凋亡誘導(dǎo)因子在阿爾茨海默病患者大腦中的表達(dá)及意義*

楊　梅, 任真奎, 禹文峰, 官志忠

(貴州醫(yī)科大學(xué) 分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽　550004)

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·專題研究·

凋亡誘導(dǎo)因子在阿爾茨海默病患者大腦中的表達(dá)及意義*

楊梅, 任真奎, 禹文峰**, 官志忠

(貴州醫(yī)科大學(xué) 分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽550004)

目的： 了解凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)在阿爾茨海默病患者(AD)腦組織中的表達(dá)及亞細(xì)胞分布。方法： 7例AD患者(AD組)和7例正常老年人(對照組)大腦組織標(biāo)本，采用免疫組織化學(xué)染色法，記錄并比較被檢腦組織海馬CA1、CA2、CA3、DG、內(nèi)嗅皮質(zhì)淺層(EC Ⅰ～Ⅲ)和深層(EC Ⅳ～Ⅵ)以及顳葉淺層(TC Ⅰ～Ⅲ)和深層(TC Ⅳ～Ⅵ)區(qū)AIF蛋白陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)，計(jì)算AIF總評分和AIF核轉(zhuǎn)移分比。結(jié)果： 與對照組比較，AD組AIF蛋白在海馬CA1、DG以及ECⅠ～Ⅲ區(qū)表達(dá)顯著升高(P<0.05)，在海馬CA2、CA3、EC Ⅳ～Ⅵ及TC Ⅳ～Ⅵ區(qū)的表達(dá)無明顯變化(P>0.05)；AD組AIF細(xì)胞核轉(zhuǎn)移分比在海馬的CA1、CA2、CA3、DG區(qū)，內(nèi)嗅皮質(zhì)和顳葉皮質(zhì)均顯著高于對照組(P<0.05)。結(jié)論： AIF的細(xì)胞核轉(zhuǎn)移可能是AD患者大腦中發(fā)生神經(jīng)細(xì)胞凋亡的重要病理因素之一。

阿爾茨海默病； 腦； 海馬； 細(xì)胞凋亡； 凋亡誘導(dǎo)因子

[Abstract]Objective: To explore the expression and subcellular distribution of apoptosis inducing factor(AIF) in the brain of patients with Alzheimer's disease(AD). Methods: Brain tissue were collected from 7 cases of AD patients(AD group) and 7 cases of healthy old people as controls(control group). Immunohistochemical staining was adopted to record the cell number of AIF protein positive expression in hippocampal CA1, Ca2, CA3 and DG area, in entorhinal cortex shallow layer (EC Ⅰ～Ⅲ) and deep layer(EC Ⅳ～Ⅵ) and temporal lobe shallow layer (TC Ⅰ～Ⅲ) and deep layer (TC Ⅳ～Ⅵ). The AIF total score and AIF nuclear transfer ratio were calculated and compared between the two groups. Results: Compared with control group, AIF expression in hippocampal CA1, DG and EC Ⅰ～Ⅲ area increased significantly in AD group(P<0.05) while AIF expression showed no significant change in CA2, CA3, EC Ⅳ～Ⅵ and TC Ⅳ～Ⅵ area in AD group(P>0.05). Compared with control group, AIF nuclear transfer ratios in hippocampal CA1, Ca2, CA3, DG area, entorhinal cortex layer and temporal lobe layer were significantly higher in AD group (P<0.05). Conclusion: The nuclear transfer of AIF may be one of the important pathological factors of neuronal apoptosis in the brain of AD patients.

