子宮內(nèi)膜癌患者外周血調(diào)節(jié)性T細胞與腫瘤免疫的相關(guān)性*

于丹軍， 樊　靜， 劉廣賢， 胡　月， 趙　月， 薛丹鳳， 孫鳳英

(1.秦皇島市第一醫(yī)院 檢驗科， 河北 秦皇島　066000； 2.秦皇島市第四醫(yī)院 檢驗科， 河北 秦皇島　066000； 3.解放軍307醫(yī)院 腫瘤研究所， 北京　100071)

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子宮內(nèi)膜癌患者外周血調(diào)節(jié)性T細胞與腫瘤免疫的相關(guān)性*

于丹軍1， 樊靜2**， 劉廣賢3， 胡月1， 趙月2， 薛丹鳳2， 孫鳳英2

(1.秦皇島市第一醫(yī)院 檢驗科， 河北 秦皇島066000； 2.秦皇島市第四醫(yī)院 檢驗科， 河北 秦皇島066000； 3.解放軍307醫(yī)院 腫瘤研究所， 北京100071)

目的： 研究子宮內(nèi)膜癌(EC)患者外周血CD4+CD25+CD127LOW和CD4+CD25+foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)的百分比(CD4+CD25+CD127LOWTreg/CD4、CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4)與EC患者血清白細胞介素-10(IL-10)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)、TGF-β2水平的相關(guān)性，探討CD4+CD25+Treg在腫瘤免疫逃逸中的作用機制。方法： 30例確診的EC患者(EC組)及30例健康體檢女性(對照組)，用流式細胞術(shù)分別檢測EC組手術(shù)前后和化療后及對照組外周血CD4+CD25+CD127LOWTreg/CD4、CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4，同時用ELISA法檢測上述時點2組被檢者血清IL-10、TGF-β1及TGF-β2含量；比較對照組、EC組手術(shù)前外周血CD4+CD25+CD127LOWTreg/CD4、CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4及血清TGF-β1、TGF-β2、IL-10含量，比較EC患者手術(shù)前、手術(shù)后及化療后外周血CD4+CD25+CD127LOWTreg/CD4 、CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4及血清TGF-β1、TGF-β2及IL-10含量，采用spearman相關(guān)分析法分析EC患者外周血CD4+CD25+CD127LOWTreg/CD4、CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4與手術(shù)前血清IL-10、TGF-β1及TGF-β2含量的相關(guān)性。結(jié)果： 與對照組比較，EC組患者手術(shù)前外周血CD4+CD25+CD127LOWTreg/CD4、CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4、血清IL-10的含量均明顯升高, TGF-β2含量明顯降低(P<0.01)；與手術(shù)前比較，EC組患者手術(shù)后及化療后CD4+CD25+CD127LOWTreg/CD4、CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4、血清IL-10和TGF-β2含量明顯降低(P<0.01)，手術(shù)后血清TGF-β1含量無明顯變化(P>0.05)，而化療后血清TGF-β1含量明顯降低(P<0.01)；EC組患者CD4+CD25+CD127LOWTreg/CD4與血清TGF-β1含量存在正相關(guān)(r=0.284,P=0.049)，CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4與血清IL-10含量存在正相關(guān)(r=0.287,P=0.047)。結(jié)論： EC患者外周血CD4+CD25+CD127LOWTreg、CD4+CD25+Foxp3+Treg水平上調(diào)，可能是腫瘤產(chǎn)生免疫耐受，發(fā)生腫瘤免疫逃逸的原因。

子宮內(nèi)膜腫瘤； 調(diào)節(jié)性T細胞； 細胞因子； 免疫耐受； 流式細胞術(shù)

子宮內(nèi)膜癌(endometrial carcinoma，EC)是婦科三大惡性腫瘤之一，有研究發(fā)現(xiàn)婦科惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與腫瘤免疫逃逸密切相關(guān)[1]。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞(T regulatory cell, Treg)是一種新型的免疫抑制細胞，能維持機體耐受和免疫穩(wěn)定的狀態(tài)，預(yù)防自身免疫性疾病，CD4+CD25+Treg能降低腫瘤免疫治療的效果，產(chǎn)生免疫抑制，在腫瘤免疫的逃逸中起到重要作用[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，惡性程度越高的EC患者體內(nèi)CD4+CD25+Treg細胞越多，患者的預(yù)后越差[4]。因此，推測外周血中CD4+CD25+Treg可能參與了EC的發(fā)生和發(fā)展。本研究通過比較EC患者外周血中CD4+CD25+CD127LOWTreg及CD4+CD25+foxp3+Treg在CD4+T淋巴細胞(CD4)中的百分比(CD4+CD25+CD127LOWTreg/ CD4、CD4+CD25+Foxp3+Treg/ CD4)及其與血清中轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1， TGF-β1)、TGF-β2和白細胞介素-10(interleukin-10)等細胞因子的相關(guān)性，了解CD4+CD25+Treg在EC的發(fā)生及發(fā)展中的意義。

