復(fù)方片仔癀肝寶對(duì)酒精誘導(dǎo)的慢性肝損傷氧化應(yīng)激的保護(hù)作用研究*

陳達(dá)鑫　林珊　趙錦燕　曾建偉　洪振豐#

（1福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院　福州350122；2福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室　福州350122）

復(fù)方片仔癀肝寶對(duì)酒精誘導(dǎo)的慢性肝損傷氧化應(yīng)激的保護(hù)作用研究*

陳達(dá)鑫1，2林珊1，2趙錦燕1，2曾建偉1，2洪振豐1，2#

（1福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院福州350122；2福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室福州350122）

目的：探討復(fù)方片仔癀肝寶對(duì)酒精性肝?。ˋleoholie Liver Disease，ALD）模型大鼠氧化應(yīng)激的保護(hù)作用。方法：60只SPF級(jí)SD大鼠，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性藥對(duì)照組及肝寶低、中、高劑量組，每組10只。除正常對(duì)照組外其余各組用酒精聯(lián)合高脂飼料喂養(yǎng)2周，造ALD模型，連續(xù)給藥4周后取材。全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、乳酸脫氫酶（LDH）的含量變化；檢測(cè)肝組織中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）的表達(dá)；HE染色，觀察肝組織病理變化。結(jié)果：模型組血清中ALT、AST、ALP、LDH的活性較正常對(duì)照組均有明顯的上升，且肝組織中MDA水平明顯上升，SOD、GSH-Px水平明顯下降（P＜0.01）。與模型組相比，肝寶各組ALT、AST、ALP、LDH的活性及MDA水平明顯降低，而SOD、GSH-Px水平明顯上升（P＜0.05）。HE染色結(jié)果顯示復(fù)方片仔癀肝寶不同劑量組對(duì)肝組織脂肪變性、肝內(nèi)脂類(lèi)聚集有明顯的改善作用，并且存在劑量效應(yīng)關(guān)系。結(jié)論：復(fù)方片仔癀肝寶能顯著減輕酒精和高脂誘導(dǎo)的肝損傷，其機(jī)制可能與提高肝組織的抗氧化能力有關(guān)。

酒精性肝損傷；片仔癀肝寶；氧化應(yīng)激

酒精性肝病（Alcoholie Liver Disease，ALD）表現(xiàn)多樣，初期通常表現(xiàn)為酒精性脂肪肝（Alcoholic Fatty Liver，AFL），進(jìn)而可發(fā)展成酒精性肝炎（Alcoholic Hepatitis，AH）、酒 精 性 肝 纖 維 化（Alcoholic Liver Fibosis，ALF） 和酒精性肝硬化（Alcoholic Liver Cirrhosis，ALC），臨床上將這些疾病統(tǒng)稱(chēng)為ALD［1］。ALD是西方國(guó)家最常見(jiàn)的肝病，在我國(guó)發(fā)病率有增多的趨勢(shì)，防治ALD已成為保護(hù)人類(lèi)健康的重要醫(yī)學(xué)問(wèn)題?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)肝損傷的研究比較深入，但療效尚難盡如人意，所用的藥物因毒副作用多、價(jià)格高昂等問(wèn)題，限制了其臨床應(yīng)用。中醫(yī)藥治療肝損傷的臨床優(yōu)勢(shì)越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)外專(zhuān)家的重視和肯定，其多途徑、多層次、多靶點(diǎn)的治療作用日益受到國(guó)內(nèi)外的肯定，故深入探索有效的抗肝損傷方藥具有十分深遠(yuǎn)的意義。復(fù)方片仔癀肝寶是一種由多種中草藥混合而成的中成藥制劑，含牛黃、三七、蛇膽、茵陳、龍膽草、梔子、白芍等名貴藥材，具有較好的保肝護(hù)肝作用［2～3］。本實(shí)驗(yàn)以酒精和高脂喂養(yǎng)誘導(dǎo)慢性肝損傷模型，用復(fù)方片仔癀肝寶進(jìn)行干預(yù)治療，研究探索復(fù)方片仔癀肝寶對(duì)慢性肝損傷的保護(hù)作用及其部分作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)條件SD大鼠，SPF級(jí)，體重（200±20）g，雄性，許可證號(hào)：SCXK（滬）2008-0016，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，溫度20～24℃，濕度40%～70%［（50± 5）%］，風(fēng)速0.1～0.2 m/s，氣流≥28次/min。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物及試劑片仔癀肝寶由福建省片仔癀藥業(yè)有限公司提供（批號(hào)：1406001）；SOD（貨號(hào)：A001-3）、MDA（貨號(hào)：A003-1）、GSP-Px（貨號(hào)：A005）試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。無(wú)水乙醇、分析純由上海凌峰化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)（批號(hào)：00130523）。

