不同補(bǔ)料方式對(duì)釀酒酵母高密度發(fā)酵的影響

榮博涵，甄玉國，2*，趙小麗，劉乙辰，冀紅芹

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 吉農(nóng)博瑞奶牛飼料研發(fā)中心，吉林 長春 130118；2.長春博瑞飼料集團(tuán)有限公司技術(shù)中心，吉林 長春 130114）

不同補(bǔ)料方式對(duì)釀酒酵母高密度發(fā)酵的影響

榮博涵1，甄玉國1，2*，趙小麗1，劉乙辰1，冀紅芹1

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 吉農(nóng)博瑞奶牛飼料研發(fā)中心，吉林 長春 130118；2.長春博瑞飼料集團(tuán)有限公司技術(shù)中心，吉林 長春 130114）

以釀酒酵母為發(fā)酵菌種，使用自主優(yōu)化篩選配制的糖蜜培養(yǎng)基，分別采用殘?zhí)欠答伔峙a(bǔ)料和連續(xù)流加補(bǔ)料方式，優(yōu)化發(fā)酵工藝條件以提高發(fā)酵液中菌體密度。殘?zhí)欠答伔峙a(bǔ)料，擬設(shè)定3個(gè)梯度，分別控制對(duì)數(shù)期發(fā)酵液中殘?zhí)呛吭?.5%～1.5%，1.0%～2.0%，1.5%～2.5%。三次試驗(yàn)結(jié)果分別為，試驗(yàn)1菌體培養(yǎng)32 h時(shí)達(dá)到最大生物量，為28.88 g/L；試驗(yàn)2菌體培養(yǎng)52 h時(shí)達(dá)到最大生物量，為27.43 g/L；試驗(yàn)3菌體培養(yǎng)24 h時(shí)達(dá)到最大生物量，為22.06 g/L。通過連續(xù)流加補(bǔ)料培養(yǎng)菌體，結(jié)果培養(yǎng)30 h時(shí)達(dá)到最大生物量，為29.29 g/L。

糖蜜；高密度發(fā)酵；殘?zhí)欠答伔峙a(bǔ)料；流加補(bǔ)料

酵母菌是一類單細(xì)胞真核微生物的統(tǒng)稱，并非是一類系統(tǒng)的生物分類總稱。酵母菌包含多類分支且相互之間生物特性差別較大，目前已知酵母包含1 000多種[1]。大多數(shù)酵母菌為兼性好氧型，易于培養(yǎng)，繁殖迅速且方便遺傳或變異操作[2]。釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是人類最早利用于實(shí)際生產(chǎn)的酵母菌屬，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母含有多種蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素以及礦物質(zhì)。迄今為止，釀酒酵母已被廣泛應(yīng)用于生物工程、發(fā)酵工程、制藥、醫(yī)療等多種領(lǐng)域。作為飼料添加劑，大量實(shí)驗(yàn)證明酵母作為飼料添加劑可以從不同方面提高或增強(qiáng)動(dòng)物的生產(chǎn)性能，對(duì)于現(xiàn)階段我國飼料行業(yè)中的抗生素濫用現(xiàn)象，酵母添加劑也許可以作為未來健康飼養(yǎng)的發(fā)展方向。

高密度發(fā)酵技術(shù)作為一種生化工程技術(shù)被廣泛應(yīng)用于發(fā)酵工程當(dāng)中，作為衡量菌種效益的標(biāo)準(zhǔn)不斷的進(jìn)行改進(jìn)與優(yōu)化。一般認(rèn)為培養(yǎng)密度在20～200 g/L即為高密度發(fā)酵。想要實(shí)現(xiàn)酵母高密度發(fā)酵也并非易事。溫度、pH值、溶氧與培養(yǎng)基成分等外在培養(yǎng)條件的不同，菌種自身的發(fā)酵能力差別以及各種因素之間的互作，都會(huì)將篩選工作的難度大大提高[3-4]。