1　對象與方法

1.1對象、試劑及儀器

選擇2014年8月～2015年8月經(jīng)病理確診的EC患者30例作為EC組，EC患者確診后均未進行放化療、未行激素或者生物免疫治療，42～75歲，平均(52.3±7.6)歲；中低分化10例，高分化20例；Ⅰ～Ⅱ期18例， Ⅲ～Ⅳ期12例。選擇同時期的健康女性體檢者30例為對照組，33～77歲，平均(50.5±6.7)歲；均未妊娠，排除近期感染和自身免疫性疾病、使用糖皮質(zhì)激素和非甾體類藥物者。兩組被檢者一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。本研究獲醫(yī)院倫理委員會批準，所有被檢者均簽署知情同意書。儀器為Beckman Coulter EP-ICS XL流式細胞儀(購自美國貝克曼公司)，試劑有鼠抗人 FITC-CD4、PE-CD25、PC5-CD127、同型對照鼠抗人IgG(購自美國貝克曼公司)、Foxp3(Forkhead /winged-helix transcription factor box P3 )試劑盒(購自美國ebioscience公司)，IL-10、TGF-β1及TGF-β2試劑盒(購自Rapibio公司)。

1.2方法

1.2.1標本采集EC組于手術(shù)前1 d、手術(shù)后1個月及化療4個周期后，對照組于體檢時采集靜脈血8 mL，均分3管；兩管用EDTA抗凝，分別測定CD4+CD25+CD127LOWTreg/CD4、CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4；第3管不抗凝，靜置分層，收集血清測定IL-10、TGF-β1及TGF-β2水平。1.2.2CD4+CD25+CD127LOWTreg/CD4、CD4+CD25+Foxp3+Treg/ CD4檢測采用流式細胞術(shù)，取1.2.1項下2管抗凝全血，分別加入鼠抗人FITC-CD4、PE-CD25、PC5-127抗體或PC5-Foxp3抗體及同型對照，避光孵育15 min進行表面染色，固定破膜后加入相應(yīng)熒光抗體，離心棄上清后上機檢測。

1.2.3IL-10、TGF-β1及TGF-β2的檢測采用ELISA法，取1.2.1項下分離的血清，按照試劑盒說明書的操作步驟檢測IL-10、TGF-β1及TGF-β2含量。

1.3觀察指標

比較對照組與EC組患者手術(shù)前外周血CD4+CD25+CD127LOWTreg/ CD4 、CD4+CD25+Foxp3+Treg/ CD4和血清TGF-β1、TGF-β2及IL-10含量，比較EC患者手術(shù)前、手術(shù)后及化療后外周血CD4+CD25+CD127LOW/CD4、CD4+CD25+Foxp3+/CD4及血清TGF-β1、TGF-β2、IL-10含量，采用spearman相關(guān)分析法分析EC患者外周血D4+CD25+CD127LOWTreg/CD4、CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4與手術(shù)前血清TGF-β1、TGF-β2及IL-10含量的相關(guān)性。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

2　結(jié)果

2.1外周血CD4+CD25+CD127LOW/CD4、CD4+CD25+Foxp3+/CD4及血清TGF-β1、TGF-β2、IL-10含量

與對照組比較，EC組患者手術(shù)前外周血CD4+CD25+CD127LOW/CD4、CD4+CD25+Foxp3+/CD4、血清IL-10的含量均明顯升高, TGF-β2含量明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；TGF-β1含量雖然升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1，圖1。

表1　對照組與EC組手術(shù)前外周血CD4+CD25+CD127LOW/CD4、CD4+CD25+Foxp3+/CD4及血清TGF-β1、TGF-β2、IL-10含量