1.3儀器電子天平（FA1104N，上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司）、低溫離心機(jī)（TGL-16G，上海安亭科學(xué)器材公司）、全自動(dòng)生化分析儀（Bayer ADVIA2400，德國(guó)西門(mén)子公司）、低溫高速離心機(jī)（64R，美國(guó)貝克曼公司）、酶標(biāo)儀（ELX808，德國(guó)寶特公司）。

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1動(dòng)物分組、模型制備及給藥SPF級(jí)雄性大鼠60只，體重（180±10）g，取10只作為正常對(duì)照組正常飼養(yǎng)，為防止對(duì)照組在長(zhǎng)時(shí)間飼養(yǎng)后也出現(xiàn)脂肪肝的情況，依據(jù)經(jīng)驗(yàn)，每周給予2 d全粗糧飼料喂養(yǎng)。其余動(dòng)物進(jìn)行造模干預(yù)：以乙醇聯(lián)合高脂飼料干預(yù)，每日1次。造模前3 d以15%乙醇0.7 ml/100 g進(jìn)行適應(yīng)性灌胃。第4天開(kāi)始每日定時(shí)以30%乙醇0.7 ml/100 g灌胃。兩周后，模型條件不變，造模大鼠隨機(jī)分成五組：水飛薊賓葡甲胺片陽(yáng)性對(duì)照組（600 mg/kg）、模型陰性對(duì)照組、肝寶低劑量組（150 mg/kg）、肝寶中劑量組（300 mg/kg）、肝寶高劑量組（600 mg/kg）各10只。定時(shí)給藥，灌藥時(shí)間與灌乙醇時(shí)間間隔2 h。連續(xù)4周，正常對(duì)照組、模型陰性對(duì)照組灌胃等量醫(yī)用生理鹽水。第4周末次給藥24 h后，空腹用3%戊巴比妥鈉60 mg/kg腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈采血后，分離血清，-20℃保存，用于血液生化指標(biāo)的測(cè)定；取肝臟，迅速分離，取肝右葉用4%多聚甲醛固定，用于HE染色。

2.2血液生化分析取大鼠腹主動(dòng)脈血，2 000 r/min離心10 min，分離得到血清，應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)大鼠血清中ALT、AST、ALP、LDH的活性。

2.3肝勻漿SOD、MDA、GSP-Px檢測(cè)4℃生理鹽水沖洗肝表面，稱(chēng)取0.5 g肝組織，加入9 ml生理鹽水，剪碎，研磨，制備5%的肝勻漿，2 500 r/min離心10 min，取上清。BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。按照試劑盒操作說(shuō)明，檢測(cè)肝組織中SOD、MDA、GSP-Px的含量。

2.4 肝組織病理學(xué)觀察多聚甲醛固定的肝右葉組織制備石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察肝組織病理改變。

3　結(jié)果

3.1生化測(cè)定結(jié)果與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠血清ALT、AST、ALP、LDH水平明顯高于正常組（P＜0.01）。各給藥組分別與模型組相比，陽(yáng)性藥組血清ALT和AST活力明顯降低（P＜0.01），血清ALP和LDH存在降低趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；肝寶高劑量組血清ALT、LDH活力顯著降低（P＜0.01），AST和ALP水平下降（P＜0.05）；肝寶中劑量組ALT降低具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），AST、ALP、LDH有降低趨勢(shì)但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；肝寶低劑量組肝寶高劑量組血清ALT、AST、LDH活力顯著降低（P＜0.05），ALP的降低無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1　復(fù)方片仔癀肝寶對(duì)酒精誘導(dǎo)的慢性肝損傷肝功能恢復(fù)情況比較（U/L，x±s）

