一株高產納豆激酶菌株的鑒定與分析

王雪妍 孫玉飛 馮菲 陳曉飛 李鋒 周伏忠

（河南省科學院生物研究所有限責任公司 河南省微生物工程重點實驗室，鄭州 450008）

一株高產納豆激酶菌株的鑒定與分析

王雪妍 孫玉飛 馮菲 陳曉飛 李鋒 周伏忠

（河南省科學院生物研究所有限責任公司 河南省微生物工程重點實驗室，鄭州 450008）

鑒定高產納豆激酶菌株Td，分析納豆激酶的分子特征。利用菌體形態(tài)、生理生化特征、以及分子生物學方法對菌株Td進行鑒定；并采用MALDI-TOF質譜測定與分析、SDS-PAGE和纖溶活性測定等方法檢測納豆激酶特性，利用PCR方法擴增納豆激酶的基因全長。結合菌體形態(tài)、生理生化特征和16S rDNA、gyrA基因序列、DNA-DNA雜交率等實驗結果，鑒定菌株Td為枯草芽孢桿菌枯草亞種（Bacillus subtilis subsp. subtilis）；菌株Td發(fā)酵產生的納豆激酶產量可達300 mg/L以上，占發(fā)酵液總蛋白的40%以上；纖溶活性達230 U/mL以上；氨基酸序列與subtilisin E的序列相似性最高；基因全長序列為1 143 bp?？莶菅挎邨U菌枯草亞種Td是一株高產、高活性納豆激酶的產生菌，具有優(yōu)良的工業(yè)化開發(fā)價值。

枯草芽孢桿菌枯草亞種；納豆激酶；菌株鑒定

納豆激酶（Nattokinase，NK）是由枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）代謝產生的一種絲氨酸蛋白酶，是目前國內外研究和開發(fā)溶栓藥物的熱點［1］。產生納豆激酶的菌種大多來源于日本納豆或中國豆豉等傳統(tǒng)的發(fā)酵食品經篩選獲得，這些篩選方法是建立在纖溶活性基礎上的，如纖維平板法和纖維降解法［2］，然而有很多類似的酶具有相同的纖溶活性，如subtilisin DJ-4、subtilisin DFE和纖溶酶BSF1［3-5］，對納豆激酶產生菌的篩選帶來了干擾。納豆激酶的基因aprN，在這些纖溶活性的酶中具有專一性［6］，因此，采用PCR方法檢測納豆激酶基因和測定纖溶活性兩者相結合的方法為一種高效篩選獲得納豆激酶產生菌的途徑，幾乎未檢索到這方面的報道。

目前納豆激酶發(fā)酵活性或產量不高，阻礙了產業(yè)化開發(fā)進程。近年來通過基因工程手段，研究人員獲得了一些納豆激酶的基因工程菌種，但酶活力或產量也并不理想。在基因水平上，納豆激酶產生菌（納豆菌）的基因組信息獲得了解析并已經公開發(fā)表［7］，因此，從分子水平上對納豆激酶進行研究奠定了基礎。各國學者對納豆激酶發(fā)酵工藝［8-10］、分離純化技術［11］、高產菌株誘變與選育［12］以及納豆激酶代謝動力學和作用機理等［13，14］諸多方面進行了大量研究，獲得許多較為重要的進展。同時繼續(xù)尋找不同來源的納豆激酶高產菌，以得到具有工業(yè)化潛在應用價值的新菌株，也越來越受到人們的關注。本課題組經多年的研究，從發(fā)酵豆制品中選育出1株納豆激酶高產菌株，前期對納豆激酶酶學性質、發(fā)酵培養(yǎng)、分離純化及體外溶栓特性等方面進行過研究［15-17］，現(xiàn)在正進行納豆激酶保健產品的開發(fā)和應用研究。然而，前期的工作未對納豆激酶和菌株名稱進行確切的鑒定，一直是以測定纖溶活性這種傳統(tǒng)方法為基礎進行研究的。本研究擬利用檢測納豆激酶分子（蛋白和基因）與測定纖溶活性相結合的方法對納豆激酶進行鑒定，同時結合分子生物學方法將該高產菌株的名稱定名到亞種的水平，旨在為產納豆激酶菌株的鑒定提供借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試樣品 分離菌株的樣品分別來源于中國傳統(tǒng)食品自然發(fā)酵的豆豉；枯草芽孢桿菌枯草亞種（B. subtilis subsp. subtilis）168菌株來自于中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 主要試劑 凝血酶、人纖維蛋白原均購自中國藥品生物制品檢定所；酵母粉、胰蛋白胨為Oxoid公司產品；其他試劑均為國產分析純試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：酵母粉5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，pH7.2（固體加1.5%瓊脂粉）；發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖5 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCI 5 g/L，pH值7.2-7.4。