注： A、C為對照組，B、D為EC組圖1　對照組與EC組手術(shù)前外周血CD4+CD25+CD127LOW/CD4、CD4+CD25+Foxp3+/CD4Fig.1　The CD25+foxp3+ Treg CD25+CD127LOWTreg accounted for CD4+ T lymphocyte ratio in peripheral blood of two groups

2.2EC患者外周血CD4+CD25+CD127LOWTreg/CD4、CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4及血清TGF-β1、TGF-β2、IL-10含量

與手術(shù)前比較，EC患者手術(shù)后及化療后外周血CD4+CD25+CD127LOW/CD4、CD4+CD25+Foxp3+/CD4、血清TGF-β2、IL-10含量明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；手術(shù)后TGF-β1含量無明顯變化(P>0.05)，化療后明顯降低(P<0.01)。見表2。

表2　EC患者外周血CD4+CD25+CD127LOW/CD4、CD4+CD25+Foxp3+/CD4及血清TGF-β1、TGF-β2、IL-10含量

(1)與手術(shù)前比較，P<0.01；(2)與手術(shù)后比較，P<0.01

2.3EC患者外周血CD4+CD25+CD127LOWTreg/CD4、CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4與血清TGF-β1、TGF-β2、IL-10含量的相關(guān)分析

spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，EC患者外周血CD4+CD25+CD127LOW/CD4與血清TGF-β1含量存在正相關(guān)(r=0.284,P=0.049)，與TGF-β2、IL-10無相關(guān)性(r=0.109、0.092,P=0.300、0.266)；CD4+CD25+Foxp3+/CD4與血清IL-10含量存在正相關(guān)(r=0.287,P=0.047)，與TGF-β1、TGF-β2無相關(guān)性(r=-0.221、-0.097，P=0.101、0.290)。

3　討論

EC占女性生殖道惡性腫瘤的20%～30%，其發(fā)病率近年呈上升趨勢，且Ⅳ期患者5年生存率僅為5 %～23 %[5]。目前，以腫瘤免疫治療為代表的腫瘤生物治療已成為繼手術(shù)、化療及放療治療腫瘤不可缺的新模式，大量研究提示惡性腫瘤患者的免疫系統(tǒng)在腫瘤局部和全身處于耐受或缺陷狀態(tài)，腫瘤在逃逸機體的免疫機制之后才能進一步惡化[6]。Treg是具有顯著免疫抑制作用的CD4+T細胞亞群，對免疫系統(tǒng)功能具有抑制效應(yīng)，與腫瘤細胞的免疫逃逸與免疫耐受密切相關(guān)[7]。Foxp3是叉頭翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子的總稱，在Treg細胞上特異性表達，可以促進腫瘤的生長、抑制機體抗腫瘤免疫應(yīng)答，在Treg的發(fā)育和功能上起著重要的作用[8]。Foxp3是CD4+CD25+Treg細胞生長發(fā)育和調(diào)節(jié)功能的重要因子，是研究人類CD4+CD25+Treg細胞最具特異性的細胞分子標志物[9]。CD127是Treg 特異性較高的細胞表面標志物，用CD127篩選的Treg在體外實驗顯示出特有的抑制活性，能區(qū)分效應(yīng)性T細胞[10]。CD127為IL-7的受體α鏈，在Treg細胞表面特異性低表達，與Foxp3表達有很好的相關(guān)性，本實驗采用CD4+CD25+CD127LOW與CD4+CD25+Foxp3+兩組抗體共同篩選Treg細胞，結(jié)果顯示，EC患者外周血CD4+CD25+CD127LOWTreg/CD4、CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4均高于對照組(P<0.01)，說明經(jīng)過相應(yīng)治療后，CD4+CD25+Treg數(shù)目明顯下降，CD4+CD25+Treg在腫瘤的免疫逃逸中起到了重要的作用。

