阿托伐他汀對(duì)脂多糖誘導(dǎo)人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞間黏附分子-1表達(dá)的影響*

嵇云鵬， 張彥燕， 楊　紅,3， 石廷雨,3， 徐旖旎， 陶　玲， 沈祥春,3**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 天然藥物資源優(yōu)效利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽(yáng)　550025； 2.貴州省人民醫(yī)院 藥劑科， 貴州 貴陽(yáng)　550002； 3.貴州醫(yī)科大學(xué) 中藥藥理教研室， 貴州 貴陽(yáng)　550025)

?

·基礎(chǔ)研究·

阿托伐他汀對(duì)脂多糖誘導(dǎo)人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞間黏附分子-1表達(dá)的影響*

嵇云鵬1,2， 張彥燕1， 楊紅1,3， 石廷雨1,3， 徐旖旎1， 陶玲1， 沈祥春1,3**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 天然藥物資源優(yōu)效利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽(yáng)550025； 2.貴州省人民醫(yī)院 藥劑科， 貴州 貴陽(yáng)550002； 3.貴州醫(yī)科大學(xué) 中藥藥理教研室， 貴州 貴陽(yáng)550025)

目的： 觀察阿托伐他汀(Atv.)對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(HAECs)細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)表達(dá)的影響，并探討其分子機(jī)制。方法： 用1 mg/L LPS復(fù)制HAECs損傷模型，通過MTT和乳酸脫氫酶(LDH)外漏率實(shí)驗(yàn)觀察5 μmol/L Atv.對(duì)LPS誘導(dǎo)HAECs損傷的保護(hù)作用，采用RT-PCR法檢測(cè)Atv.對(duì)ICAM-1 mRNA表達(dá)的影響，Western blot檢測(cè)Atv.對(duì)ICAM-1、IκBα及NF-κB蛋白表達(dá)水平的影響。結(jié)果： 與LPS組比較，Atv.能有效抑制LPS誘導(dǎo)的HAECs損傷，細(xì)胞活力增加(P<0.01)，LDH外漏率減少(P<0.01)，Atv.可抑制LPS誘導(dǎo)的ICAM-1 mRNA(P<0.05)和蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.01)，還可抑制LPS誘導(dǎo)的IκBα蛋白表達(dá)水平的降低和phospho-NF-κ B p65蛋白表達(dá)水平的升高(P<0.01)。結(jié)論： 阿托伐他汀對(duì)LPS誘導(dǎo)HAECs損傷具有保護(hù)作用，并有效抑制ICAM-1的表達(dá)，該作用與抑制IκBα降解及NF-κB p65磷酸化有關(guān)。

阿托伐他??； 人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞； 細(xì)胞間黏附分子-1； 核因子-κB

[Abstract]Objective: To observe the effect and mechanism of atorvastatin on the expression of ICAM-1 in lipopolysaccharide (LPS)-induced injury of cultured human aortic endothelial cells (HAECs). Methods: Cultured HAECs were treated with LPS alone (1 mg/L) or in the presence of atorvastatin (Atv.,5 μmol/L). MTT and LDH leakage ratio were used to analyze the protective effect of atorvastatin against LPS. The RT-PCR was used to determine the mRNA expression of ICAM-1. The western blot was adopted to detect the protein expression of ICAM-1, IκBα, NF-κB in HAECs injury induced by LPS. Results: Compared with LPS group, atorvastatin could effectively inhibit LPS-induced injury by increasing cell activity(P<0.01), decreasing LDH releasing ratio(P<0.01), inhibiting the up-regulating mRNA(P<0.05) and protein (P<0.01) expression of ICAM-1, inhibiting the decreasing of phospho-NF-κB p65 protein expression (P<0.01) and the increasing of IκBα protein expression (P<0.01). Conclusion: Atorvastatin has a protective effect on LPS induced HAECs injury, and can effectively inhibit the expression of ICAM-1, which is related to the inhibition of IκBα degradation and NF-κB p65 phosphorylation.