糖蜜是制糖工業(yè)的副產(chǎn)品，其內(nèi)部成分因其制糖時(shí)的原料和加工工業(yè)的不同而有差異，但大致可分為甜菜糖蜜、甘蔗糖蜜和淀粉糖蜜等。糖蜜因其價(jià)格便宜，易于獲得與處理等特點(diǎn)，常作為生產(chǎn)酵母的主要原材料。不同種類的糖蜜所含的營養(yǎng)成分大不相同，加之近年來制糖工藝的不斷精進(jìn)，糖的提取率不斷提高，致使糖蜜中可發(fā)酵糖含量下降，導(dǎo)致酵母生產(chǎn)質(zhì)量難以調(diào)控[5]。本研究針對(duì)釀酒酵母，以實(shí)驗(yàn)室優(yōu)化篩選的糖蜜培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，發(fā)酵基本條件參照實(shí)驗(yàn)室搖瓶試驗(yàn)為準(zhǔn)，采取不同的補(bǔ)料方式，探索該菌種在糖蜜為碳源的條件下的最大生物量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：由長春博瑞飼料產(chǎn)品研發(fā)中心保存與提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基采用酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextros，YPD）培養(yǎng)基：2 g酵母浸粉，2 g蛋白胨，4 g葡萄糖溶于200 mL蒸餾水中。

有氧發(fā)酵培養(yǎng)基采用糖蜜培養(yǎng)基：可溶性糖含量5%，0.5%尿素，0.05%甘氨酸，0.05%硫酸銨。

補(bǔ)料培養(yǎng)基采用糖蜜培養(yǎng)基：可溶性糖含量20%，2%尿素，0.2%甘氨酸，0.2%硫酸銨。

1.2 儀器與設(shè)備

AL104電子天平：瑞士METTLER TOLEDO集團(tuán)；UV-1201分光光度計(jì)：日本島津公司；5810R高速冷凍離心機(jī)：德國艾本德股份公司；BLBIO-10SJ-50SJ 10 L發(fā)酵罐：上海百侖生物科技有限公司；SPX-150型生化培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 搖瓶種子培養(yǎng)

無菌條件下接種一環(huán)保藏菌種至YPD斜面培養(yǎng)基，30℃復(fù)蘇活化種子24 h，活化后再接種一環(huán)至種子培養(yǎng)基，30℃、180 r/min擴(kuò)大培養(yǎng)24 h，而后以5%接種量接種進(jìn)入50 mL有氧培養(yǎng)基，30℃、180 r/min培養(yǎng)24 h。最后以5%的接種量接種進(jìn)入5 L發(fā)酵罐中進(jìn)行高密度培養(yǎng)。

1.3.2 殘?zhí)欠答伔峙a(bǔ)料對(duì)釀酒酵母發(fā)酵的影響

試驗(yàn)1：控制菌體進(jìn)入對(duì)數(shù)期（發(fā)酵開始8 h）發(fā)酵液中殘?zhí)呛吭?.0%～2.0%；試驗(yàn)2：控制菌體進(jìn)入對(duì)數(shù)期（發(fā)酵開始8 h）發(fā)酵液中殘?zhí)呛吭?.5%～1.5%；試驗(yàn)3：控制菌體進(jìn)入對(duì)數(shù)期（發(fā)酵開始8 h）發(fā)酵液中殘?zhí)呛吭?.5%～2.5%。其他發(fā)酵基本參數(shù)全程保持一致（溫度（30±0.5）℃；pH值為5.00±0.15；罐壓0.04 kPa，溶氧30%；接種量5%）。發(fā)酵過程中，每2 h取樣，稀釋100倍后，測定波長560 nm處的吸光度值。

1.3.3 連續(xù)流加補(bǔ)料對(duì)釀酒酵母發(fā)酵的影響

控制菌體進(jìn)入對(duì)數(shù)期（發(fā)酵開始8 h）后發(fā)酵液中殘?zhí)呛吭?.5%～1.5%范圍內(nèi)，流加速率為20 g/（100 mL·h）。其他發(fā)酵基本參數(shù)同上。發(fā)酵過程中，每2 h取樣，稀釋100倍后，測定560 nm波長處的吸光度值。