Treg細胞在腫瘤免疫逃逸中的發(fā)揮著重要的作用，分泌抑制性細胞因子如IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)等可誘導(dǎo)腫瘤的T細胞耐受，IL-10具有免疫抑制功能，TGF-β能夠直接抑制CD8+CTLS激活，顯著減弱腫瘤免疫的效果[11-12]。本文中，EC組與對照組血清TGF-β1、TGF-β2、IL-10含量相比較，EC組IL-10含量明顯高于對照組，TGF-β2含量明顯低于對照組(P<0.01)，TGF-β1含量雖有升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；研究還發(fā)現(xiàn)EC組手術(shù)后和(或)化療后的TGF-β1、TGF-β2和IL-10含量均較手術(shù)前明顯下降(P<0.01)，說明EC組織誘導(dǎo)產(chǎn)生的TGF-β和IL-10可能也發(fā)揮一部分作用；Mao等[12]研究發(fā)現(xiàn)在惡性腫瘤患者中CD4+CD25+Foxp3foxp3+Treg含量明顯增加，有研究也證實，卵巢癌患者Treg細胞數(shù)量的增加與卵巢癌的進展程度呈正相關(guān)[14-15]。本文相關(guān)性分析結(jié)果顯示，CD4+CD25+CD127LOWTreg/CD4與 TGF-β1、CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4與 IL-10含量之間存在著正相關(guān)(P<0.05)，提示血清中TGF-β1、IL-10水平變化可間接反映EC的腫瘤免疫進展情況。

綜上，EC患者體內(nèi)CD4+CD25+Treg細胞明顯上調(diào)，可能參與了腫瘤的免疫逃逸，其機制可能與 IL- 10、TGF-β表達上調(diào)有關(guān)。進一步研究如何調(diào)控EC患者體內(nèi)Treg的表達水平和血清中TGF-β1、TGF-β2及IL- 10的含量達到精準治療有望為抗腫瘤免疫治療提供新的思路。

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(2016-05-25收稿，2016-08-15修回)

中文編輯： 吳昌學(xué)； 英文編輯： 趙毅

Correlation of Regulatory T Cells with Tumor Immunology in Peripheral Blood of patients with Endometrial Cancer

YU Danjun1, FAN Jing2, LIU Guangxian3, HU Yue1, ZHAO Yue2, XUE Danfeng2, SUN Fengying2

(1.ClinicalLaboratory,FirstHospitalofQinhuangdaoCity,Qinhuangdao066000,Hebei,China; 2.ClinicalLaboratory,FourthHospitalofQinhuangdaocity,Qinhuangdao066000 ,Hebei,China; 3.InstitudeofTumor, 307LiberationArmyHospital,Beijing100071,China)

Objective: To investigate the relationship between two types of regulatory T cells (CD4+CD25+CD127LOWTreg and CD4+CD25+Foxp3+Treg) expression in peripheral blood of patients with endometrial cancer (EC) and tumor immunity. Methods: 35 patients with EC were selected and 30 healthy female as healthy controls, flow cytometry was used to detect the proportion of CD4+CD25+CD127LOWTreg and CD4+CD25+foxp3+Treg accounted for CD4+T lymphocyte expression in peripheral blood in EC group and healthy controls before and after surgery and chemotherapy; ELASA was used to detect content of IL-10 cytokines, TGF-β1and TGF-β2in serum with the same specimens. Results: The proportion of CD4+CD25+CD127LOWTreg and CD4+CD25+foxp3+Treg accounted for CD4+T lymphocyte in peripheral blood in patients and content of IL-10 in serum with EC group were significantly higher than that in healthy controls (P<0.01); the content of TGF-β1 in serum was no statistically significant different in two groups (P>0.05); The proportion of CD4+CD25+CD127LOWTreg and CD4+CD25+foxp3+Treg accounted for CD4+T lymphocyte in peripheral blood in patients and content of IL-10 and TGF-β2in serum with endometrial cancer group were significantly decreased after surgery and chemotherapy (P<0.01); there was no statistically significant difference in the content of TGF-β1in serum after surgery (P>0.05); the content of TGF-β1in serum were significantly decreased after chemotherapy (P<0.01). There was positive correlation between CD4+CD25+CD127LOWTreg and content of TGF-β1(r=0.284,P=0.049) with EC group; there was positive correlation between CD4+CD25+foxp3+Treg accounted for CD4+T lymphocyte and the content of IL-10 (r=0.287,P=0.047). Conclusion: The levels of regulatory T cells increased obviously in peripheral blood in patients with EC, this may be the reason for tumor immunological tolerance and tumor immune escape.

endometrial neoplasms; regulatory T cells; cytokines; immunological tolerance; flow cytometry

秦皇島市科技局科技支撐計劃項目資助(20141A219)

E-mail:qhdjykfj@126.com

R737.33

A

1000-2707(2016)09-1099-05

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.09.027

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網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-09-13網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160913.2240.006.html