[Key words]atorvastatin; human aortic endothelial cells; intercellular adhesion molecule-1; nuclear factor-κB

細(xì)胞-細(xì)胞間黏附作用在多種刺激誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答中起重要作用。細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)與整合素家族成員淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1(LFA-1)及巨噬細(xì)胞分化抗原(Mac-1)結(jié)合，介導(dǎo)LFA-1陽(yáng)性細(xì)胞發(fā)生黏附及其它生物學(xué)反應(yīng)，在單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞緊密黏附過程中發(fā)揮著極為重要的作用[1]。ICAM-1在腦缺血、帕金森、癌癥等疾病ICAM-1表達(dá)異常升高，認(rèn)為ICAM-1表達(dá)異常與肝癌、肺癌及結(jié)腸癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[2-4]；研究還發(fā)現(xiàn)，動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)斑塊中和缺血再灌注損傷后的內(nèi)皮細(xì)胞中ICAM-1表達(dá)也升高[5-6]，因此ICAM-1已成為預(yù)防和治療多種疾病的潛在靶點(diǎn)。他汀類藥物是目前臨床廣泛應(yīng)用的調(diào)血脂藥，除有調(diào)血脂的作用外，還具有改善血管內(nèi)皮功能、抗炎及調(diào)節(jié)免疫功能等非調(diào)血脂的作用。阿托伐他汀(Atv.)具有血藥濃度高、親脂性及半衰期長(zhǎng)等特點(diǎn)。本研究通過探討Atv.對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(human aortic endothelial cells, HAECs) ICAM-1表達(dá)的影響，分析Atv.作用的分子機(jī)制，為Atv.發(fā)揮抗炎作用及臨床作為非調(diào)血脂藥物應(yīng)用提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

HAEC原代細(xì)胞購(gòu)買自美國(guó)Science cell公司、內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(ECM)、胰蛋白酶、中和液以及細(xì)胞凍存液(science cell research laboratories, USA)，Atv.標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，Lot為100590-201303)，LPS(Escherichia coli 055，B5，Sigma，USA)，乳酸脫氫酶(LDH)測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所，Lot為20130806BCA)，蛋白定量試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，Lot為00041305)，總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司，Lot為M1726)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(thermo scientific，Lot為00132311)，Taq PCR Master Mix(生工生物工程(上海)股份有限公司，Lot為13112606F)，ICAM-1抗體(Santa cruz，Lot為F0510)，兔抗IκBα抗體、phospho-NF-κ B p65抗體、NF-κ B p65抗體(Cell signaling technology)。

1.2方法

1.2.1HAECs培養(yǎng)參照Science cell公司指定培養(yǎng)條件、培養(yǎng)過程培養(yǎng)HAEC原代細(xì)胞。以5×107/L接種于培養(yǎng)瓶(板)內(nèi)，5%CO2、37 ℃培養(yǎng)至細(xì)胞融合，用第4～5代細(xì)胞進(jìn)行以下研究。

1.2.2分組及處理研究分為空白對(duì)照組、模型組及Atv.組，control組以無(wú)血清培養(yǎng)基處理，模型組采用 1 mg/L的 LPS處理培養(yǎng)12 h，Atv.組采用5 μmol/L的 Atv.預(yù)處理細(xì)胞1 h，然后加入1 mg/L的LPS后培養(yǎng)12 h，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。

1.2.3細(xì)胞損傷檢測(cè)(1)MTT檢測(cè)細(xì)胞存活率：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化后，調(diào)整細(xì)胞密度，以1×104/孔 細(xì)胞接種于96孔板；待細(xì)胞貼壁融合后棄去上清液，各組藥物干預(yù)后，吸去培養(yǎng)液，每孔加入無(wú)血清DMEM 180 μL及MTT液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，分離上清液，向細(xì)胞沉淀中加入150 μL DMSO低速振蕩10 min，于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度值，計(jì)算細(xì)胞存活率。(2)LDH外漏率：上清液LDH提取，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于24孔板，各組藥物干預(yù)1 h后，加LPS(1 mg/L)共同孵育12 h，吸取上清液，-20 ℃冰箱保存，以待檢測(cè)；細(xì)胞內(nèi)LDH提取，吸去上清后的細(xì)胞用PBS洗3遍，1% Triton-X100冰上裂解細(xì)胞20 min，取裂解液，4 ℃、12 000 r/min離心30 min，取上清液，使用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量，計(jì)算胞內(nèi)蛋白濃度，-20 ℃保存。根據(jù)LDH檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)上清液和細(xì)胞內(nèi)LDH含量，計(jì)算LDH外漏率。

