi)在450nm處進(jìn)行檢測(cè)；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算每孔樣品內(nèi)Aβ42和Aβ40的含量。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)及其標(biāo)準(zhǔn)差均采用Microsoft Office Excel 2010和GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與計(jì)算，Western Blot用Image Lab Version 4.0進(jìn)行相對(duì)定量分析。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差呈現(xiàn)。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行兩兩比較時(shí)采用t-test進(jìn)行顯著性分析，組間采用one-way ANOVA（ Dunnett's post hoc test ），p＜0.05即認(rèn)為結(jié)果顯著。

2.　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1PS1調(diào)控BACE1蛋白轉(zhuǎn)錄及翻譯

研究發(fā)現(xiàn)AD病人腦內(nèi)BACE1基因表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)調(diào)控在AD病理過程中具有重要作用，因此我們首先研究了PS1是否會(huì)影響B(tài)ACE1蛋白的表達(dá)水平。與對(duì)照組MEF PS1-/-PS2-/-細(xì)胞相比，過表達(dá)PS1后細(xì)胞內(nèi)BACE1蛋白的表達(dá)水平顯著上調(diào)。

由于BACE1的基因表達(dá)可在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控，我們就PS1對(duì)BACE1 mRNA水平的影響進(jìn)行探討。結(jié)果顯示當(dāng)MEF PS1-/-PS2-/-細(xì)胞中瞬時(shí)過表達(dá)PS1后，BACE1的mRNA水平顯著上調(diào)。這一結(jié)果與BACE1蛋白水平的變化一致。也有研究者在HEK293細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果，HEK293細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染PS1-WT后，BACE1的mRNA水平以及BACE1的活性都出現(xiàn)了上調(diào)趨勢(shì)［10］。

圖1　MEF PS1-/-PS2-/-及過表達(dá)PS1細(xì)胞中BACE1蛋白表達(dá)水平的改變Fig.1 The effect of PS1/PS2 knock out on BACE1 protein level in MEF cell line

圖2　MEF PS1-/-PS2-/-細(xì)胞中BACE1 mRNA水平的改變Fig.2 The effect of PS1/PS2 knock out on BACE1 mRNA level in MEF cell line

2.2FAD相關(guān)PS1突變影響APP水解切割

與家族性AD有關(guān)的多數(shù)PS1突變可以通過降低Aβ40或增加Aβ42上調(diào)Aβ42與Aβ40的比例［11，12］。PS1突變L166P及Q223R分別位于PS1的第2及第5個(gè)跨膜區(qū)，為了探究這兩種家族性突變對(duì)Aβ生成的影響，我們首先對(duì)過表達(dá)突變體L166P 及Q223R后分泌型Aβ水平進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，與野生型PS1相比，過表達(dá)L166P或Q223R時(shí)分泌到細(xì)胞外的Aβ水平發(fā)生改變，Aβ42與Aβ40的比例顯著性上調(diào)。

圖3　.28 PS1突變對(duì)Aβ42/Aβ40的影響（*P＜0.05，**P＜0.01）The Aβ42/ Aβ40 ratio.

圖3　PS1突變對(duì)APP水解切割過程的影響Fig.3 The effect of Presenilin1 mutations on APP cleavage pathway

由于APP、BACE1及γ-分泌酶對(duì)Aβ產(chǎn)生過程中的重要性，結(jié)果提示我們PS1突變?cè)谟绊慞S1功能的同時(shí)也會(huì)影響B(tài)ACE1的表達(dá)和活性，因此我們對(duì)BACE1的蛋白水平及其切割A(yù)PP產(chǎn)生的CTF水平進(jìn)行檢測(cè)，在20E2細(xì)胞中過表達(dá)PS1-L166P或Q223R后，與野生型PS1相比，PS1突變L166P與Q223R會(huì)顯著性增加CTF99的水平，相對(duì)應(yīng)的APP水平顯著下降，表明這兩種PS1突變可以顯著性促進(jìn)APP的水解過程，促進(jìn)BACE1的水解切割活性。同時(shí)，突變體L166P過表達(dá)后BACE1蛋白水平?jīng)]有顯著變化，而轉(zhuǎn)入Q223R時(shí)BACE1的表達(dá)水平顯著提高，繼而促進(jìn)APP的水解切割，引起CTF99表達(dá)水平的增加。

