孝順竹組培苗增殖培養(yǎng)影響因素探討

李　佳　馬曉月　張學(xué)英　高志民

(1 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院 河北保定 071001 2 國(guó)際竹藤中心 國(guó)家林業(yè)局竹藤科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室 北京 100102)

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孝順竹組培苗增殖培養(yǎng)影響因素探討

李佳1馬曉月1張學(xué)英1高志民2

(1 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院 河北保定 071001 2 國(guó)際竹藤中心 國(guó)家林業(yè)局竹藤科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室 北京 100102)

以孝順竹組培苗為試材，研究了基本培養(yǎng)基、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比以及接種方式等對(duì)孝順竹組培苗增殖培養(yǎng)的影響。結(jié)果表明，適宜孝順竹增殖生長(zhǎng)的培養(yǎng)基配方為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L+活性炭1 g/L；對(duì)孝順竹組培苗進(jìn)行埋節(jié)處理可以提高增殖系數(shù)；同時(shí)孝順竹組培苗去除頂梢后傷口下部竹節(jié)增大，有利于出現(xiàn)不定根，也可以提高增殖系數(shù)。

孝順竹；組培苗；植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑；增殖

孝順竹(BambusamultiplexL.)別名慈孝竹、鳳凰竹、蓬萊竹，屬于禾本科(Poaceae)竹亞科(Bambuseae)箣竹屬植物，為灌木型叢生竹。孝順竹原產(chǎn)中國(guó)，主產(chǎn)于廣東、廣西、福建等省(區(qū))，山東青島等地也有栽培，多生在山谷間、小河旁，是叢生竹中分布最北緣的竹種。

孝順竹姿態(tài)飄逸、四季常綠，為歷朝歷代文人墨客所推崇，是高潔謙虛、至孝至誠(chéng)的象征。孝順竹具有較強(qiáng)的土壤層蓄水能力，具有固碳和凈化空氣的作用，是園林綠化中不可或缺的造景植物，被廣泛用作綠籬和柵欄[1]。孝順竹很少開(kāi)花結(jié)實(shí)，傳統(tǒng)的繁殖方法是母竹分株，竹稈、竹枝扦插或埋鞭、埋桿等，這些方法存在著消耗種竹多、種苗運(yùn)輸不便、勞動(dòng)強(qiáng)度大、繁殖系數(shù)低、種苗質(zhì)量差等諸多問(wèn)題[2-3]。

生物技術(shù)是20世紀(jì)興起的一項(xiàng)新技術(shù)，目前在植物育種上得到了廣泛應(yīng)用，但在竹子研究上的應(yīng)用還不深入[4]。隨著組織培養(yǎng)技術(shù)的日益發(fā)展，利用組培技術(shù)進(jìn)行竹類植物的快速繁殖已經(jīng)成為趨勢(shì)，組織培養(yǎng)方法培育竹苗具有繁增殖系數(shù)高、質(zhì)量均勻、脫毒復(fù)壯、便于運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)[5-6]。但是，竹子組織培養(yǎng)的發(fā)展比較緩慢，而中國(guó)作為竹子生產(chǎn)栽培與利用大國(guó)，從20世紀(jì)80年代以后才開(kāi)始予以重視[7]。目前竹子組織培養(yǎng)存在繁殖系數(shù)低、容易褐化等諸多問(wèn)題，還未能建立高效的再生體系，嚴(yán)重制約了組培快繁及基因工程育種的發(fā)展[8]。雖然已有關(guān)于孝順竹愈傷組織及植株再生的研究報(bào)道[9]，但對(duì)于孝順竹組培苗增殖的研究卻鮮有報(bào)道。本研究擬通過(guò)對(duì)孝順竹組培苗增殖培養(yǎng)過(guò)程中的基本培養(yǎng)基選擇、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比以及不同接種方式進(jìn)行試驗(yàn)研究，以優(yōu)化孝順竹的組培快繁體系，同時(shí)為孝順竹生物技術(shù)育種、轉(zhuǎn)基因種苗的快速繁殖提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