1.2 方法

1.2.1 菌種的分離純化 用無菌牙簽挑取少量豆豉表面的黏性物質，接種到10 mL無菌水的試管中充分攪拌，制成懸濁液。取少量懸濁液，涂布在LB培養(yǎng)基平板上，待風干后倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-24 h，挑取平板上長出的有皺褶的白色菌落，鏡檢觀察。繼續(xù)劃線純化1次，挑取單菌落，保存于LB培養(yǎng)基斜面上。

1.2.2 纖溶活性測定 采用纖維蛋白平板法測定納豆激酶活性［18］。將分離獲得的不同菌株接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中于37℃下振蕩培養(yǎng)過夜，發(fā)酵液8 000 r/min離心5 min得到上清粗酶液。取粗酶液10 μL點于纖維蛋白平板上，倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h后測量透明圈直徑，計算納豆激酶的纖溶活性，篩選獲得活性最高的菌株，編號為Td。

1.3 菌株鑒定

1.3.1 菌株形態(tài)及生理生化特性測定 觀察高產菌株Td的菌落和菌體形態(tài)，參照《常見細菌鑒定手冊》并與枯草芽孢桿菌枯草亞種168對比進行生理生化鑒定試驗［19］。

1.3.2 分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹構建 參照《分子克隆實驗指南》描述的方法提取菌株Td的基因組DNA［20］。分別應用16S引物（27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）和解旋酶gyrA引物（gyrA-42F：5'-CAGTCAGGAA ATGCGTACGTCCTT-3'；gyrA-1066R：5'-CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT-3'）進行PCR擴增［21］，目的產物純化后由北京華大基因有限公司進行測序。將獲得的16S rDNA和gyrA序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對，確定與其親緣關系最近的屬種，并從數(shù)據(jù)庫下載獲得相關種屬的gyrA基因序列，構建系統(tǒng)發(fā)育樹。序列比對用ClustalX 2.1進行，系統(tǒng)進化樹的構建采用MEGA 5.0軟件進行，應用Neighbour-Joining方法進行bootstrap分析，重復次數(shù)為1 000。

1.3.3 基因組DNA-DNA雜交分析 根據(jù)上述方法提取菌株Td和菌株168的基因組DNA，用儀器DU800進行DNA-DNA雜交分析。通過超聲斷裂法（400 W，2 s，6次）剪切基因組DNA，使DNA片段在1 000-2 000 bp之間。將剪切過的DNA用 0.1×SSC精確配置成OD260為1.5-2.0。取Td、168（分別標記為a，b）各300 μL及兩者各150 μL的混合物（標記為m），分別加到1.5 mL離心管中，于沸水浴中變性10 min，并用預熱的槍頭吸取75 μL預熱的10×SSC溶液加入變性樣品中，吹打混勻，使終濃度為2×SSC，固定溫度為最適復性溫度（Tor），以2×SSC為空白對照，復性45 min，在260 nm波長下，每隔25 s測一次吸光值，作出復性曲線，計算復性速率Va、Vb、Vm，并用下式計算DNA-DNA雜交度D%=［4Vm-（Va+Vb）］/2（VaVb）1/2。

1.4 納豆激酶的鑒定

1.4.1 SDS-PAGE凝膠電泳檢測納豆激酶產量 配制濃度為5%濃縮膠、12%分離膠的聚丙烯酰胺凝膠用于納豆激酶產量的SDS-PAGE分析，每個點樣孔加入1.2.2中描述的發(fā)酵液16 μL進行電泳。電泳完畢后對凝膠用考馬斯亮藍R-250染色蛋白質條帶，使用quantity one軟件對蛋白進行定量分析。

1.4.2 MALDI-TOF質譜分析鑒定納豆激酶 將菌株Td培養(yǎng)得到的發(fā)酵液進行SDS-PAGE電泳分離，切膠回收目的大小的條帶，用胰蛋白酶（Trypsin）進行膠內酶切處理來進行MALDI-TOF質譜分析。獲得的肽質量指紋圖譜應用MASCOT 2.0軟件進行NCBI蛋白質數(shù)據(jù)庫的檢索分析。