[Key words]Alzheimer's disease; brain； hippocampus； apoptosis; apoptosis-inducing factor

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種以進(jìn)行性記憶和認(rèn)知功能障礙為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病(Re),主要病理變化有大腦老年斑(senile plaque, SP)、神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFTs)以及大量神經(jīng)細(xì)胞丟失[1]。神經(jīng)細(xì)胞丟失有凋亡、壞死和自噬3種方式，而AD大腦中神經(jīng)細(xì)胞的丟失，則以凋亡為主[2]。細(xì)胞凋亡有2條途徑，一條需要Caspase和Bcl家族參與，稱為Caspase依賴性細(xì)胞凋亡；另一條不依賴于Caspase，稱為非Caspase依賴性細(xì)胞凋亡。目前，對Caspase 依賴性細(xì)胞凋亡通路的分子機(jī)制已經(jīng)有了比較明確的認(rèn)識，但對非Caspase依賴性細(xì)胞凋亡通路的分子機(jī)制尚不明確。凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis inducing factor，AIF)是首個(gè)被發(fā)現(xiàn)的非Caspase依賴性細(xì)胞凋亡通路的執(zhí)行分子，它在各種組織中廣泛表達(dá)。研究證實(shí)，AIF的異常表達(dá)與諸多疾病均有相關(guān)性[3～8]。在正常生理?xiàng)l件下，AIF局限在線粒體膜，僅在線粒體表達(dá)；但在病理?xiàng)l件下，AIF從線粒體內(nèi)膜上代償性釋放并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，出現(xiàn)AIF核轉(zhuǎn)移。關(guān)于AIF在AD中的表達(dá)鮮有報(bào)道，其參與神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制亦不明確，本研究通過檢測AD患者腦組織中AIF的表達(dá)情況，研究AIF和AD病理變化間的關(guān)系。

1　材料與方法

1.1樣本

本研究得到加拿大魁北克省麥吉爾大學(xué)附屬道格拉斯神經(jīng)研究所倫理研究委員會的批準(zhǔn)，人腦組織來源于加拿大魁北克腦庫，已完成前期處理和Braak分期?；颊咚劳龊筮\(yùn)送至魁北克腦庫尸檢取樣，左半球冰凍切成5 mm厚片， -80 ℃保存，右半球福爾馬林固定，再分離海馬、內(nèi)嗅皮質(zhì)、顳葉進(jìn)行石蠟包埋備用。

1.2方法

1.2.1分組將7例AD病人的腦組織標(biāo)本作為AD組，7例正常老年人的腦組織標(biāo)本作為對照組。AD組男性5例，女性2例，年齡71～92歲，死亡到尸檢時(shí)間(PMI)7.5～32 h，病人具有典型的神經(jīng)病理學(xué)損害，Braak分期β-淀粉樣蛋白聚集為C階段，神經(jīng)纖維的纏結(jié)為Ⅱ～Ⅵ；對照組男性3例，女性4例，年齡60～85歲，PMI為7.25～32.75 h，無癡呆病史，無腦神經(jīng)病變，無完整的β-樣淀粉蛋白聚集斑塊和神經(jīng)纖維的纏結(jié)。2組被檢者性別、年齡和PMI比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2.2免疫組織化學(xué)染色取海馬、內(nèi)嗅皮質(zhì)、顳葉部位的組織石蠟包埋塊，每個(gè)部位選取5個(gè)區(qū)域，連續(xù)做10張切片，并標(biāo)明序號。脫蠟，TBS(Tris-HCl緩沖鹽溶液)漂洗3次，5 min/次，滴加1%過氧化氫孵育30 min，以清除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。TBS漂洗3次，5 min/次，再放入煮沸的0.05 mol/L檸檬酸鹽緩沖液中修復(fù)抗原。TBS漂洗3次，5 min/次，10%的山羊血清室溫下封閉1 h，取相鄰兩張切片分別孵育一抗，用TBS做一張陰性對照，其他相鄰的兩張切片分布孵育1∶1 000的AIF兔抗人多克隆抗體(氨基酸593～613，Sigma,美國)以及1∶500的鼠單克隆抗NeuN抗體(Millpore，美國)，4 ℃冰箱內(nèi)孵育過夜(14～18 h)。TBS漂洗3次，5 min/次，滴加1∶200的二抗，羊抗兔或羊抗鼠IgG(Vector，美國)，室溫下孵育60 min，TBS漂洗3次，5 min/次,滴加已放置30 min的ABC復(fù)合物反應(yīng)30 min，TBS漂洗3次，5 min/次,根據(jù)說明書加入DAB液(Vector，美國)顯色3 min。蒸餾水沖洗5 min后，乙醇70%，90%，100%分別脫水5 min，二甲苯透明3次，1 min/次，中性樹膠封片。

