microRNA-29c過表達(dá)對人胰腺癌AsPC-1、PANC-1細(xì)胞增殖的影響*

周顯飛， 田　舍， 王　杰， 賈亮亮， 喻　超， 江建新

(貴州醫(yī)科大學(xué)附院 肝膽外科， 貴州 貴陽　550004)

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microRNA-29c過表達(dá)對人胰腺癌AsPC-1、PANC-1細(xì)胞增殖的影響*

周顯飛， 田舍， 王杰， 賈亮亮， 喻超， 江建新**

(貴州醫(yī)科大學(xué)附院 肝膽外科， 貴州 貴陽550004)

目的： 探討microRNA-29c過表達(dá)對人胰腺癌AsPC-1、PANC-1細(xì)胞增殖的影響。方法： 構(gòu)建含microRNA-29c過表達(dá)腺病毒并感染至胰腺癌AsPC-1及PANC-1細(xì)胞(實(shí)驗(yàn)組)，感染空載體作為陰性對照組，采用實(shí)時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測AsPC-1和PANC-1感染microRNA-29c 24 h時的感染效率， CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測microRNA-29c感染48 h時人胰腺癌細(xì)胞的增殖能力，細(xì)胞平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測感染microRNA-29c 24 h人胰腺癌細(xì)胞的單克隆形成能力。結(jié)果: 與陰性對照組比較， microRNA-29c感染AsPC-1及PANC-1細(xì)胞后microRNA-29c表達(dá)水平明顯升高；過表達(dá)microRNA-29c后AsPC-1和PANC-1細(xì)胞增殖能力明顯受到抑制，細(xì)胞的克隆形成數(shù)明顯減少(P<0.01)。結(jié)論： microRNA-29c 過表達(dá)能有效抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖能力，有望成為治療胰腺癌的新靶標(biāo)。

微小RNA； microRNA-29c； 胰腺癌； 細(xì)胞增殖； 腺病毒

胰腺癌是惡性程度最高、預(yù)后最差的實(shí)體瘤之一，具有極為惡性的生物學(xué)特征，其發(fā)生發(fā)展過程受到多種編碼基因與非編碼基因的調(diào)控[1]。盡管目前胰腺癌的診斷和治療技術(shù)有了很大的進(jìn)展，但其5年生存率仍然很低[1]。microRNA是一類非編碼小分子RNA，成熟的microRNA是由發(fā)夾狀雙鏈RNA經(jīng)RNase III Dicer剪切而來，至少30%的人類基因受到microRNA的調(diào)控[2-3]。microRNA可與靶mRNA 互補(bǔ)結(jié)合，從而抑制靶mRNA翻譯和促進(jìn)mRNA降解[4-5]； microRNA還參與細(xì)胞的增殖與死亡、分化、發(fā)育、細(xì)胞增殖及凋亡等一系列生物學(xué)過程，甚至與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[6-8]。microRNA-29家族包括microRNA-29a/b/c, microRNA-29c位于第1號染色體，是該家族主要成員。有研究發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌組織和細(xì)胞中microRNA-29c表達(dá)降低，并參與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展過程[9]，但關(guān)于 microRNA-29c在胰腺癌中的具體生物學(xué)功能及作用機(jī)制未見報(bào)道。因此，進(jìn)一步了解及完善胰腺癌的發(fā)病機(jī)制對于胰腺癌的早期發(fā)現(xiàn)、診斷及治療尤為重要。本研究通過microRNA-29c過表達(dá)腺病毒分別感染胰腺癌AsPC-1及PANC-1細(xì)胞，觀察microRNA-29c對人胰腺癌細(xì)胞增殖的影響。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞株及主要試劑