1.4.3 納豆激酶基因的克隆 根據(jù)1.4.2的結果，并參照GenBank公布的納豆激酶基因來設計一對引物，序列分別為F：5'-TCAGCATAATGAACATTTACTCA -3'和R：5'-GGTTGATCCTCCGGTGCTTGTGA-3'。參照1.3.2中方法提取菌株Td基因組DNA為模板進行PCR擴增納豆激酶基因。PCR反應體系（50 μL）：10×rTaq Reaction Buffer 5 μL，rTaq DNA聚合酶2.5 U，上下游引物（10 mmol/L）各2 μL，10 mmol/L dNTPs 3 μL，補足ddH2O至50 μL。反應條件：94℃預變性5 min后進入循環(huán)，94℃ 50 s，56℃ 40 s，72℃2 min，循環(huán)30次，最后72℃延伸10 min。PCR產物經純化后連接到質粒pMD18-T載體上，連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，堿裂解法提取大腸桿菌轉化子質粒。經酶切鑒定后，將驗證為陽性的重組質粒送至北京華大基因有限公司進行序列測定。

2 結果

2.1 納豆激酶高產菌株的篩選

從供試樣品中共分離得到18株菌株，將篩選得到的菌株經過再次純化、發(fā)酵培養(yǎng)，用纖維蛋白法測其納豆激酶的活性大小。根據(jù)在纖維蛋白原平板上產生透明圈的大?。▓D1），最終確定1號菌株為高產菌株，編號為Td。

圖1 不同菌株發(fā)酵液的纖溶活性

2.2 菌種鑒定

2.2.1 菌株形態(tài)與生理生化反應 在LB培養(yǎng)基平板上于37℃恒溫培養(yǎng)24 h后，菌株Td的菌落呈圓形，表面粗糙有皺褶、微突起、邊緣不整齊、無光澤、呈乳白或灰白色，菌落直徑3-4 mm。顯微鏡下觀察菌體呈桿狀，單個或鏈狀排列，大?。?.0-3.0）μm×（0.6-0.8）μm，有鞭毛，能運動，芽孢呈橢圓或柱狀。

以標準菌株168作為對照菌株，與菌株Td共同進行生理生化特性的試驗。結果（表1）表明，菌株Td與菌株168生理生化特性相同，因此可以確定菌株Td符合芽孢桿菌屬（Bacillus）的特征。

表1 菌株Td與菌株168的生理生化特性

2.2.2 分子鑒定與系統(tǒng)發(fā)育樹 根據(jù)16S rDNA序列的測定結果，與GenBank 中已經登錄的序列進行BLAST檢索比對，結果顯示菌株Td的16S rDNA與芽孢桿菌屬（Bacillus）不同種具有高度相似，同源性高達99%以上；而基因gyrA進行BLAST檢索比對結果表明，與枯草芽孢桿菌枯草亞種（B. subtilis subsp. subtilis）的相似性最高，達100%。根據(jù)BLAST檢索結果，篩選芽孢桿菌屬相關物種的gyrA基因序列與供試菌株Td的序列進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構建。結果（圖2）表明，菌株Td與枯草芽孢桿菌枯草亞種聚為一個分支上，而與其他物種相距較遠。

圖2 芽孢桿菌屬部分菌種的gyrA基因系統(tǒng)發(fā)育樹（括號內數(shù)字表示GenBank的登錄號）

2.2.3 DNA-DNA雜交分析 經DU-800測定與分析，根據(jù)表2的結果，計算菌株Td與標準菌株168的復性速率為Va=0.002 7和Vb=0.002 3，混合樣品的復性速率Vm=0.002 4，代入雜交率計算公式得出菌株Td與標準菌株168的DNA雜交率D%=92.3%，顯著高于80%的閾值，因此可以確定兩者為同一個亞種。

綜合形態(tài)特征和分子鑒定的結果，鑒定菌株Td為枯草芽孢桿菌枯草亞種。

2.3 納豆激酶的活性與鑒定

2.3.1 納豆激酶的溶解纖維蛋白活性 納豆激酶活性越高，在纖維蛋白平板上的透明圈直徑則越大。根據(jù)活性測定結果（圖1），Td產生的透明圈明顯比其它菌株的大，因此菌株Td產生的納豆激酶活性最高，纖溶活性達237 U/mL。