1.2.3結(jié)果判定通過數(shù)碼相機(jī)連接Nikon Eclipse800顯微鏡獲取圖像。拍攝海馬的CA1、CA2、CA3和DG、內(nèi)嗅皮質(zhì)(entorhinal cortex，EC)淺層(EC Ⅰ～Ⅲ)和深層(EC Ⅳ～Ⅵ)區(qū)以及顳葉(Temporal cortex，TC)淺層(TC Ⅰ～Ⅲ)和深層(TC Ⅳ～Ⅵ)區(qū)，參照文獻(xiàn)[9]方法每個(gè)區(qū)域選取5個(gè)陽性區(qū)進(jìn)行圖像采集，用Image j軟件計(jì)數(shù)AIF在不同位置表達(dá)的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算AIF總評分和AIF核轉(zhuǎn)移的百分比。(1)AIF總評分：按照文獻(xiàn)[10-11]進(jìn)行染色程度評分和AIF陽性細(xì)胞百分比評分，染色程度評分為未檢測到AIF表達(dá)定義為0分，切片中AIF陽性細(xì)胞免疫染色低、中、強(qiáng)定義為1、2及3分；AIF陽性細(xì)胞百分比評分為切片AIF陽性細(xì)胞數(shù)量/相鄰切片相應(yīng)位置NeuN染色的神經(jīng)元數(shù)量=AIF陽性細(xì)胞百分比，百分比0%～5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3，76%～100%為4分；染色程度評分×AIF陽性細(xì)胞百分比評分，為0～12的AIF總評分。(2)AIF核轉(zhuǎn)移的百分比=切片上細(xì)胞核染色陽性神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目/AIF細(xì)胞染色陽性的總數(shù)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1AIF評分

AIF主要在人腦組織的神經(jīng)元細(xì)胞中表達(dá)。與對照組比較，AD組海馬的CA1、DG以及EC Ⅰ～Ⅲ區(qū)，AIF評分顯著升高(P<0.05)，在海馬CA2、CA3、EC Ⅳ～Ⅵ以及TC Ⅳ～Ⅵ區(qū)的表達(dá)無明顯變化(P>0.05)。見圖1、表1。

表1　兩組被檢者海馬、內(nèi)嗅皮質(zhì)及顳葉皮質(zhì)的AIF評分

2.2AIF核轉(zhuǎn)移百分比

與對照組比較，AD組在海馬CA1、CA2、CA3、DG、EC和TC的AIF細(xì)胞核轉(zhuǎn)移百分比升高(P<0.05)，見圖2和表2。

表2　兩組被檢者海馬各區(qū)、EC及TC的AIF核轉(zhuǎn)移百分比

3　討論

AD的主要病理變化是神經(jīng)細(xì)胞外β-淀粉樣蛋白聚集形成的老年斑，胞內(nèi)Tau蛋白異常磷酸化形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)，以及顳葉和海馬等部位大量神經(jīng)元細(xì)胞丟失等。神經(jīng)元細(xì)胞丟失到一定程度，便會損傷腦的功能[12]。大量的尸檢報(bào)告中均發(fā)現(xiàn)AD腦組織中有明顯的神經(jīng)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。神經(jīng)元細(xì)胞喪失在海馬的CA1區(qū)達(dá)20%，在海馬回中的EC達(dá)50%～60%，大腦TC處達(dá)50%[13]。AIF是一種具有凋亡誘導(dǎo)活性的蛋白質(zhì)，其前體蛋白分子量為67 kDa，AIF成熟蛋白是分子量大小為62 kDa位于鑲嵌在線粒體內(nèi)膜的蛋白[14-15]。在正常生理?xiàng)l件下，AIF局限在線粒體膜之間，擁有核黃素結(jié)合域而具有氧化還原酶活性，可與FAD結(jié)合，參與氧化還原和清除呼吸機(jī)相關(guān)產(chǎn)生的自由基[16]。而在病理?xiàng)l件下，由于線粒體外膜病理通透性，成熟AIF進(jìn)一步通過激活鈣蛋白酶和/或組織蛋白酶加工成57 kDa的形式[17]，從線粒體內(nèi)膜上代償性釋放并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，選擇性地破壞大分子量的DNA核酸分子，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

