滇藏相鄰地區(qū)高海拔山脈土壤微生物學(xué)調(diào)查

子建文，唐 輝，李 倩，資云海，張玉嶺，李曉霞

滇藏相鄰地區(qū)高海拔山脈土壤微生物學(xué)調(diào)查

子建文，唐 輝，李 倩，資云海，張玉嶺，李曉霞

目的 對滇藏相鄰地區(qū)山脈土壤中微生物數(shù)量、種類、構(gòu)成及藥敏情況進行調(diào)查分析。方法 分別在香格里拉、德欽及芒康3個地區(qū)選取海拔相近的4個山脈的陽坡面和陰坡面作為采樣點，按隨機布點法采集土壤標本，應(yīng)用TREK DLAGNOSTIC SYSTEMS LTD全自動微生物鑒定儀進行細菌和真菌的分離鑒定，藥敏試驗采用K-B法。采用VITEK 2系統(tǒng)進行厭氧菌的鑒定和藥敏試驗。結(jié)果 3個地區(qū)分別分離出細菌16種951株、13種764株、13種599株；真菌4種36株、2種31株、1種17株。各地區(qū)陰坡微生物總數(shù)明顯高于陽坡（P＜0.05），微生物以細菌為主（96.77%），真菌數(shù)量較少（3.23%）。細菌中革蘭陰性菌（54.84%）多于革蘭陽性菌（37.17%）和厭氧菌（4.76%）。微生物對常用抗生素較為敏感。結(jié)論 隨著海拔升高，滇藏相鄰地區(qū)山脈土壤中微生物數(shù)量和種類逐漸減少，藥物敏感率隨海拔增高而升高。初步掌握了滇藏相鄰地區(qū)山脈土壤微生物的數(shù)量、種類、構(gòu)成及藥敏情況，對該地區(qū)感染性疾病的預(yù)防、診治，微生物的開發(fā)利用及創(chuàng)傷救治等具有一定的指導(dǎo)意義。

滇藏線；土壤；微生物；調(diào)查；藥敏

滇藏線是滇西地區(qū)進入西藏的重要路徑之一，沿線地區(qū)自然災(zāi)害時有發(fā)生，人員受傷難以避免，傷口感染的微生物種類與環(huán)境微生物種類密切相關(guān)。本研究擬對滇藏相鄰的香格里拉、德欽及芒康3個地區(qū)的山脈土壤進行微生物學(xué)調(diào)查，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 樣地選擇 2014年11月中旬，分別在香格里拉（海拔3318 m）、德欽（海拔4404 m）及芒康（海拔4985 m）3地遠離農(nóng)戶、人群、牧場的地區(qū)，每個地區(qū)各選取4個海拔相近的點，每個點在陽坡和陰坡分別選擇4個采樣點。

1.2 標本采集 按隨機布點法［1］進行標本采集，具體方法參考《環(huán)境工程微生物學(xué)》［2］。

1.3 培養(yǎng)與鑒定

1.3.1 需氧菌與真菌 配制新鮮土壤懸液，稀釋105倍用于真菌培養(yǎng)，稀釋106倍用于細菌培養(yǎng)。方法和試劑參考《環(huán)境工程微生物學(xué)》［2］。

1.3.2 厭氧菌 方法和試劑參考《環(huán)境工程微生物學(xué)》［2］。

1.4 質(zhì)控菌株 大腸埃希菌ATCC-25922、銅綠假單胞菌ATCC-27853、金黃色葡萄球菌ATCC-25923、白色念珠菌ATCC10231、近平滑念珠菌ATCC22019，購自云南省臨床檢驗中心。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件包分析數(shù)據(jù)，WHonet 5軟件包對藥敏資料進行分析。不同地區(qū)陰坡或陽坡微生物數(shù)量之間比較采用單因素方差分析，有差異時兩兩比較用SNK-q檢驗，同一地區(qū)的陽坡和陰坡之間比較用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 微生物數(shù)量 3個地區(qū)陽坡的細菌總數(shù)之間無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；而真菌總數(shù)之間有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），香格里拉和德欽地區(qū)真菌數(shù)均顯著高于芒康地區(qū)（P＜0.05）。3個地區(qū)陰坡的細菌總數(shù)（或真菌總數(shù)）之間有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），即香格里拉最高，德欽次之，芒康最少。德欽地區(qū)陽坡和陰坡厭氧菌數(shù)均顯著高于香格里拉和芒康（P＜0.05）。3個地區(qū)陽坡和陰坡微生物總數(shù)均有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），即微生物總數(shù)（或真菌總數(shù)）陰坡＞陽坡。見表1。