人胰腺癌細(xì)胞AsPC-1及PANC-1獲贈于華中科技大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院膽胰外科實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)口胎牛血清、RPMI、DMEM 及RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基、0.05%含EDTA 的胰蛋白酶均購自gibico公司，CCK-8 檢測試劑盒購自碧云天公司，RNA抽提試劑Trizol購自Invitrogen公司，microRNA-29c 腺病毒過表達(dá)載體的構(gòu)建、腺病毒包裝與滴度檢測由山東維真生物科技有限公司完成，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix ExTaq 試劑盒均購自TaKaRa 公司，pre-microRNA-29c的逆轉(zhuǎn)錄及real-time PCR 引物套裝購自廣州銳博公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)AsPC-1用含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基， PANC-1用含10% 胎牛血清的RPMI DMEM培養(yǎng)基，兩組細(xì)胞均置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2microRNA-29c腺病毒感染胰腺癌細(xì)胞及感染效率檢測將AsPC-1及PANC-1細(xì)胞分別分為microRNA-29c感染組(實(shí)驗(yàn)組)和空載體組(陰性對照組)。根據(jù)腺病毒操作手冊查得胰腺癌細(xì)胞AsPC-1及PANC-1的MOI值，取2×105個對數(shù)生長期AsPC-1及PANC-1細(xì)胞分別接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后根據(jù)慢病毒感染復(fù)數(shù)(MOI)值在實(shí)驗(yàn)組AsPC-1及PANC-1細(xì)胞中加入適量的microRNA-29c腺病毒液，陰性對照組加入同等量的空載體，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h時換液，再培養(yǎng)12 h時用TRIzol試劑盒根據(jù)操作說明分別提取實(shí)驗(yàn)組和陰性對照組中AsPC-1及PANC-1中的總RNA，測定總RNA濃度；采用實(shí)時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測AsPC-1及PANC-1中microRNA-29c的表達(dá)，microRNA-29c、內(nèi)參U6逆轉(zhuǎn)錄引物和RT-qPCR相關(guān)上下游引物由廣州銳博生物有限公司設(shè)計(jì)合成后提供，各組相對表達(dá)量采用2-△△Ct法計(jì)算。

1.2.3檢測細(xì)胞增殖采用CCK-8法，感染腺病毒48 h時收集AsPC-1及PANC-1細(xì)胞，以3× 103個/孔細(xì)胞接種于96 孔板中，每組分別設(shè)24、48及72 h 組，每個時間點(diǎn)設(shè)置3 個復(fù)孔；檢測前每孔分別加入CCK-8 試劑10 μL ，避光37 ℃孵育2 h，輕輕振蕩后，酶標(biāo)儀 450 nm 波長處測定光密度(OD)值，觀察microRNA-29c對胰腺癌細(xì)胞增殖的影響。

1.2.4人胰腺癌細(xì)胞單克隆形成能力采用細(xì)胞平板克隆實(shí)驗(yàn)，感染腺病毒24 h后收集AsPC-1及PANC-1細(xì)胞，以1×103個/孔細(xì)胞接種于6孔板中，每組設(shè)置3個復(fù)孔，連續(xù)5 d觀察細(xì)胞狀態(tài)；細(xì)胞經(jīng)4%多聚甲醛固定30 min，1%結(jié)晶紫染色30 min；PBS洗3遍后干燥處理。數(shù)字拍攝成像，于顯微鏡下計(jì)數(shù)>10個細(xì)胞的克隆數(shù)，計(jì)算克隆形成率(%)=(克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2　結(jié)果

2.1microRNA-29c表達(dá)

microRNA-29c腺病毒感染AsPC-1及PANC-1后，AsPC-1及PANC-1實(shí)驗(yàn)組中microRNA-29c表達(dá)都明顯增加，相對表達(dá)量分別為(1.004±0.234)、(1.122±0.220)；陰性對照組為(0.414±0.084)、(0.436±0.065)，兩種細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)組及陰性對照組microRNA-29c相對表達(dá)量比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

(1)與同細(xì)胞陰性對照組比較，P<0.05圖1　感染microRNA-29c腺病毒后AsPC-1與PANC-1細(xì)胞內(nèi)microRNA-29c的表達(dá)Fig.1　MiR-29c adenovirus increased expression of miR-29c in AsPC-1 and PANC-1 cells

2.2胰腺癌細(xì)胞的增殖能力

胰腺癌細(xì)胞AsPC-1及PANC-1感染microRNA-29c 48 h時， CCK8法結(jié)果顯示，與陰性對照組比較，實(shí)驗(yàn)組AsPC-1及PANC-1細(xì)胞的增殖能力均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。表明上調(diào)microRNA-29c在胰腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)可顯著抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖能力。

2.3microRNA-29c過表達(dá)對胰腺癌細(xì)胞克隆形成能力的影響

細(xì)胞平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖3)，實(shí)驗(yàn)組AsPC-1及PANC-1克隆形成率分別為(1.38±0.023)、(0.8±0.059)；陰性對照組為(2.96±0.065)、(2.4±0.046)，兩組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；提示microRNA-29c過表達(dá)的兩種胰腺癌細(xì)胞的克隆形成能力明顯受到抑制。

注：A為AsPC-1細(xì)胞，B為PANC-1細(xì)胞；(1)與同細(xì)胞陰性對照組比較，P<0.05圖2　感染microRNA-29c腺病毒后AsPC-1與PANC-1細(xì)胞的增殖能力Fig.2　Over-expression of microRNA-29c inhibited PANC-1 and AsPC-1 cells proliferation ability