2.3.2 SDS-PAGE電泳分析 菌株Td發(fā)酵液進行SDS-PAGE凝膠電泳的結果（圖3-A）顯示，泳道中的蛋白質雜質譜帶較少，其中有1條明顯較亮的蛋白質譜帶。與標準分子量蛋白比較和計算，得出此條帶的蛋白分子量大小約為27 kD；應用quantity one軟件計算蛋白產量可達300 mg/L，占總蛋白的40%以上。

表 2 DNA樣品a、b、m的復性速率

圖3 納豆激酶的SDS-PAGE和PCR擴增基因的電泳圖

2.3.3 MALDI-TOF質譜分析 從圖3-A凝膠中挖取最亮的蛋白質條帶采用胰蛋白酶進行膠內酶切后用于MALDI-TOF分析。根據(jù)肽質量指紋譜和數(shù)據(jù)庫檢索結果，MASCOT 值最高達150，與枯草芽孢桿菌的蛋白酶Subtilisin E相似性最高；驗證了7條序列，分別為：GAYSLSLR、GFFLFVEGGR、GSSIFGLAPGK、SSGTSYPDVLK、VCNYVSWIK、GSSIFGLAPGK、LNTLETEEWFFK，這與納豆激酶的序列完全相同。

2.3.4 納豆激酶的基因序列 根據(jù)PCR擴增條帶（圖3-B）和基因序列測定（圖4）結果，獲得了菌株Td的納豆激酶全基因序列。菌株Td的納豆激酶基因全長為1 143 bp，以GTG 為起始密碼子，起始密碼子上游 -17- -11 bp位點為核糖體結合位點SD 序列，SD序列上游是A/T含量高達72%的轉錄調控區(qū)域。隨后是由1 143 bp組成的開放閱讀框架，編碼379個氨基酸，其中氨基酸序列的前27個氨基酸為信號肽序列，隨后的77個氨基酸為前導肽序列，最后的275個氨基酸為成熟肽?；虻?'末端是3個連續(xù)的終止密碼子TAA、TAG 和TAA，轉錄終止序列位于成熟蛋白區(qū)域C端下游7 bp處，該段終止序列可形成莖環(huán)結構，即ρ因子非依賴性終止序列。

3 討論

納豆激酶（nattokinase）是枯草芽孢桿菌產生的一種胞外絲氨酸蛋白激酶，在血栓、血脂、血壓、抗癌、糖尿病等方面均有預防和治療的功能，已為國際社會所接受，但是對其產生菌的定名卻存在爭議。目前已經發(fā)表的文章采用的納豆枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis subsp. natto）或枯草芽孢桿菌納豆亞種（Bacillus subtilis subsp. natto），嚴格意義上來說并非一個合法有效的名稱，只是人們的傳統(tǒng)習慣命名。目前有效發(fā)表的枯草芽孢桿菌有3個亞種，分別為B. subtilis subsp. subtilis、B. subtilis subsp. spizizenii和B. subtilis subsp. inaquosorum，已為研究人員所接受［22］。本研究也遵從此命名法，認為定名為枯草芽孢桿菌枯草亞種（Bacillus subtilis subsp. subtilis）較為適宜。

枯草芽孢桿菌及其近緣種群（簡稱枯草群）是一群表型相似的革蘭氏陽性、產芽孢的桿菌，但是單一的鑒定技術不能完全勝任枯草群菌株的鑒定，特別是通過生理生化等表型特征分析的方法。雖然16S rDNA基因序列廣泛應用于細菌鑒定或構建細菌的系統(tǒng)進化關系，但對于枯草群的菌種由于序列間的相似度太高而不能有效區(qū)分開來，因此通過表型特性和16S rDNA序列分析將菌株鑒定到種缺乏有力的證據(jù)。近年來研究者發(fā)現(xiàn)以編碼蛋白的基因作為系統(tǒng)發(fā)育鑒定標記可以彌補16S rDNA基因的不足，如gyrA基因、gyrB基因、ropD基因等［23，24］。Rooney 等［21］利用gyrA 基因研究了枯草芽孢桿菌種間的復雜性發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌的不同菌株間存在很大的差異；可以基于gyrA 基因的差異分為不同的群。本研究結果顯示，單獨利用gyrA 基因進行BLAST 搜索時，所獲信息主要是Rooney 等登錄的信息，利用這些信息構建系統(tǒng)發(fā)育樹時，可以發(fā)現(xiàn)菌株Td與已知菌株間的親緣關系，因此根據(jù)NCBI上登錄的gyrA 基因信息來鑒定枯草芽孢桿菌是可行的。