孝順竹莖段外植體采自國(guó)際竹藤中心安徽太平試驗(yàn)中心，經(jīng)誘導(dǎo)分化后形成組培苗，用于增殖培養(yǎng)試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同基本培養(yǎng)基對(duì)增殖培養(yǎng)的影響

分別以1/2 MS培養(yǎng)基(附加蔗糖20 g/L，瓊脂6 g/L)和MS培養(yǎng)基(附加蔗糖30 g/L，瓊脂6 g/L)為基本培養(yǎng)基，另加活性炭1 g/L，6-BA濃度設(shè)為2.0 mg/L，pH值為5.8。接種材料培養(yǎng)在光照培養(yǎng)室內(nèi)，溫度為(25±2)℃，光照強(qiáng)度為1 500～2 000 Lx，光暗周期為12 h/12 h。接種40 d后，觀察孝順竹組培苗生長(zhǎng)情況。

1.2.2 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比對(duì)增殖培養(yǎng)的影響

以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基(附加蔗糖30 g/L，瓊脂6 g/L)，另加活性炭1 g/L，6-BA濃度設(shè)定為2.0 mg/L，NAA濃度設(shè)0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/L 7個(gè)處理，編號(hào)為1—7。NAA濃度設(shè)定為0.4 mg/L，6-BA濃度設(shè)1.0、2.0、3.0、4.0 mg/L 4個(gè)處理，編號(hào)為8—11。培養(yǎng)條件同上。40 d后，統(tǒng)計(jì)組培苗的增殖系數(shù)。增殖系數(shù)=總可分株數(shù)/接種株數(shù)。

1.2.3 上一代培養(yǎng)基對(duì)增殖培養(yǎng)的影響

將上述不同培養(yǎng)基處理的組培苗接入MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L+活性炭1 g/L的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件同上，40 d后調(diào)查組培苗生長(zhǎng)情況。

1.2.4 不同組培苗狀態(tài)及接種方式對(duì)增殖培養(yǎng)的影響

將上一代孝順竹組培苗在MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)40 d后分株，取大小基本一致的有根及無(wú)根的組培苗，分別采用平放(相當(dāng)于傳統(tǒng)育種方式中的埋節(jié)處理)和直插2種方式接種于MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L+活性炭1 g/L培養(yǎng)基中；同時(shí)分株取大小基本一致的組培苗進(jìn)行去除頂梢和保留頂梢處理，均采用直插方式接種于MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L+活性炭1 g/L培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件同上，接種40 d后調(diào)查組培苗增殖系數(shù)及生長(zhǎng)狀況。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同基本培養(yǎng)基對(duì)增殖培養(yǎng)的影響

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，以1/2MS培養(yǎng)基(附加蔗糖20 g/L，瓊脂6 g/L)為基本培養(yǎng)基的組培苗生長(zhǎng)細(xì)弱，顏色偏黃(圖1)，而以MS培養(yǎng)基(附加蔗糖30 g/L，瓊脂6 g/L)為基本培養(yǎng)基的組培苗生長(zhǎng)粗壯，顏色深綠(圖2)。因此，認(rèn)為孝順竹組培苗繼代培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基(附加蔗糖30 g/L，瓊脂6 g/L)比較適宜。

圖1　1/2MS培養(yǎng)基繼代苗

圖2　MS培養(yǎng)基繼代苗

2.2 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比對(duì)增殖培養(yǎng)的影響

NAA的不同濃度影響組培苗增殖系數(shù)，從試驗(yàn)結(jié)果(表1)可以看出，當(dāng)6-BA濃度為2.0 mg/L、NAA濃度在0～0.6 mg/L范圍內(nèi)遞增時(shí)，孝順竹組培苗增殖系數(shù)隨濃度的變化呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)NAA濃度為0.4 mg/L時(shí)，組培苗增殖系數(shù)最高，達(dá)到1.89，隨NAA濃度繼續(xù)上升，組培苗增殖系數(shù)反而降低，7個(gè)處理間的增殖系數(shù)差異顯著(p<0.05)。組培苗的苗高和增殖系數(shù)具有相同的變化趨勢(shì)，當(dāng)NAA濃度為0.4 mg/L時(shí)組培苗苗高最高，平均為7.50 cm，且組培苗長(zhǎng)勢(shì)茁壯，植株整體為深綠色，根系發(fā)達(dá)。NAA濃度為0、0.1、0.2、0.5 mg/L的各處理間組培苗苗高無(wú)顯著性差異。由此認(rèn)為，當(dāng)6-BA濃度為2.0 mg/L時(shí)，適宜孝順竹增殖培養(yǎng)的NAA 濃度為0.4 mg/L。