2.2 微生物構(gòu)成 各種細菌或真菌在不同地區(qū)的構(gòu)成比無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。3個地區(qū)微生物數(shù)量和種類，香格里拉＞德欽＞芒康。各個地區(qū)革蘭陰性菌、革蘭陽性菌及真菌的構(gòu)成比均有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），革蘭陰性菌＞革蘭陽性菌＞厭氧菌＞真菌。見表2。

2.3 革蘭陰性菌藥敏試驗 氨基糖苷類和半合成青霉素類抗生素敏感率較高，除在香格里拉和德欽地區(qū)嗜水氣單孢菌對阿米卡星的敏感率分別為85.7%和95.2%外，其余均為100.0%。喹諾酮類中，左氧氟沙星對所細菌全部敏感，芒康所分離菌株對環(huán)丙沙星全部敏感；3個地區(qū)均有諾氟沙星耐藥菌株，其敏感率介于82%.0～100.0%。頭孢菌素中，頭孢哌酮/舒巴坦對革蘭陰性菌敏感率100.0%；其次是頭孢噻吩和頭孢唑啉，敏感率在85.7%～100.0%之間。3個地區(qū)革蘭陰性菌對碳青霉烯類敏感率 51.8%～100.0%，其中芒康地區(qū)敏感率最高，＞95.5%。稻黃色單胞菌和嗜水氣單孢菌對復(fù)方新諾明敏感率100.0%，其余細菌敏感率介于75.9%～100.0%之間。嗜水氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌和河流弧菌對氨曲南敏感率100.0%，其余細菌介于50.6%～94.4%之間。見表3、4。香格里拉土壤革蘭陰性菌藥敏試驗結(jié)果見參考文獻［3］。

2.4 革蘭陽性菌的藥敏試驗 除香格里拉地區(qū)發(fā)現(xiàn)耐氨芐西林的蠟樣芽胞桿菌和蘇云金芽孢桿菌外，其余菌株對青霉素、氨芐西林、環(huán)丙沙星、米諾環(huán)素、妥布霉素、阿米卡星和萬古霉素敏感率均為100.0%。腐生葡萄球菌和微球菌對所有抗生素敏感率均為100.0%。頭孢菌素對三個地區(qū)其余菌株敏感率分別是86.2%～94.4%、95.7%～100.0%和98.2%～100.0%。3個地區(qū)蠟樣芽胞桿菌對復(fù)方新諾明敏感率分別是90.8%、98.5%和100.0%，蘇云金芽孢桿菌敏感率分別是84.3%、100.0%和100.0%。紅霉素藥敏中，僅在香格里拉和德欽有少量耐藥的蘇云金芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌，其敏感率＞90.1%。見表5。香格里拉土壤革蘭陽性菌藥敏試驗結(jié)果見參考文獻［3］。

2.5 厭氧菌藥敏試驗 3個地區(qū)分離出6種厭氧菌，僅香格里拉地區(qū)分離出2株分別對青霉素和氯霉素耐藥的壞名梭菌，敏感率為90.9%，其余菌株敏感率均為100.0%。見表6。香格里拉土壤厭氧菌藥敏試驗結(jié)果見參考文獻［3］。

2.6 真菌藥敏試驗 合成類抗生素、伏立康唑及伊曲康唑?qū)?種真菌全部敏感，其中香格里拉土壤分離出青霉菌、曲霉菌、酵母菌和毛霉菌，藥敏試驗結(jié)果見文獻［3］。咪唑類抗生素中，除根霉菌和毛霉菌對所有抗生素敏感外，3個地區(qū)均有耐酮康唑的菌株，敏感率88.9%～94.1%。僅香格里拉地區(qū)分離出耐1株耐克霉唑和特比萘芬的曲霉菌，其余菌株敏感率均為100.0%。表7。

表1 各地區(qū)土攘微生物數(shù)量分布［×1O6cfu/g］

表2 各地區(qū)土攘微生物種類及分布［株（%）］

表3 德欽土壤中革蘭陰性菌對常用抗生素藥物的敏惑性［株（%）］

表4 芒康土攘中革蘭陰性菌對常用抗生素藥物的敏感性［株（%）］

表5 德欽和芒康土壤革蘭陽性菌對常用抗生素敏感性［株（%）］

表6 德欽和芒康土攘厭氫菌對常用抗生素的敏感性［株（%）］

表7 德欽和芒康土壤真菌對常用抗生素的敏感性［株（%）］

3 討論

滇藏相鄰地區(qū)自然災(zāi)害和事故時有發(fā)生，受傷人員傷口創(chuàng)面可不同程度被土壤中的微生物污染，創(chuàng)面感染微生物的種類與受傷部位周邊存在的微生物分布密切相關(guān)［4］。有關(guān)動物模型實驗表明，傷口早期感染細菌與所處環(huán)境細菌譜有交叉重疊［5］。