圖4　APP蛋白水平灰度分析圖（*P＜0.05，**P＜0.01）Fig.4 Relative level of APP（*P＜0.05，**P＜0.01）

圖5　C99表達(dá)水平灰度分析圖（*P＜0.05，**P＜0.01）Fig.5 Relative level of C99（*P＜0.05，**P＜0.01）

2.3γ-分泌酶抑制劑調(diào)控BACE1的表達(dá)和活性

為了進(jìn)一步驗(yàn)證PS1及其突變對(duì)BACE1活性及表達(dá)水平的影響，加入γ-分泌酶抑制劑L-685，458研究其能否抑制BACE1的表達(dá)水平或活性。在MEF PS1-/-PS2-/-轉(zhuǎn)入PS1-WT、PS1-L166P或PS1-Q223R時(shí)，BACE1的表達(dá)水平和活性均上調(diào)；當(dāng)加入γ-分泌酶抑制劑后，其BACE1蛋白的表達(dá)水平顯著下降，而且對(duì)APP的切割水平具有顯著的抑制作用。Luca研究小組也發(fā)現(xiàn)，在HEK293細(xì)胞中一些PS1突變可以增加BACE1的mRNA水平和表達(dá)水平，包括M146V，S170F，L392V和A246E，當(dāng)加入γ-分泌酶抑制劑XIX后，BACE1的表達(dá)水平和mRNA水平下調(diào)，這個(gè)結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)得到結(jié)果具有一致性。

同時(shí)我們也對(duì)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染PS1突變后加入γ-分泌酶抑制劑時(shí)BACE1 mRNA水平進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果與BACE1蛋白水平具有一致性，在瞬時(shí)轉(zhuǎn)入PS1突變：L166P和Q223R后加入γ-分泌酶抑制劑L-685，458，能夠顯著性的降低BACE1蛋白mRNA的水平。以上結(jié)果表明在加入γ-分泌酶抑制劑后，γ-分泌酶抑制劑L-685，458能夠抑制了PS1的活性，而PS1活性的喪失會(huì)導(dǎo)致BACE1蛋白水平和活性的下降。

圖3　.31: γ-分泌酶抑制劑L-685，458對(duì)BACE1蛋白表達(dá)水平及APP水解切割的影響Figure 3.31 The effect of γ-secretase inhibitor L-685.458 on BACE1 level and APP pathway

圖3　.33 γ-分泌酶抑制劑L-685，458對(duì)BACE1 mRNA水平的影響（*P＜0.05，**＜0.01）Figure 3.33 The effect of γ-secretase inhibitor L-685，458 on BACE1 mRNA level（*P＜0.05，**＜0.01）

3.　討論

BACE1作為APP水解過程的關(guān)鍵酶，對(duì)于Aβ生成和AD的病理發(fā)生具有至關(guān)重要的作用。已有研究發(fā)現(xiàn)PS1作為γ-分泌酶的重要組成，可以調(diào)控BACE1的成熟與活性［13］。我們首先在MEF PS1-/-PS2-/-細(xì)胞中驗(yàn)證PS1對(duì)BACE1的調(diào)控作用，結(jié)果顯示當(dāng)轉(zhuǎn)入PS1后，BACE1的蛋白水平和mRNA水平顯著上調(diào)，說明PS1可在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平均可調(diào)控BACE1。