表1　NAA不同濃度對(duì)增殖培養(yǎng)的影響

注：采用Duncan多重比較法，同列不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著；下同。

6-BA的不同濃度亦影響組培苗的增殖系數(shù)，從試驗(yàn)結(jié)果(表2)可以看出， NAA濃度為0.4 mg/L時(shí)，6-BA濃度在1.0～4.0 mg/L范圍內(nèi)遞增，孝順竹組培苗的增殖系數(shù)隨濃度變化呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)6-BA濃度為2.0 mg/L時(shí)組培苗的增殖系數(shù)達(dá)到最大值，為1.99，顯著高于其他處理；6-BA濃度繼續(xù)上升，組培苗增殖系數(shù)反而降低。6-BA濃度為1.0 mg/L與3.0 mg/L處理間的增殖系數(shù)無(wú)顯著性差異，但二者均顯著高于4.0 mg/L處理。由此認(rèn)為，當(dāng)NAA濃度為0.4 mg/L時(shí)，適宜孝順竹組培苗增殖培養(yǎng)的6-BA濃度為2.0 mg/L。

表2　6-BA不同濃度對(duì)增殖系數(shù)的影響

2.3 上一代培養(yǎng)基對(duì)組培苗增殖培養(yǎng)的影響

將上述編號(hào)為1—11的培養(yǎng)基中的組培苗接入MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L+活性炭1 g/L中，培養(yǎng)條件同上，培養(yǎng)40 d后，統(tǒng)計(jì)組培苗的增殖系數(shù)和生長(zhǎng)情況并無(wú)明顯差異，這表明在本試驗(yàn)所設(shè)定的不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比對(duì)下一代組培苗生長(zhǎng)無(wú)明顯影響。

2.4 組培苗不同狀態(tài)及接種方式對(duì)孝順竹增殖培養(yǎng)的影響

在繼代培養(yǎng)接種時(shí)，分割為單個(gè)芽且?guī)в懈难吭诶^代培養(yǎng)基中較為容易成活，成長(zhǎng)為叢芽，而不帶根的芽則在繼代培養(yǎng)基中逐漸變黃甚至死亡；平放與直插2種方式比較，直插接種芽增殖系數(shù)較高，葉深綠色，芽生長(zhǎng)健壯，根系粗壯，須根多；平放式在節(jié)間可能出現(xiàn)不定根，進(jìn)而產(chǎn)生新的植株，但是此法只適用于株高較高且靠近根部有突出竹節(jié)的竹苗，對(duì)于普通高度(4～6 cm)的組培苗，其葉片容易發(fā)黃老化從而無(wú)法形成叢生芽，導(dǎo)致其增殖系數(shù)較低。

將上一代組培苗在MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)40 d后分株，取大小基本一致的芽苗進(jìn)行去除頂梢和保留頂梢處理，均采用直插方式接種于MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L+活性炭1g/L培養(yǎng)基中。接種40 d后調(diào)查發(fā)現(xiàn)，保留頂梢的組培苗生長(zhǎng)正常，植株健壯，葉色深綠(圖3)；去除頂梢處理的組培苗生長(zhǎng)情況與保留頂梢處理的組培苗無(wú)明顯差異，但是去除頂梢處理的組培苗傷口下端竹節(jié)加大加粗，更易產(chǎn)生氣生根，從而可以增加增殖系數(shù)(圖4)。

