二色補(bǔ)血草內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性研究

楊林，華棟，姜儀，郝瀧，司佳寧，劉曉風(fēng)（蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州，730050）

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二色補(bǔ)血草內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性研究

楊林，華棟，姜儀，郝瀧，司佳寧，劉曉風(fēng)
（蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州，730050）

采用組織塊分離法分離二色補(bǔ)血草內(nèi)生真菌，PDA液體培養(yǎng)基發(fā)酵，發(fā)酵液固液分離，發(fā)酵液（水相）依次以乙酸乙酯、正丁醇萃取，菌絲體（固相）干燥后甲醇提取，分別得到發(fā)酵液乙酸乙酯、正丁醇萃取物以及菌絲體甲醇提取物；濾紙片法進(jìn)行抗菌活性篩選。結(jié)果從二色補(bǔ)血草不同部位共分離得到32株內(nèi)生真菌，其中根中15株，莖中11株，葉中6株；二色補(bǔ)血草內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物對各指示菌均有有不同程度的抑制作用，10株內(nèi)生真菌的不同部位對2種或多種指示菌有不同程度的抑制作用，占分離菌株總數(shù)的31.25%。其中BL404乙酸乙酯、BR408正丁醇部位分別對肺炎克雷伯菌、綠膿桿菌最小抑制濃度達(dá)到0.313mg/mL。研究結(jié)果表明，二色補(bǔ)血草內(nèi)生真菌具有較強(qiáng)的抑菌活性，對指示細(xì)菌的抑制范圍較寬，有一定的研究開發(fā)價(jià)值。

二色補(bǔ)血草；內(nèi)生真菌；抑菌活性

二色補(bǔ)血草（Limonium bicolor）系白花丹科（P1umbaginaceae）補(bǔ)血草屬（Limonium Mill）的多年生草本植物，別名蒼蠅花、繩子草。主產(chǎn)于陜西、甘肅、寧夏、江蘇、河南等地，其性微溫，昧甘，具補(bǔ)血益氣，止血散瘀，活血調(diào)經(jīng)，益脾健胃之功效［1］。本實(shí)驗(yàn)對二色補(bǔ)血草內(nèi)生真菌進(jìn)行了分離并對其代謝產(chǎn)物抑菌活性進(jìn)行了初步研究，旨在篩選出能產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)的內(nèi)生真菌，為發(fā)酵生產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)及二色補(bǔ)血草資源的綜合開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 、材料與方法

1.1 植物材料

二色補(bǔ)血草（Limonium bicolor），于2014年9月采集于甘肅隴西縣，由蘭州理工大學(xué)生命學(xué)院楊林老師副教授鑒定。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 內(nèi)生菌的分離及純化

取新鮮的二色補(bǔ)血草植株，表面清洗干凈，在無菌條件下，進(jìn)行如下表面消毒：75%酒精浸泡5min→無菌水沖洗3次→0.01%升汞浸泡30s→無菌水沖洗3次，晾干。將植物材料剪切成0.5cm×0.5cm大小的片段，接種于加有100U/mL青霉素鈉和硫酸鏈霉素的PDA平板上，置28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 10d，待組織周圍長出菌落后，采用菌絲尖端挑取法，根據(jù)菌落形態(tài)、顏色、長出時(shí)間的不同，及時(shí)挑取材料周圍菌絲轉(zhuǎn)接于新鮮培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，反復(fù)純化后轉(zhuǎn)于PDA斜面上，編號(hào)，4℃保存?zhèn)溆?。同時(shí)將經(jīng)表面消毒后而不做切割的材料在培養(yǎng)基上做組織印跡，作為對照以檢驗(yàn)消毒效果［2-4］。

1.2.2 內(nèi)生菌發(fā)酵液的制備

將純化后的內(nèi)生真菌接種到新鮮的PDA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)7d活化菌株，活化后的菌種接種于500mLPD培養(yǎng)基，28℃，160r/min恒溫震蕩培養(yǎng)7-10d。發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液進(jìn)行抽濾，將菌液和菌絲體分開，菌液先用等體積的乙酸乙酯萃取3次，然后用等體積的正丁醇萃取3次，分別合并有機(jī)相，回收溶劑，得到乙酸乙酯和正丁醇部位；菌絲體干燥，破碎，30-50倍體積的甲醇回流提取，提取液回收溶劑得到菌體甲醇部位，提取物置4℃冰箱，備用。