1.3.4 補(bǔ)糖策略

發(fā)酵開始后8 h進(jìn)行補(bǔ)糖，補(bǔ)糖分為殘?zhí)欠答佈a(bǔ)料以及連續(xù)補(bǔ)料兩種方式，使發(fā)酵液中殘?zhí)呛烤S持在0.5%～2.0%范圍內(nèi)。

1.3.5 指標(biāo)測定方法

殘?zhí)呛繙y定采用蒽酮比色法；光密度測定：于560 nm波長處測定適當(dāng)稀釋的發(fā)酵液光密度值OD560nm；細(xì)胞干質(zhì)量測定：離心所得菌體85℃恒溫烘干至質(zhì)量恒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 初始補(bǔ)料時(shí)間的確定

采用糖蜜培養(yǎng)基，在5 L的發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，定時(shí)取樣測定發(fā)酵液的OD560nm值，以時(shí)間（h）為橫軸，560 nm波長處OD560nm值為縱軸，繪制釀酒酵母的生長曲線，結(jié)果見圖1。從圖1可以看出，0～4 h為酵母生長潛伏期，4～12 h為對(duì)數(shù)生長前期，12～18 h為對(duì)數(shù)生長后期，18～22 h為平臺(tái)期，22 h后為衰亡期，菌體OD560nm開始下降，這與前期搖瓶實(shí)驗(yàn)的菌體生長規(guī)律基本吻合。

圖2為對(duì)比補(bǔ)料對(duì)菌體生長的影響，其中OD1為正常的菌體培養(yǎng)的生長曲線，培養(yǎng)過程中不進(jìn)行任何補(bǔ)料措施；OD2則為補(bǔ)料試驗(yàn)，即從發(fā)酵2 h開始補(bǔ)料，每隔2 h補(bǔ)料一次，可溶性糖質(zhì)量濃度為200 g/L。由圖2對(duì)比兩次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，0～8 h之前，補(bǔ)糖并不能加速菌體生長，而8 h以后，補(bǔ)糖可以提高菌體生長且效果顯著，這也與前期搖瓶實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相吻合，所以擬定于發(fā)酵8 h時(shí)開始補(bǔ)料。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)菌體處于遲緩期以及對(duì)數(shù)生長初期，即使進(jìn)行補(bǔ)料，菌體也不會(huì)大量增殖。這可能是由于菌體處于潛伏期時(shí)生長緩慢且對(duì)碳源的需求與消耗很小，但進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期后，隨著菌體大量繁殖，發(fā)酵液中的可溶性糖量也急劇下降。因此，為了保證菌體在對(duì)數(shù)期大量繁殖時(shí)可以有足夠的營養(yǎng)物質(zhì)供給，所以，應(yīng)在菌體進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期時(shí)（發(fā)酵8 h）進(jìn)行補(bǔ)料。

2.2 優(yōu)化分批補(bǔ)料方案

采用糖蜜培養(yǎng)基，在30℃，pH 5.0±0.3（搖瓶實(shí)驗(yàn)篩選），溶氧控制在30%～50%條件下，采取殘?zhí)欠答佈a(bǔ)料策略，定時(shí)取樣，測定發(fā)酵液的OD值和殘?zhí)呛?。不同控糖濃度?duì)釀酒酵母生長的影響結(jié)果見圖3，圖3中OD3、OD4與OD5分別為試驗(yàn)1、試驗(yàn)2和試驗(yàn)3的菌體生長曲線。

由圖3可知，試驗(yàn)1結(jié)果表明，當(dāng)將菌體對(duì)數(shù)生長期時(shí)發(fā)酵液中的可溶性糖濃度控制在1.0%～2.0%范圍內(nèi)，菌體對(duì)數(shù)期生長緩慢，菌體數(shù)量增幅較小，達(dá)到最大生物量的耗時(shí)較長，菌株于52 h時(shí)達(dá)到最大生物量27.43 g/L。試驗(yàn)2結(jié)果表明，將菌體對(duì)數(shù)生長期時(shí)發(fā)酵液中的可溶性糖濃度控制在0.5%～1.5%范圍內(nèi)，可以有效的在菌體生長對(duì)數(shù)期提高菌體生長速率，縮短發(fā)酵時(shí)間，并且提高最終的菌體濃度，菌株于32 h時(shí)達(dá)到最大生物量28.88 g/L。試驗(yàn)3結(jié)果表明，維持發(fā)酵液中較高濃度（1.5%～2.5%）的可溶性糖可以使菌體提前進(jìn)入對(duì)數(shù)生長階段，并且在一定時(shí)間內(nèi)（4～12 h）表現(xiàn)出很好的生長速率，但是衰退現(xiàn)象也極為明顯，菌株于發(fā)酵20 h時(shí)提前進(jìn)入平臺(tái)期，到達(dá)最大生物量22.06 g/L。