圖3　保留頂梢繼代苗

圖4　去除頂梢繼代苗

3 小結(jié)與討論

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類和濃度是影響組織培養(yǎng)成功的關(guān)鍵，不同植物種所添加的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類和濃度不同。有關(guān)研究表明，MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+椰子汁100 ml/L適宜孝順竹增殖生長(zhǎng)[10]，所以在本次試驗(yàn)中也進(jìn)行了6-BA 和NAA 2種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比的研究。本試驗(yàn)結(jié)果表明，最適宜孝順竹組培苗增殖生長(zhǎng)的培養(yǎng)基是MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L+1 g/L活性炭，增殖系數(shù)可達(dá)1.99。試驗(yàn)結(jié)果與前人研究有差異，可能是因?yàn)椴涣私庖又某煞侄刺砑右又?，也可能由其他原因造成，有待于進(jìn)一步試驗(yàn)研究。

在孝順竹組織培養(yǎng)研究中，對(duì)于基本培養(yǎng)基、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和接種部位選擇等研究較多，但是關(guān)于芽苗狀態(tài)及接種方式對(duì)增殖培養(yǎng)影響的研究卻鮮有報(bào)道。通常情況下，組培苗中一些帶根的芽在繼代培養(yǎng)基中較為容易成活成長(zhǎng)為叢芽，而不帶根的芽則在繼代培養(yǎng)基中因難以吸收培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而死亡。參考竹子傳統(tǒng)的繁殖方式埋節(jié)、埋稈、扦插等繁殖方式[11]，本試驗(yàn)中對(duì)孝順竹組培苗也進(jìn)行了埋節(jié)繼代培養(yǎng)，竹節(jié)處易出不定根從而可以提高增殖系數(shù)，但是此法只適用于株高較高且靠近根部有突出竹節(jié)的組培苗，其他竹苗則由于頂端優(yōu)勢(shì)，影響其正常生長(zhǎng)，導(dǎo)致葉片老化變黃，竹稈彎曲細(xì)弱，停止生長(zhǎng)甚至死亡。同時(shí)，試驗(yàn)中也對(duì)孝順竹是否保留頂梢進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)適當(dāng)去除頂梢有利于傷口下端的竹節(jié)膨大，進(jìn)而有利于產(chǎn)生氣生根，提高增殖系數(shù)。

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，孝順竹組培苗在MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，繼代周期為30～60 d，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，增殖系數(shù)增加，但是在50 d之后增殖倍數(shù)增加的幅度開(kāi)始變小，竹苗加粗而且開(kāi)始出現(xiàn)葉片變黃的現(xiàn)象，培養(yǎng)時(shí)間為30 d，增殖系數(shù)較低，無(wú)法滿足試驗(yàn)需求。因此認(rèn)為，孝順竹組培苗的培養(yǎng)時(shí)間最好控制在40～50 d。

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Influencing Factors to Proliferation Culture ofBambusamultiplexPlantletsinvitro

Li Jia1Ma Xiaoyue1Zhang Xueying1Gao Zhimin2

(1 College of Horticulture, Agricultural University of Hebei, Baoding 071001, Hebei, China 2 International Center for Bamboo and Rattan, Key Laboratory on the Science and Technology of Bamboo and Rattan,Beijing 100102, China)

Theinvitroplantlets ofBambusamultiplexwere selected as test materials to study the effects of the basic media, plant growth regulators and the inoculation methods on the plantlet proliferation culture.The results indicated that the suitable medium formula for the plantlet proliferation culture was MS + 6 - BA 2.0 mg/L + 0.4 mg/L NAA + activated carbon 1 g/L. The treatment of burying internodes into medium could increase the proliferation coefficient of the bamboo plantlets. Meanwhile, the removal of plantlet top could contribute to the enlargement of the nodes at lower parts, and thus induce the formation of adventitious roots, which could also lead to the improvement of proliferation coefficient.

Bambusamultiplex, plantletsinvitro, plant growth regulator, proliferation

林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(編號(hào)：201504106)。

李佳，女，在讀碩士生，從事果樹(shù)生物技術(shù)研究。E-mail: lijia1203@163.com。

張學(xué)英，女，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)楣麡?shù)生物技術(shù)。E-mail: zhangxueying1996@163.com。

高志民，男，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹裉偕L(zhǎng)發(fā)育的分子基礎(chǔ)。E-mail: gaozhimin@icbr.ac.cn。

10.13640/j.cnki.wbr.2016.04.002