1.2.4ICAM-1 mRNA檢測(cè)采用RT-PCR法，將HAEC接種于6孔板培養(yǎng)，細(xì)胞融合后藥物處理12 h，使用總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取細(xì)胞總RNA。以提取的RNA為模板，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo Scientific)合成cDNA， 由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計(jì)、合成ICAM-1引物，上游引物序列為5′-CCTCACACTTCACTGTCACCT-3′，下游引物序列為5′-CGTGCCGCACTGAACTGGAC-3′；內(nèi)參對(duì)照GADPH上游引物序列為5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′，下游引物序列為5′-AGGGGCATCCACAGTCTTC-3′。擴(kuò)增條件為94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸35 s，共30次循環(huán)；72 ℃最后延伸2 min；共重復(fù)3次。擴(kuò)增結(jié)束后，取1×TAE電泳緩沖液，配置1.8%瓊脂糖凝膠溶液，加入無(wú)毒核酸染料，充分混勻，取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，凝膠成像儀成像，Bandscan分析灰度值，以ICAM-1/GADPH表示各組ICAM-1 mRNA表達(dá)。

1.2.5ICAM-1 、NF-κ B及Iκ B α蛋白表達(dá)檢測(cè)采用Western blot 法，取生長(zhǎng)良好的HAECs，各組藥物干預(yù)后，棄除含藥培養(yǎng)基，預(yù)冷的PBS洗3遍，加入含PMSF的RIPA裂解液適量，冰上振蕩20 min，刮下細(xì)胞，取裂解液于1.5 mL EP管內(nèi)，4 ℃，12 000 r/min離心30 min，收集上清液，用BCA試劑盒蛋白定量后，-70 ℃保存。調(diào)整蛋白濃度，以含總蛋白40 μg的總體積20 μL體系上樣。蛋白樣品95 ℃變性5 min，用10%～12%的變性SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜 (300 mA，2 h)。轉(zhuǎn)膜后，5% 的脫脂牛奶 (TBST配制) 室溫封閉1 h。加入一抗稀釋液(ICAM-1 1∶200，IκBα 1∶1 000，phospho-NF-κ B p65 1∶1 000，NF-κ B p65 1∶1 000，β-actin 1∶5 000)，4 ℃孵育過夜。一抗孵育后，TBST洗滌3次，5 min/次，二抗稀釋液(1∶6 000)室溫孵育1～2 h，TBST洗滌3次，5 min/次，通過ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)成像， Bandscan軟件分析蛋白條帶灰度強(qiáng)弱。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1各組HAECs細(xì)胞存活率與LDH外漏率

MTT結(jié)果表明(圖1A)，LPS與HAECs作用12 h后，細(xì)胞活力較對(duì)照組細(xì)胞明顯降低(P<0.01)。與模型組比較，Atv.組對(duì)LPS誘導(dǎo)HAEC損傷MTT值降低具有抑制作用 (P<0.01)。LDH外漏是細(xì)胞損傷的生物標(biāo)志物之一，本研究結(jié)果顯示(圖1B)，與control組比較，模型組LDH外漏率明顯增加 (P<0.01)；與模型組比較，Atv.組對(duì)可顯著降低LDH外漏率(P<0.01)。

(1)與空白對(duì)照組比較，P<0.01； (2)與模型組比較，P<0.01圖1　各組細(xì)胞存活率與LDH外漏率的影響Fig.1　Effect of Atv. on cell viability and LDH releasing ratio

2.2ICAM-1 mRNA及蛋白表達(dá)

結(jié)果顯示，模型組ICAM-1 mRNA及蛋白表達(dá)明顯增高(P<0.01)，Atv.可抑制LPS誘導(dǎo)的ICAM-1 mRNA(P<0.05)和蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.01)，見圖2。

2.3NF-κ B及Iκ B α蛋白表達(dá)

與空白對(duì)照組比較，模型組HAECs中 IκBα蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01)，phospho-NF-κ B p65表達(dá)明顯升高(P<0.01)； Atv.組IκBα蛋白表達(dá)水平高于模型組，但低于空白對(duì)照組，phospho-NF-κ B p6蛋白表達(dá)水平低于模型組(P<0.01)，說(shuō)明Atv.能抑制LPS 誘導(dǎo)的NF-κ B的激活。

3　討論

Atv.作為3-羥基-3甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑，具有良好的調(diào)血脂作用，特別

(1)與空白對(duì)照組比較，P<0.01； (2)與模型組比較，P<0.01；(3)與模型組比較，P<0.05圖2　Atv.對(duì)LPS誘導(dǎo)HAECs ICAM-1 mRNA及蛋白表達(dá)的影響Fig.2　Impact of Atv. on LPS induced ICAM-1 mRNA and protein levels, respectively