AIF主要在腦組織的神經(jīng)元細(xì)胞中表達(dá)。AIF評分的高低，取決于AIF免疫組化染色強(qiáng)度及AIF陽性細(xì)胞數(shù)占總的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)的百分比。本結(jié)果顯示，與對照組比較，AD組海馬的CA1、DG以及TC的Ⅰ-Ⅲ區(qū)，AIF評分顯著升高(P<0.05)，在海馬CA2、CA3、EC和TC Ⅳ-Ⅵ區(qū)的表達(dá)無明顯變化(P>0.05)；這與文獻(xiàn)報(bào)道[18]。 AIF參與了整個(gè)AD的病理過程,它的高表達(dá)具有雙重作用，一方面可代償性的對抗AD的病理性變化，比如對抗氧化應(yīng)激和清除呼吸機(jī)產(chǎn)生的相關(guān)自由基；另一方面，AIF又可引起AD的氧化應(yīng)激，AIF能促進(jìn)凋亡的發(fā)生[18-21]。AD組在海馬CA1、CA2、CA3、DG、EC和TC區(qū)的AIF細(xì)胞核轉(zhuǎn)移百分比升高(P<0.05)，說明在AD組和對照組各部位分區(qū)均出現(xiàn)了差異性，這也進(jìn)一步證實(shí)了在AD的大腦神經(jīng)細(xì)胞中發(fā)生了AIF核轉(zhuǎn)移，AIF的核轉(zhuǎn)移和AD的病理改變具有相關(guān)性，AIF從線粒體到細(xì)胞核的異位表達(dá)，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡，AIF是AD大腦中神經(jīng)細(xì)胞丟失的重要病理因子之一[18]。

注：鏡下100倍，標(biāo)尺為50 μm圖1　AIF蛋白在人腦海馬、EC及TC區(qū)的表達(dá)(100×)Fig.1　AIF score in hippocampus, entorhinal and temporal cortices

注：箭頭所示為鏡下所見AIF核染色陽性細(xì)胞圖2　兩組被檢者海馬各區(qū)、EC及TC的AIF核轉(zhuǎn)移(200×)Fig.2　Nuclear AIF-ir in the CA1, entorhinal and temporal cortices

[1]何建軍，羅玥佶.老年癡呆癥的病因及發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國老年學(xué)雜志， 2014 (34)：5924-5926.

[2]計(jì)德麗，李自如.細(xì)胞凋亡與阿爾茨海默病[J].內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)雜志, 2014 (3):296-300.

[3]劉敬東，張英. 凋亡誘導(dǎo)因子AIF在pSS患者唇腺中的異常表達(dá)[J]. 現(xiàn)代口腔醫(yī)學(xué)雜志, 2015(4): 202-204.

[4]郭曉東，楊永平，樓敏，等. 凋亡誘導(dǎo)因子AIF在肝癌組織中的表達(dá)及臨床意義[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2011(3): 502-504.

[5]王占強(qiáng)，張鴻. 凋亡誘導(dǎo)因子與缺血性腦神經(jīng)元凋亡[J]. 中國老年學(xué)雜志, 2011(1): 158-161.