圖4 菌株Td的納豆激酶基因及編碼蛋白質序列

應用全基因組DNA雜交方法作為公認的標準來劃分細菌的種已為廣大分類學家所接受，并且普遍認為，細菌種內DNA-DNA雜交同源性為60%-100%；80%-90%以上的雜交同源性屬于種內同一亞種水平；60%-70%以上的雜交同源性屬于種內不同亞種水平；而20%-60%的同源性則代表著待定菌株是與參比菌株靠近的種。本研究中菌株Td與枯草芽孢桿菌枯草亞種標準菌株168的DNA-DNA雜交同源性達到了92.3%，顯著高于同一亞種的DNA雜交同源性標準；同時參照16S rDNA和gyrA的基因序列信息，因此將菌株Td定名為枯草芽孢桿菌枯草亞種。

納豆激酶的名稱最初命名為BSP［25］，隨后改為subtilisin NAT［6］。比較納豆激酶的氨基酸序列與其他幾種枯草桿菌蛋白酶發(fā)現(xiàn)它們有較高的同源性，與枯草桿菌蛋白酶E（Subtilisin E）的同源性達到99.5%，與枯草桿菌蛋白酶amylosacchariticus、subtilisin BPN和subtilisin Carlsberg的同源性也分別達到99.3%、86%和72%［6］。本研究應用MALDITOF質譜分析獲得的結果與subtilisin E相似性最高，這可能與兩者序列高度相似有關。利用PCR克隆獲得的納豆激酶全基因序列推導出的氨基酸序列也與已報道的納豆激酶的氨基酸序列完全一致。通過對菌株Td發(fā)酵液進行SDS-PAGE測定納豆激酶的分子量大小、MALDI-TOF分析氨基酸序列特征和PCR克隆全基因序列，三者取得了一致的結果，相互印證了納豆激酶的氨基酸和核酸序列，為鑒定納豆激酶提供了依據(jù)。另外，本研究成功地克隆了納豆激酶全長基因，這為下一步的基因工程菌株的構建和納豆激酶的活性改造奠定了基礎。

4 結論

根據(jù)菌體形態(tài)、生理生化特征和16S rDNA、gyrA基因序列、DNA-DNA雜交率等實驗結果，鑒定菌株Td為枯草芽孢桿菌枯草亞種（Bacillus subtilis subsp. subtilis）；通過MALDI-TOF質譜分析和PCR克隆基因，鑒定了菌株Td產生的納豆激酶的分子特征；SDS-PAGE和纖溶活性測定表明菌株Td是一株高產納豆激酶菌株。

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（責任編輯李楠）

Identification and Analysis of a Nattokinase-producing Strain

WANG Xue-yan SUN Yu-fei FENG Fei CHEN Xiao-fei LI Feng ZHOU Fu-zhong
（Institute of Biology Co.，Ltd.，Henan Academy of Sciences，Key Laboratory of Microbial Engineering of Henan Province，Zhengzhou 450008）

The objective of this work is to identify an isolate Td of yielding high nattokinase， and to analyze the molecular characteristics of its nattokinase. The morphologic， biochemical and physiological characterizations， and molecular biological methods were used to identify the taxonomic position of isolate Td；mass spectrometric determination and analysis of MALDI-TOF， SDS-PAGE and fibrinolytic activity were employed to measure the characteristics of nattokinase， and PCR method was adopted to clone the full length of nattokinase gene. The bacterial strain Td was identified as Bacillus subtilis subsp. subtilis according to the results of morphologic， biochemical and physiological characterizations， as well as 16S rDNA， the sequences of 16S rDNA gyrA， hybrid rate of DNA-DNA. The yield of nattokinase produced by strain Td reached 300 mg/L， accounted for over 40% of the total protein. Fibrinolytic activity was over 230 U/mL. Amino acid sequence of nattokinase produced by Td showed the highest similarity to the subtilisin E. and the full length of the gene was 1143 bp. Conclusively， as a high-yield and high-activity strain for nattokinase， B. subtilis subsp. subtilis Td is a promising candidate for industrial development and utilization.

Bacillus subtilis subsp. subtilis；nattokinase；strain identification

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.030

2015-05-06

河南省重點實驗室建設專項項目（122300413214），河南省重點科技攻關項目（142102210087），鄭州市攻關計劃項目（141PPTGG415）資助項目。

王雪妍，女，研究方向：微生物發(fā)酵工程；E-mail：1060877396@qq.com

李鋒，男，博士，研究方向：微生物技術與應用；E-mail：lifengac@126.com