(1)與空白對(duì)照組比較，P<0.01； (2)與模型組比較，P<0.01圖3　Atv.對(duì)LPS誘導(dǎo)HAECs中IκBα及phospho-NF-κ B p65蛋白表達(dá)的影響Fig.3　Impact of Atv. on LPS induced IκBα and phospho-NF-κ B p65 levels

是在高膽固醇血癥的治療中得到廣泛應(yīng)用。目前，Atv.仍主要用于心血管系統(tǒng)疾病的治療，如高脂血癥、急性冠脈綜合癥、冠狀動(dòng)脈介入治療等[7]。Atv.的非調(diào)血脂作用近年來(lái)受到廣泛關(guān)注，研究證實(shí)，通過抑制TLR4/NF-κB信號(hào)，Atv.能夠改善糖尿病伴高血壓大鼠血管內(nèi)皮功能，對(duì)三硝基苯磺酸(TNBS)誘導(dǎo)的大鼠急性腸炎有保護(hù)作用[8-9]。體內(nèi)、體外研究表明，他汀類藥物亦具有抗癌活性[10]。

大量研究表明以抑制ICAM-1異常過表達(dá)為靶點(diǎn)，對(duì)于緩解炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答具有重要意義。本研究結(jié)果顯示，Atv.能有效的抑制LPS誘導(dǎo)的HAECs ICAM-1轉(zhuǎn)錄(P<0.05)及蛋白表達(dá)水平(P<0.01)。核因子-κ B(NF-κ B)在炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵作用，其激活可以誘導(dǎo)多種炎癥因子表達(dá)，是內(nèi)皮細(xì)胞炎癥信號(hào)的重要通路之一，在炎癥反應(yīng)應(yīng)答、細(xì)胞黏附、組織細(xì)胞凋亡有關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控中起關(guān)鍵作用。研究證實(shí)，ICAM-1的表達(dá)受到NF-κ B調(diào)控[11]。為闡明Atv.抑制ICAM-1表達(dá)的分子機(jī)制，本研究觀察了與NF-κ B激活密切相關(guān)的蛋白IκB及磷酸化NF-κ B p65的表達(dá)情況。結(jié)果表明Atv.組較LPS組IκBα蛋白表達(dá)增加(P<0.01)，而磷酸化NF-κ B p65表達(dá)降低(P<0.01)，這表明，Atv.對(duì)ICAM-1表達(dá)的抑制作用與抑制NF-κ B的激活有關(guān)，而該作用與穩(wěn)定IκBα，抑制NF-κ B p65磷酸化有關(guān)。

綜上，Atv.對(duì)LPS 誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，這可能與其抑制ICAM-1的表達(dá)有關(guān)。其對(duì)ICAM-1表達(dá)的抑制作用至少部分與抑制NF-κ B激活有關(guān)，這為Atv.抗炎作用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但對(duì)Atv.在血管內(nèi)皮細(xì)胞中調(diào)控NF-κ B信號(hào)通路的分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

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(2016-02-13收稿，2016-07-01修回)

中文編輯： 吳昌學(xué)； 英文編輯： 劉華

Effect of Atorvastatin on the Expression of Intercellular Adhesion Molecule-1 in Cultured Human Aortic Endothelial Cells Induced by Lipopolysaccharide

JI Yunpeng1,2, ZHANG Yanyan1, YANG Hong1,3, SHI Tingyu1,3, XU Yini1, TAO Ling1, SHEN Xiangchun1,3

(1.TheKeyLab.ofOptimalUtilizationofNatrualMedicineResources,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550025,Guizhou,China; 2.DepartmentofPharmacy,GuizhouProvincialPeople'sHospital,Guiyang550002,Guizhou,China； 3.DepartmentofPharmacologyofTraditionalChineseMedicine,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550025,Guizhou,China)

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81360650、81560811)； 貴州省留學(xué)人員科技活動(dòng)項(xiàng)目[黔人資合(2013)02號(hào)]； 貴州省高層次創(chuàng)新型人才[黔科合人才(2015)4029號(hào)]； 貴陽(yáng)市現(xiàn)代藥業(yè)計(jì)劃[筑科合同(2011204)17號(hào)]； 貴州省中藥現(xiàn)代化專項(xiàng)[黔科合中藥字(2012)5051號(hào)]； 貴州省高等學(xué)校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)[黔教合人才團(tuán)隊(duì)(2014)31號(hào)]； 貴州省創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)[黔科合人才團(tuán)隊(duì)(2015)4025號(hào)]

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R96

A

1000-2707(2016)08-0882-05

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