microRNA-29c對人胰腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的抑制作用及機(jī)制*

周顯飛， 田　舍， 王　杰， 賈亮亮， 喻　超， 江建新

(貴州醫(yī)科大學(xué)附院 肝膽外科， 貴州 貴陽　550004)

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·專題研究1·

microRNA-29c對人胰腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的抑制作用及機(jī)制*

周顯飛， 田舍， 王杰， 賈亮亮， 喻超， 江建新**

(貴州醫(yī)科大學(xué)附院 肝膽外科， 貴州 貴陽550004)

目的： 探討microRNA-29c對人胰腺癌細(xì)胞(AsPC-1、BxPC-3、PANC-1、MIA PaCa-2)生物學(xué)特性的影響。方法： 培養(yǎng)1種人正常胰腺上皮細(xì)胞(HPDE)及4種人胰腺癌細(xì)胞(AsPC-1、BxPC-3、PANC-1、MIA PaCa-2)，采用real-time PCR 法觀察5種細(xì)胞系中microRNA-29c 的表達(dá)差異，以microRNA-29c過表達(dá)腺病毒感染的PANC-1 和MIA PaCa2細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組，以空載體感染的PANC-1 和MIA PaCa2細(xì)胞作為陰性對照組，采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell法檢測兩組細(xì)胞體外侵襲能力，Western blot檢測兩組細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)蛋白波形蛋白(Vimentin)及E-鈣粘蛋白(E-cadherin)的表達(dá)。結(jié)果： real-time -PCR 顯示各胰腺癌細(xì)胞系中microRNA-29c 水平明顯低于正常胰腺細(xì)胞系(P<0.05)，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)感染腺病毒48 h后實(shí)驗(yàn)組PANC-1、MIA PaCa-2細(xì)胞的遷移距離明顯短于陰性對照組(P<0.05)，Transwell 小室細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組PANC-1 和MIA PaCa-2 細(xì)胞侵襲數(shù)量明顯低于陰性對照組(P<0.05)；Western blot蛋白免疫印跡結(jié)果顯示PANC-1 和MIA PaCa-2細(xì)胞過表達(dá)microRNA-29c后， Vimentin表達(dá)減少，E-cadherin表達(dá)增加。結(jié)論： microRNA-29c的過表達(dá)可有效抑制胰腺癌細(xì)胞的體外侵襲與轉(zhuǎn)移，可能與Vimentin表達(dá)減少，E-cadherin表達(dá)增加有關(guān)，有望成為胰腺癌生物治療的潛在靶點(diǎn)。

微小RNA； microRNA-29c； 胰腺癌； 腺病毒； 細(xì)胞侵襲； 轉(zhuǎn)移； 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

胰腺癌是惡性程度最高、預(yù)后最差的實(shí)體瘤之一，具有極為惡性的生物學(xué)特征，絕大部分患者(>85%)在確診時(shí)已伴有局部和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致患者的5年生存率極低(<5%)[1]。因此，更多地了解胰腺癌的發(fā)病機(jī)制對于胰腺癌的早期發(fā)現(xiàn)、診斷及治療至關(guān)重要。microRNA是一類真核生物內(nèi)源性小分子單鏈RNA, 長度通常為21～ 22個(gè)核苷酸, 能夠通過與靶mRNA特異性的堿基配對結(jié)合，從而對基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后表達(dá)的調(diào)控[2]。microRNA廣泛參與機(jī)體發(fā)育、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡等一系列生物學(xué)過程，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[3-5]，某些microRNA 通過抑制靶基因的表達(dá)，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[6-10]。microRNA-29c是microRNA-29家族中的一員[11]，其在眾多實(shí)體腫瘤如鼻咽癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胃癌、肝細(xì)胞癌、膀胱癌及結(jié)腸癌中均呈低表達(dá)，作為抑癌基因存在，最近的研究發(fā)現(xiàn)，microRNA-29c在裸鼠模型中抑制胰腺癌肝轉(zhuǎn)移并影響生存率[12]。本研究通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分析microRNA-29c對胰腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響，從而揭示microRNA-29c在胰腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中的作用。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞株及主要試劑

人正常胰腺上皮細(xì)胞HPDE，人胰腺癌細(xì)胞AsPC-1、BxPC-3、PANC-1及MIA PaCa-2獲贈于華中科技大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院膽胰外科實(shí)驗(yàn)室。胎牛血清購自gibico，RNA 抽提試劑TRIzol 購自Invitrogen 公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix ExTaq 試劑盒均購自TaKaRa 公司。microRNA-29c 腺病毒過表達(dá)載體的構(gòu)建、腺病毒包裝與滴度檢測由山東維真生物科技有限公司完成。microRNA-29c的逆轉(zhuǎn)錄引物及real-time PCR 引物套裝購自廣州銳博公司，E-cadherin、Vimentin、GAPDH一抗購自武漢三鷹有限公司，鼠抗和兔抗二抗購自博士德公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)胰腺正常上皮細(xì)胞HPDE，人胰腺癌細(xì)胞AsPC-1及BxPC-3用含10% 胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)；人胰腺癌細(xì)胞PANC-1及MIA PaCa-2用含10%胎牛血清的RPMI DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2microRNA-29c在胰腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)用TRIzol試劑盒根據(jù)操作說明提取各細(xì)胞系細(xì)胞的總RNA，測定總RNA濃度，采用實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)各組胰腺癌細(xì)胞的表達(dá)，相對表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算。