適宜的糖濃度有利用菌體生長時(shí)快速利用。當(dāng)菌體由遲緩期轉(zhuǎn)入對(duì)數(shù)期時(shí)，菌體開始大量繁殖，同時(shí)消耗大量培養(yǎng)基中的碳源（主要為可溶性糖），此時(shí)通過補(bǔ)料的方式維持發(fā)酵液中的營養(yǎng)成分可以延長菌體對(duì)數(shù)期的生長時(shí)間，從而提高單位體積內(nèi)的菌體數(shù)量。但是，如果過量的補(bǔ)料（碳源），導(dǎo)致發(fā)酵液中的含糖量過高，就會(huì)使酵母菌株產(chǎn)生Crabtree效應(yīng)，即葡萄糖阻遏作用，即使是在通氧的條件下，酵母菌仍然會(huì)進(jìn)入發(fā)酵增殖，從而產(chǎn)生大量酒精，進(jìn)而抑制酵母生長[2]。

由圖3可知，與其他兩組相比，試驗(yàn)2將發(fā)酵液中的殘?zhí)强刂圃?.5%～1.5%的區(qū)間內(nèi)可以很好延長菌體對(duì)數(shù)期的生長時(shí)間以及提高最終的菌體產(chǎn)量，縮短達(dá)到菌體最大量的時(shí)間。試驗(yàn)2最終菌體獲得量分別高于其他兩組5.29%與3.92%，達(dá)到最大生物量的時(shí)間也較試驗(yàn)1縮短了16 h。因此，高密度培養(yǎng)階段，發(fā)酵液中殘?zhí)菨舛葢?yīng)保持在0.5%～1.5%范圍內(nèi)。

2.3 對(duì)比兩種補(bǔ)料方式對(duì)酵母生長的影響

以前期高密度培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，在相同的培養(yǎng)條件以及各項(xiàng)參數(shù)下，使用連續(xù)流加補(bǔ)料方式取代殘?zhí)欠答佈a(bǔ)料策略，補(bǔ)料流加速率為20 g/（100 mL·h），定時(shí)取樣，測定OD560nm值，兩種補(bǔ)料方式對(duì)酵母生長的影響結(jié)果見圖4，其中OD4為以殘?zhí)欠答佈a(bǔ)料方式高密度培養(yǎng)酵母的生長曲線，殘?zhí)菨舛瓤刂圃?.5%～1.5%范圍內(nèi)，而OD6為以連續(xù)流加補(bǔ)料方式控制殘?zhí)菨舛仍?.5%～1.5%范圍內(nèi)的酵母生長曲線。

由圖4可知，采用流加補(bǔ)料方式，酵母菌體于34 h達(dá)到最大值，最大生物量為29.29 g/L。相較于于反饋補(bǔ)料方式，流加補(bǔ)料方式可以更好的促進(jìn)酵母增值，避免出現(xiàn)對(duì)數(shù)生長期內(nèi)出現(xiàn)菌體激增后生長遲緩的現(xiàn)象。流加補(bǔ)料方式最后獲得的菌體生物量也略高于分批補(bǔ)料方式，約提高1.41%。