[6]宋越，李俊，彭廣福. HSP70與AIF在大腸癌中的表達(dá)及其臨床意義[J]. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志, 2010(12): 1266-1267.

[7]王昌正，李英男，吳本儼，等. 凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)在胃癌細(xì)胞和組織中的表達(dá)及意義[J]. 現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué), 2008(7): 1184-1186.

[8]周小波，何作云，于學(xué)軍，等. AIF促進(jìn)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的肥大心肌細(xì)胞凋亡的研究[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2009(3): 262-266.

[9]Yu W, Guan ZZ, Bogdanovic N, et al. High selective expression of α7 nicotinic receptors on astrocytes in the brains of patients with sporadic Alzheimer's disease and patients carrying Swedish APP 670/671 mutation: a possible association with neuritic plaques[J]. Experimental Neurology, 2005(1): 215-225.

[10]Boddaert J, Kinugawa K, Lambert JC, et al. Evidence of a role for lactadherin in Alzheimer’s disease[J]. Am J Pathol, 2007(170):921-929.

[11]Herfs M, Hubert P, Kholod N, et al. Transforming growth factor-beta1-mediated Slug and Snail transcription factor up-regulation reduces the density of Langerhans cells in epithelial metaplasia by affecting E-cadherin expression[J]. Am J Pathol, 2008(172):1391-1402.

[12]張均田.神經(jīng)元-觸丟失與老年癡呆[J].神經(jīng)藥理學(xué)報(bào)， 2011(1):1-15.

[13]LeBlanc AC.The role of apoptotic pathways in Alzheimer's disease neurodegeneration and cell death[J]. Curr Alzheimer Res, 2005(4):389-402.

[14]Otera H, Ohsakaya S, Nagaura Z, et al. Export of mitochondrial AIF in response to proapoptotic stimuli depends on processing at the intermembrane space[J].EMBO J, 2005(24):1375-1386.

[15]Krantic S, Mechawar N, Reix S, et al. Apoptosis-inducing factor: a matter of neuron life and death[J]. Prog Neurobiol, 2007(81):179-196.

[16]Vahsen N, Cande C, Briere JJ, et al. AIF deficiencycompromises oxidative phosphorylation[J]. EMBO J, 2004(23):4679-4689.

[17]Polster BM, Basanez G, Etxebarria A,et al. Calpain I induces cleavage and release of apoptosis-inducing factor from isolated mitochondria[J]. J Biol Chem, 2005(280):6447-6454.

[18]Lee J, Cheon Y, Woo R, et al. Evidence of early involvement of apoptosis inducing factor-induced neuronal death in Alzheimer brain[J]. Anatomy & Cell Biology， 2012(1): 26.

[19]Williams TI, Lynn BC, Markesbery WR, et al. Increased levels of4-hydroxynonenal and acrolein, neurotoxic markers of lipid peroxidation, in the brain in Mild Cognitive Impairment and early Alzheimer’sdisease[J]. Neurobiol Aging, 2006(27):1094-1099.

[20]Zhu X, Lee HG, Perry G, et al. Alzheimer disease, the two-hithypothesis: an update[J]. Biochim Biophys Acta, 2007(1772):494-502.

[21]Savit BP, Jasneet KK, Hridesh B, et al.Role of apoptosis-inducing factor (Aif) in the T celllineage[J]. IJMR N, 2013(138):577-590.

(2016-01-31收稿，2016-06-30修回)

中文編輯： 吳昌學(xué)； 英文編輯： 劉華

Expression and Significance of Apoptosis Inducing Factor in the Brain of Alzheimer's Disease

YANG Mei, REN Zhenkui, YU Wenfeng, GUAN Zhizhong

(KeyLabofMedicalMolecularBiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou，China)

國家自然科學(xué)基金(81360199); 教育部科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(213032A); 貴州省國際科技合作項(xiàng)目[黔科合外G字(2013)7026號]

Email:wenfengyu2013@126.com

R34-33

A

1000-2707(2016)08-0869-05

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.08.001

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