1.2.3microRNA-29c腺病毒感染胰腺癌細(xì)胞將PANC-1 和MIA PaCa2細(xì)胞分別分為microRNA-29c感染組(實(shí)驗(yàn)組)和空載體組(陰性對照組)，根據(jù)腺病毒操作手冊查得胰腺癌細(xì)胞PANC-1 和MIA PaCa2的慢病毒感染復(fù)數(shù)(MOI)值，取對數(shù)生長期細(xì)胞2 ×105個(gè)接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后根據(jù)MOI值在實(shí)驗(yàn)組的PANC-1 和MIA PaCa2細(xì)胞加入適量的腺病毒液，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后換液處理，根據(jù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行相應(yīng)處理。陰性對照組組則加入等量的空載體

1.2.4劃痕實(shí)驗(yàn)感染腺病毒72 h后收集兩組細(xì)胞，按第2天可長滿12孔細(xì)胞培養(yǎng)板數(shù)量種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞長滿培養(yǎng)板后準(zhǔn)備劃痕，更換無血清培養(yǎng)基分別培養(yǎng)，于0、24及48 h分別采用顯微鏡觀察細(xì)胞的遷移情況，取4個(gè)視野尺寸進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

1.2.5Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)感染腺病毒72 h后收集兩組細(xì)胞,用無血清的培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，按1 ×108個(gè)/L 的細(xì)胞密度加200 μL 細(xì)胞懸液至已經(jīng)鋪好matrigel膠Transwell 上室中，下室加入含10%血清的DMEM 培養(yǎng)液800 μL，7 ℃孵育24 h 后，酒精棉球拭去上室未侵襲的細(xì)胞，經(jīng)4%多聚甲醛固定30 min后,1%結(jié)晶紫染色30 min。采用顯微鏡觀察細(xì)胞的侵襲情況，隨機(jī)選取3個(gè)高倍(×100) 視野拍照計(jì)數(shù)。

1.2.6波形蛋白(Vimentin)及E-鈣粘蛋白(E-cadherin)表達(dá)Western blot法檢測，感染腺病毒72 h后收集PANC-1細(xì)胞，使用BCA法測蛋白濃度后按50 μg上樣量計(jì)算得出上樣體積，SDS-凝膠電泳，孵育GAPDH(1∶10 000)、Vimentin(1∶1 000)、E-cadherin(1∶1 000)一抗4 ℃搖床過夜，室溫孵育二抗2 h后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑曝光。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2　結(jié)果

2.1microRNA-29c在人胰腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)

microRNA-29c在PANC-1、BxPC-3、MIA PaCa-2及AsPC-1細(xì)胞的表達(dá)明顯低于HDPE細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

2.2microRNA-29c抑制胰腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移

Transwell 小室細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組PANC-1 和MIA PaCa2 細(xì)胞侵襲能力明顯受到抑制，細(xì)胞侵襲數(shù)量明顯少于陰性對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，感染腺病毒48 h后實(shí)驗(yàn)組PANC-1、MIA 、PaCa-2細(xì)胞的遷移距離明顯短于陰性對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

與HPDE比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01圖1　microRNA-29c在HPDE、PANC-1、BxPC-3、MIAPaCa-2及AsPC-1細(xì)胞系中的表達(dá)Fig.1　Relative expression of microRNA-29c in HPDE, PANC-1, BxPC-3, MIA PaCa-2, AsPC-1 cells

(1)與陰性對照組比較，P<0.05圖2　microRNA-29c 對PANC-1及MIA PaCa-2細(xì)胞侵襲能力的影響Fig.2　microRNA-29c inhibited PANC-1 and MIA PaCa-2 cell invasion ability

圖3　microRNA-29c 對PANC-1及MIA PaCa-2細(xì)胞遷移能力的影響Fig.3　microRNA-29c inhibited PANC-1 and MIA PaCa-2 cells migration ability

2.3Vimentin及E-cadherin蛋白表達(dá)

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)microRNA-29c后，PANC-1細(xì)胞波形蛋白Vimentin表達(dá)減少，E-cadherin表達(dá)增加，提示microRNA-29c過表達(dá)抑制胰腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，見圖4。

圖4　microRNA-29c對PANC-1細(xì)胞中Vimentin及E-cadherin表達(dá)的影響Fig.4　microRNA-29c effect on Vimentin and E-cadherin expression in PANC-1 cell