結(jié)果表明，采用流加補(bǔ)料方式，酵母生長良好。增殖速度穩(wěn)定，且在培養(yǎng)相同時(shí)間點(diǎn)上略高于流加方式。從最后的培養(yǎng)結(jié)果來看，不論是在最終的菌體數(shù)量還是在到達(dá)最大生物量的培養(yǎng)時(shí)間，采用流加方式都優(yōu)于分批補(bǔ)料的方式。這可能是由于采取分批補(bǔ)料方式時(shí)，單次投入大量補(bǔ)料培養(yǎng)基，迅速提高發(fā)酵液中的碳源含量，導(dǎo)致菌體因?yàn)榄h(huán)境改變而打亂生長規(guī)律，也因過高的糖濃度是酵母細(xì)胞產(chǎn)生酒精，從而短暫抑制生長。而連續(xù)流加培養(yǎng)則避免了分批補(bǔ)料方式的這一短處，不會(huì)造成因環(huán)境改變產(chǎn)生的菌體應(yīng)激，從而是菌體增殖更為規(guī)律，良好[6]。

3 結(jié)論

使用糖蜜培養(yǎng)基高密度培養(yǎng)釀酒酵母時(shí)，應(yīng)控制對(duì)數(shù)期發(fā)酵液維持較低的可溶性糖含量，試驗(yàn)結(jié)果表明，控制對(duì)數(shù)期發(fā)酵液中殘?zhí)呛吭?.5%～1.5%時(shí)，菌體培養(yǎng)32 h時(shí)達(dá)到最大生物量，為28.88 g/L；在1.0%～2.0%時(shí)，菌體培養(yǎng)52 h時(shí)達(dá)到最大生物量，為27.43 g/L；在1.5%～2.5%時(shí)，菌體培養(yǎng)24 h時(shí)達(dá)到最大生物量，為22.06 g/L。因此，將對(duì)數(shù)期殘?zhí)强刂圃?.5%～1.5%為最宜范圍，在此范圍內(nèi)培養(yǎng)時(shí)間最短，所獲菌體量最大。

通過連續(xù)流加補(bǔ)料代替殘?zhí)欠答佈a(bǔ)料高密度培養(yǎng)菌體，殘?zhí)菨舛染刂?.5%～1.5%范圍內(nèi)時(shí)，結(jié)果培養(yǎng)34 h時(shí)達(dá)到最大生物量，為29.29 g/L。因此，連續(xù)流加方式更適宜用于在相同條件下高密度培養(yǎng)釀酒酵母。

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Effect of fed-batch fermentation modes on high density fermentation ofSaccharomyces cerevisiae

RONG Bohan1,ZHEN Yuguo1,2*,ZHAO Xiaoli1,LIU Yichen1,JIHongqin1

(1.JAU-BoruiDairy Science and Technology R&D Center,Jilin AgriculturalUniversity,Changchun 130118,China; 2.Technology Center of Changchun Borui Feed Group Co.,Ltd.,Changchun 130114,China)

Using Saccharomyces cerevisiae as fermentation starter,the fermentation process for improving S.cerevisiae density in the laboratory screened single molasses medium was optimized by residual glucose feedback fed-batch and continuous flow plus feeding mode.The fed-batch of glucose feedback testwassetthree gradientsto controlthe contentofresidualglucose(soluble glucose)in the fermentation broth of0.5%-1.5%,1.0%-2.0%,2.0%-2.5%,respectively.The results showed that yeast cells in test 1 fermentation broth(0.5%-1.5%)reached the maximum biomass concentration(MBC)with dry cell weight(DCW)of 28.88 g/L at 32 h;yeastcells in test 2(1.0%-2.0%)fermentation broth reached the MBC with DCWof 27.43 g/L in 52 h;and yeastcells in test3(1.5%-2.5%)fermentation broth reached the MBC with DCWof 22.06 g/L in 24 h.The feeding testresults with continuous flow showed thatyeastcells in the fermentation broth reached the MBC(DCW=29.29 g/L)in 30 h.

molasses;high-density fermentation;fed-batch of glucose feedback;fed-batch cultivation

Q93-33

A

0254-5071（2015）02-0072-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.02.017

2014-12-21

吉林省重大科技攻關(guān)項(xiàng)目（2012ZDGG006）

榮博涵（1990-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)閯?dòng)物營養(yǎng)與飼料。

*通訊作者：甄玉國（1970-），男，副教授，博士，研究方向?yàn)閯?dòng)物營養(yǎng)。