注：A為PANC-1細(xì)胞，B為AsPC-1細(xì)胞；(1)與同細(xì)胞陰性對照組比較，P<0.05圖3　胰腺癌細(xì)胞PANC-1與AsPC-1的克隆形成能力Fig.3　Over-expression of microRNA-29c inhibited AsPC-1 and PANC-1 cells colony formation ability

3　討論

microRNA是一類長度約為21個堿基的非編碼小分子RNA，成熟的microRNA是由60～80個堿基的發(fā)夾狀雙鏈RNA經(jīng)RNase Ⅲ Dicer酶剪切而來，至少30%的人類基因受到microRNA的調(diào)控[2-3]。大量研究表明microRNA在生物體內(nèi)起到致癌或者抑癌作用，是通過調(diào)控致癌和抑癌基因的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的；在胰腺癌中，胰腺癌細(xì)胞的增殖和生存就受到其調(diào)控，研究發(fā)現(xiàn)，microRNA-34a在胰腺癌組織中的表達(dá)明顯低于正常胰腺組織，microRNA-34a通過影響胰腺癌細(xì)胞的細(xì)胞周期、DNA修復(fù)及凋亡從而起到抑制腫瘤細(xì)胞的增殖作用[10]；同樣也有研究表明microRNA-34b在胰腺癌組織中較癌旁組織明顯下調(diào)，過表達(dá)microRNA-34b可抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖能力[11]。而在對microRNA-27a和microRNA-96的研究時發(fā)現(xiàn)，它們在胰腺癌組織和細(xì)胞中表達(dá)明顯升高，抑制其表達(dá)可明顯抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖，遷移和凋亡，是致癌的microRNA[12-13]。本研究通過microRNA-29c過表達(dá)腺病毒分別感染胰腺癌AsPC-1及PANC-1細(xì)胞，觀察microRNA-29c對人胰腺癌細(xì)胞增殖的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，感染microRNA-29c腺病毒的胰腺癌AsPC-1及PANC-1細(xì)胞中microRNA-29c的表達(dá)明顯增強(qiáng)；進(jìn)一步的CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示microRNA-29c過表達(dá)后的人胰腺癌細(xì)胞株AsPC-1及PANC-1增殖速率明顯較陰性對照組下降；細(xì)胞平板克隆實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了過表達(dá)microRNA-29c后胰腺癌AsPC-1及PANC-1細(xì)胞的單克隆增殖能力明顯減弱，說明上調(diào)microRNA-29c在胰腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)可顯著抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖能力，細(xì)胞克隆的形成能力也明顯受到抑制。

綜上，microRNA-29c作為新發(fā)現(xiàn)的抑癌microRNA分子，也可有效抑制胰腺癌AsPC-1及PANC-1細(xì)胞的生長，可能成為胰腺癌的治療新靶標(biāo)。為后續(xù)探討microRNA-29c參與胰腺癌生物學(xué)行為的分子機(jī)制提供指導(dǎo)，也為胰腺癌的分子靶向治療提供新的策略。

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(2016-05-28收稿，2016-08-25修回)

中文編輯： 吳昌學(xué)； 英文編輯： 趙毅

Effect of microRNA-29c Over-expression on Proliferation of Human Pancreatic Cancer Cells

ZHOU Xianfei, TIAN She, WANG Jie, JIA Liangliang, YU Chao, JIANG Jianxin

(DepartmentofHepatobiliarySurgery,AffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

Objective: To investigate the effect of miR-29c over-expression on the proliferation of human pancreatic cancer cells, AsPC-1、PANC-1. Methods: The recombination adenovirus Ad-miR-29c and control adenovirus was constructed and transfected human pancreatic cancer cells, AsPC-1 and PANC-1 cell (experiment group). The expressions of miR-29c in AsPC-1 and PANC-1 cells were detected by real-time PCR. The CCK-8 assay was applied to examine the proliferation ability of miR-29c on the proliferation of human pancreatic cancer cell. The cell colony formation assay was used to measure the growth of the cells after infected by miR-29c for 24 h. Results: After infected with Ad-miR-29c and PANC-1, the miR-29c expression levels increased；the over-expression of microRNA-29c in the pancreatic cancer cells significantly inhibited the proliferation abilities of AsPC-1 and PANC-1 cells, cell clone formation abilities were also significantly decreased (P<0.01). Conclusion: miR-29c can effectively suppress the proliferation of human pancreatic cancer cells，which makes a promising new therapeutic target for pancreatic cancer．

micro RNA; miR-29c; pancreatic cancer; cell proliferation；adenovirus

國家國際科技合作專項(xiàng)資助(2014DFA31420); 國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81160311)

E-mail:jjx731003@163.com

R735.9

A

1000-2707(2016)09-1002-04

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.09.003

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網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-09-13網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160913.2240.016.html