3　討論

腫瘤治療失敗的主要原因在于腫瘤轉(zhuǎn)移，腫瘤細(xì)胞通過從原位突破基底膜進(jìn)入血液或者淋巴循環(huán)，最后種植到遠(yuǎn)處器官。胰腺癌在癌癥早期就極易發(fā)生遠(yuǎn)處的侵襲和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移并且對傳統(tǒng)的化療藥物耐藥，是預(yù)后最差的惡性腫瘤之一。胰腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制目前并不完全清楚，研究認(rèn)為microRNA在胰腺癌中的表達(dá)異常對胰腺腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移具有重要影響。Moriyama 等[13]研究發(fā)現(xiàn)microRNA-21與MMP2/9或VEGF等侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因在胰腺癌中的表達(dá)成正比，抑制microRNA-21的表達(dá)能起到抑制胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用，提示microRNA-21的表達(dá)失衡對胰腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移有重要的影響。microRNA-224和microRNA-486均能靶向調(diào)控CD40,抑制其在高侵襲轉(zhuǎn)移的胰腺導(dǎo)管腺癌中表達(dá)，從而抑制胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移[14]。研究發(fā)現(xiàn)胰腺癌細(xì)胞中的相關(guān)microRNA的異常表達(dá)與其侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)。microRNA-29c在絕大多數(shù)腫瘤中低表達(dá)，前期研究發(fā)現(xiàn)，microRNA-29c在胰腺癌中低表達(dá)，而低表達(dá)的microRNA-29c可能與胰腺癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)。

本研究通過腺病毒載體感染胰腺癌細(xì)胞獲得高表達(dá)microRNA-29c的細(xì)胞株后，通過transwell實(shí)驗(yàn)?zāi)M腫瘤細(xì)胞外環(huán)境，檢測其侵襲轉(zhuǎn)移能力，發(fā)現(xiàn)上調(diào)microRNA-29c表達(dá)水平后胰腺癌PANC-1及MIA PaCa-2細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力明顯減弱，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)也同時(shí)證實(shí)上調(diào)microRNA-29c表達(dá)后胰腺癌PANC-1及MIA PaCa-2細(xì)胞遷移能力明顯受到抑制。同時(shí)western blot對EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示microRNA-29c上調(diào)胰腺癌細(xì)胞后，E-cadherin表達(dá)增多，Vimentin表達(dá)減少，證實(shí)了microRNA-29c能夠抑制胰腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移過程以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，推測這可能與microRNA-29c參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞EMT相關(guān)信號通路有關(guān)。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)microRNA-29c的過表達(dá)可有效抑制胰腺癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移, microRNA-29c在胰腺癌中的調(diào)控可能為胰腺癌的基因診斷和生物靶向治療提供新的思路，但microRNA-29c在胰腺癌中的具體作用機(jī)制需要進(jìn)一步深入研究。

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(2016-05-23收稿，2016-08-24修回)

中文編輯： 周凌； 英文編輯： 趙毅

Study on microRNA-29c Inhibition Effect and Mechanism on Human Pancreatic Cancer Cells Migration

ZHOU Xianfei, TIAN She, WANG Jie, JIA Liangliang, YU Chao, JIANG Jianxin

(DepartmentofHepatobiliarySurgery,theAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity，Guiyang550004，Guizhou，Chnia)

Objective: To investigate the effect of microRNA-29c on the biological characteristics of human pancreatic cancer cells(AsPC-1、BxPC-3、PANC-1、MIA PaCa-2). Methods: Culturing 1 normal HPDE and 4 pancreatic cancer cells(AsPC-1、BxPC-3、PANC-1、MIA PaCa-2). The different expression of microRNA-29c in human pancreatic cancer lines were observed by real time RT-PCR. microRNA-29c infected PANC-1 and MIA PaCa2 cells as experiment group, lip-null infected PANC-1 and MIA PaCa2 cells as negative control group; wound healing experiment, Transwell method to test the vitro invasion of both group cells; Western blot was used to measure the change of epithelial-mesenchymal transition (EMT) associated protein Vimentin and E-cadherin. Results: The result of real time RT-PCR showed that microRNA-29c expression in human pancreatic cancer cell lines were significantly lower than that in the normal pancreatic ductal epithelial cells (HPDE)(P<0.05); wound healing experiment discovered that 48 hr after infection, PANC-1 and MIA PaCa-2 cells in experiment group migrated obviously shorter than that of negative control group(P<0.05). TRanswell experiment discovered PANC-1 and MIA PaCa-2 cells in experiment group invasion number was obviously shorter than that of negative control group(P<0.05). Western blot indicated after overexpression microRNA-29c of PANC-1 and MIA PaCa-2 cells, Vimentin expression reduced and E-cadherin expression increased. Conclusion: The over-expression of microRNA-29c can effectively suppress the invasion metastasis human pancreatic cancer cells, indicating it might be a potential biological therapeutic target for pancreatic cancer.

micro RNA; microRNA-29c; pancreatic cancer; adenovirus； cell invasion; metastasis; wound healing experiment

國家國際科技合作專項(xiàng)資助(2014DFA31420); 國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81160311)

E-mail:jjx731003@163.com

R735.9

A

1000-2707(2016)09-0997-05

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.09.002

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網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-09-13網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160913.2240.024.html