1.2.4 發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性檢測

濾紙片法測定各樣品抑菌活性，以G+性菌金黃色葡萄球菌、地衣芽孢桿菌和G－性菌大腸桿菌、綠膿桿菌、肺炎克雷伯菌為指示菌，以上五種指示菌經(jīng)37℃培養(yǎng)24h，活化后用無菌水洗滌制成菌懸液，調(diào)節(jié)菌體濃度至106CFU/mL，吸取1mL均勻涂布于事先倒好的牛肉膏蛋白胨平板上；取直徑為6mm的無菌濾紙片，在無菌條件下用鑷子放置于上述帶菌平板上，每皿3片，輕壓使其與培養(yǎng)基表面接觸，然后用微量移液器吸取備好的各測試樣品溶液（以甲醇稀釋至10mg/mL）15μL分別滴加于紙片上，以溶劑甲醇為陰性對照，以100U/mL的硫酸鏈霉素或青霉素鈉為陽性對照，每個(gè)樣品設(shè)三個(gè)平行。加樣后于37℃培養(yǎng)24h，十字交叉法測定各樣品抑菌圈的大小。

最小抑菌濃度（MIC）的測定：選擇對樣品溶解度好且無抑菌作用的甲醇作為溶媒，采用二倍稀釋法將樣品配制為2.5、1.25、0.625、0.313、0.156mg/mL系列濃度溶液，用濾紙片法測定抑菌圈直徑，以實(shí)驗(yàn)組中出現(xiàn)抑菌圈的最低濃度為最小抑菌濃度（MIC）。

2 、結(jié)果與分析

從二色補(bǔ)血草植株中共分離到內(nèi)生真菌32株，其中根部15株（46.87%）、莖部11（34.38%）、葉部6株（18.75%）。從分離部位可以看出，分離的菌株數(shù)量根部最多，其次為莖部和葉部。

2.1 二色補(bǔ)血草內(nèi)生菌發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性測定結(jié)果

抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，二色補(bǔ)血草內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物對各指示菌均有有不同程度的抑制作用，其中對大腸桿菌有抑制作用的樣品占總數(shù)的80.8%，對金黃色葡萄球菌有抑制作用的占71.21%，對肺炎鏈球菌抑制作用的占87.27%，對地衣芽孢桿菌有抑制的占82.42%，對綠膿桿菌有抑制作用的占75.15%。其中有10株菌的不同部位對2種或多種指示菌有不同程度的抑制作用，占分離菌株總數(shù)的31.25%；4株菌分別對4種或多種指示菌具有明顯的抑制作用，占菌株總數(shù)的12.50%。根據(jù)抑菌活性篩選結(jié)果，對每組指示菌有最強(qiáng)的抑菌作用的菌株進(jìn)行最小抑菌濃度的測定，結(jié)果見表1。3株菌的最小抑菌濃度達(dá)到0.156mg/mL，2株菌的最小抑菌濃度達(dá)到0.313mg/mL。從以上結(jié)果可以看出，二色補(bǔ)血草內(nèi)生真菌具有較強(qiáng)的抑菌活性，對指示細(xì)菌的抑制范圍較寬，對抑菌作用具有一定的選擇性。

表1 二色補(bǔ)血草內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性測定結(jié)果

3 、結(jié)論

抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，二色補(bǔ)血草內(nèi)生真菌抗菌活性菌株數(shù)占分離菌株數(shù)的85.26%，高活性菌株數(shù)占分離菌株數(shù)的12.50%，且內(nèi)生菌發(fā)酵產(chǎn)物各提取物溶液濃度為10mg/mL時(shí)，菌株乙酸乙酯萃取部位的抑菌效果明顯高于甲醇部位及正丁醇部位。表明二色補(bǔ)血草內(nèi)生菌發(fā)酵產(chǎn)物中存在著豐富的抗菌活性物質(zhì)資源，這為二色補(bǔ)血草內(nèi)生菌資源及發(fā)酵抑菌活性物質(zhì)資源的開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。

［1］ 許毅宏，張繼，哈飛，等.人工栽培二色補(bǔ)血草前景［J］.植物雜志，2004，1：12

［2］ 王永忠，肖亞中.植物內(nèi)生菌及其代謝產(chǎn)物［J］.生物醫(yī)學(xué)雜志，2004，21（4）：1-5

［3］ 王瑤瑤，韓烈保，曾會(huì)明.禾本科植物內(nèi)生菌研究進(jìn)展［J］.生物技術(shù)通報(bào)，2008，（ 3）：34-37

［4］ 程麗娟，薛泉宏.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)［M］.西安：世界圖書出版公司，2000：104 105.