本次調(diào)查結(jié)果表明，3個地區(qū)陰坡細菌總數(shù)和真菌總數(shù)均顯著高于陽坡（P＜0.05），可能是因為山脈陰陽坡面日照輻射和相對溫濕度有明顯差異，導(dǎo)致陰陽坡之間的細菌和真菌生長環(huán)境條件不同［6-7］。3個地區(qū)細菌總數(shù)香格里拉最高，德欽次之，芒康最少。真菌總數(shù)之間有顯著差異（P＜0.05），兩兩比較，香格里拉和德欽之間無顯著差異（P＞0.05），該兩地區(qū)真菌數(shù)均顯著高于芒康（P＜0.05）。德欽地區(qū)厭氧菌總數(shù)顯著高于香格里拉和芒康（P＜0.05）。滇藏相鄰高海拔山坡地區(qū)土壤微生物數(shù)量（平均7.23× 106cfu/g）明顯低于其他低海拔地區(qū)（12.34×106cfu/g）［8］?？赡苁请S著沿線海拔的升高，溫度降低、紫外線強度增加，土壤中微生物數(shù)量逐漸降低，種類逐漸減少［9］。

3個地區(qū)微生物種類不盡相同，細菌和真菌種類數(shù)以香格里拉最多，德欽次之，芒康最少，而各種細菌或真菌在3個地區(qū)土壤中微生物構(gòu)成比沒有顯著差異（P＞0.05）。3個地區(qū)均檢出痢疾志賀菌、河流弧菌、蠟樣芽胞桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌和青霉菌等致病菌。香格里拉還檢出銅綠假單胞菌、棲稻黃色單胞菌、壞名梭菌、海洋梭菌及曲霉菌、酵母菌和毛霉菌。微球菌、諾氏梭菌、艱難梭菌和根霉菌僅在德欽檢出?；撾[秘桿菌僅在芒康檢出。細菌中革蘭陰性菌（54.84%）數(shù)量多于革蘭陽性菌 （37.17%），多于厭氧菌（4.76%）；革蘭陰性菌中優(yōu)勢菌為痢疾志賀菌（9.37%）和侵肺巴斯德菌（9.10%），革蘭陽性菌中優(yōu)勢菌為蘇云金芽孢桿菌（10.75%）和蠟樣芽孢桿菌（10.48%）；厭氧菌以產(chǎn)氣莢膜梭菌 （1.42%）最多；真菌中以曲霉菌為優(yōu)勢菌群（2.3%）。上述微生物除可導(dǎo)致外傷或火器傷傷口感染外，還可引起腹瀉、心內(nèi)膜炎、肺炎、關(guān)節(jié)炎等相關(guān)疾病的發(fā)生。

3個地區(qū)土壤中分離的微生物藥敏試驗結(jié)果表明，滇西地區(qū)高海拔山脈土壤中細菌和真菌對絕大多數(shù)抗生素敏感，其敏感率高于低海拔地區(qū)［8］。然而，即使分離出的細菌和真菌對常用抗生素的敏感率隨海拔的升高逐漸升高，在遠離農(nóng)戶、人群、牧場的高海拔地區(qū)仍然檢出了少量對青霉素、頭孢菌素、復(fù)方新諾明、氨曲南和酮康唑等耐藥的菌株，厭氧菌僅在香格里拉地區(qū)分離出2株分別對青霉素和氯霉素耐藥的壞名梭菌，敏感率為90.9%，其余菌株敏感率均為100.0%?？赡苁桥c長期使用此類抗生素，耐藥菌株隨著空氣流動、人類和動物活動所遷移相關(guān)［10］，提示應(yīng)加強對抗生素合理使用的宣傳和管理。

綜上所述，本研究初步掌握了滇藏相鄰地區(qū)土壤微生物的種類、數(shù)量、分布及藥敏情況，對該地區(qū)感染性疾病的預(yù)防、診治，微生物的開發(fā)利用及創(chuàng)傷救治等具有一定的指導(dǎo)意義。

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1004-0188（2016）09-1089-05

10.3969/j.issn.1004-0188.2016.09.050

2016-02-25）

成都軍區(qū)“十二五”計劃面上項目（C14015）

671003云南 大理，解放軍60醫(yī)院

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