與家族性AD有關(guān)的PS1突變可以改變PS1的功能，是否也會(huì)影響B(tài)ACE1的表達(dá)和活性，為了研究與FAD有關(guān)的PS1突變對(duì)BACE1的調(diào)控作用，我們選取了分別位于PS1蛋白第2及第5個(gè)跨膜區(qū)上的突變位點(diǎn)L166P及Q223R，對(duì)其APP水解切割過程相關(guān)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，這兩種PS1突變均可促進(jìn)BACE1對(duì)APP的水解作用，并提高Aβ42與Aβ40的比例。而且轉(zhuǎn)入Q223R突變后的BACE1蛋白水平也顯著上調(diào)，而當(dāng)轉(zhuǎn)入L166P突變后BACE1水平并沒有顯著改變，表明不同突變體可能通過不同方式，包括促進(jìn)BACE1的轉(zhuǎn)錄和翻譯以及增加BACE1的活性調(diào)控BACE1的功能［14］。利用γ-分泌酶抑制劑L-685，458抑制PS1蛋白的功能活性，此時(shí)無論野生型或兩種PS1突變，BACE1的表達(dá)水平和活性均相應(yīng)下調(diào)，進(jìn)一步驗(yàn)證了PS1及其突變對(duì)BACE1的調(diào)控作用。

不同的PS1突變可以通過增加BACE1的表達(dá)或促進(jìn)其活性繼而影響β-分泌酶的功能，而對(duì)于PS1與BACE1的具體作用機(jī)制仍然未知，PS1對(duì)BACE1表達(dá)水平的調(diào)控是否由于啟動(dòng)子或轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控實(shí)現(xiàn)的，仍需要利用熒光素酶及染色質(zhì)免疫共沉淀的方法進(jìn)一步研究，而PS1對(duì)BACE1蛋白功能的促進(jìn)作用具體發(fā)生機(jī)制也需要深入探討。綜上所述，研究發(fā)現(xiàn)PS1及其突變L166P、Q223R能夠調(diào)節(jié)BACE1的表達(dá)和活性，影響APP水解切割和Aβ的產(chǎn)生，這為研究AD的發(fā)病機(jī)制及尋找新的AD治療靶點(diǎn)提供了理論基礎(chǔ)。

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The Investigation of Regulatory Role of Presenilin1 in BACE1 Activity and Expression

Li Nuomin，Qiu Yunjie，Qing Hong*
（Beijing Institute of Technology School of Life Sciences，Beijing，100081）

As a kind of neurodegenerative disease，Alzheimer's disease（AD）is characterized by memory loss and cognitive disorder. The typical pathological feature of AD is the senile plaques accumulated in the extracellular matrix of central nervous system. Amyloid β peptide（Aβ），the main component of senile plaques，is sequentially generated by Beta-site amyloid β precursor protein cleaving enzyme 1（BACE1）and γ-secretase through the hydrolysis of Amyloid precursor protein（APP）. Presenilin1（PS1）is the active site of γ-secretase and may be of great importance in the synthesis of Aβ due to its regulatory role towards BACE1. In the present study，the expression and activity of BACE1 was investigated in the absence of PS1. The results showed that both of the two parameters were significantly decreased in MEF PS1-/-cell line，which was reversed when transiently transfected with PS1. Meanwhile，the effects caused by transient overexpression of PS1 could be potently suppressed by γ-secretase inhibitor L-685，458 in MEF PS1-/-PS2-/-cells. PS1 mutations，L166P and Q223R，dramatically enhanced BACE1 expression and activity，and thus increased the amount of Aβ. L-685，458 also notably inhibited the function of PS1 mutations. All the data above supports the conclusion that PS1 regulates BACE1 and thereby affects the synthesis of Aβ.

Alzheimer's Disease； BACE1； PS1

Q74 ［Document Code］ A

10. 11967/ 2016140407

Q74

ADOI：10. 11967/ 2016140407

國(guó)家自然基金（項(xiàng)目編號(hào)：81171206）。

李諾敏，博士，研究方向：神經(jīng)生物學(xué)。

慶宏 教授。Email：hqing@bit.edu.cn。