3.2肝寶對(duì)SOD、MDA及GSH-Px的影響通過(guò)檢測(cè)大鼠肝組織勻漿SOD、MDA以及GSH-Px的水平及活性觀察復(fù)方片仔癀肝寶對(duì)氧化應(yīng)激的保護(hù)作用。與正常對(duì)照組相比較，模型組大鼠肝臟中SOD、GSH-Px活性顯著下降，而MDA的水平明顯升高（P＜0.01），提示酒精誘導(dǎo)的慢性肝損傷發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)；與模型組相比較，各用藥組肝組織SOD、GSH-Px活性增加，統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著（P＜0.05），同時(shí)各用藥組MDA水平顯著降低（P＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)表2、圖1。

表2　復(fù)方片仔癀肝寶對(duì)酒精誘導(dǎo)的慢性肝損傷氧化應(yīng)激的保護(hù)作用（nmol/mg prot，x±s）

圖1　復(fù)方片仔癀肝寶對(duì)酒精誘導(dǎo)的慢性肝損傷氧化應(yīng)激指標(biāo)

3.3病理組織學(xué)結(jié)果光鏡下觀察6組大鼠肝臟病理組織學(xué)改變，正常對(duì)照組可見(jiàn)肝小葉輪廓清晰，小葉中央靜脈向四周呈放射狀排列，肝細(xì)胞排列尚整齊，細(xì)胞分界清，核圓，位于細(xì)胞中央，胞質(zhì)豐富，呈嗜堿性；酒精模型組可見(jiàn)肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝板排列紊亂，呈點(diǎn)、片狀壞死，肝細(xì)胞腫脹明顯，胞質(zhì)中可見(jiàn)大小不等、數(shù)量不一的圓形脂肪空泡，散在肝細(xì)胞嗜酸性變，小葉中央靜脈周?chē)蛥R管區(qū)有炎細(xì)胞浸潤(rùn)，有的肝細(xì)胞質(zhì)中有紅色顆粒狀Mallory小體；肝寶治療組大鼠肝細(xì)胞濁腫明顯減輕，有散在炎細(xì)胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞內(nèi)偶有小脂滴。見(jiàn)圖2。

圖2　片仔癀肝寶對(duì)肝組織病理變化的影響（光學(xué)顯微鏡100×）

4　討論

本實(shí)驗(yàn)采用酒精聯(lián)合高脂飲食誘導(dǎo)大鼠慢性肝損傷，觀察復(fù)方片仔癀肝寶對(duì)肝損傷的保護(hù)作用并探討其作用機(jī)制。肝損傷的發(fā)生機(jī)制非常復(fù)雜，大多與肝內(nèi)脂質(zhì)代謝異常、胰島素抵抗、脂質(zhì)過(guò)氧化和氧化應(yīng)激等因素有關(guān)，這些因素在肝損傷的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起了重要作用，其中肝組織的氧化應(yīng)激越來(lái)越受到關(guān)注。

臨床上ALT和AST是最敏感的肝功能檢測(cè)指標(biāo)，對(duì)反映肝細(xì)胞內(nèi)線粒體膜的損傷有重要意義［4～5］。正常時(shí)，肝細(xì)胞中的ALT、AST無(wú)明顯外漏，故血清中的ALT、AST屬于正常較低的水平。當(dāng)肝臟受到損害時(shí)，胞漿內(nèi)的ALT和AST向肝血竇溢出，并進(jìn)入周?chē)?，血清ALT、AST活性增加，提示肝細(xì)胞破壞，細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)及線粒體受到損傷。因此，ALT、AST能直接反應(yīng)肝臟受損傷的程度。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M大鼠血清中ALT、AST、ALP、LDH酶活性明顯升高，表明模型大鼠肝損傷明顯。給予不同劑量復(fù)方片仔癀肝寶和陽(yáng)性藥物干預(yù)后大鼠血清中ALT、AST、ALP、LDH酶活性不同程度地降低，表明復(fù)方片仔癀肝保片對(duì)酒精誘導(dǎo)所致大鼠慢性肝損傷起到了明顯的保肝降酶作用。

SOD作為機(jī)體內(nèi)重要的氧化自由基清除劑，是目前為止發(fā)現(xiàn)的唯一的以自由基為底物的酶，具有極強(qiáng)的抗炎癥作用［6］。GSH-Px是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過(guò)氧化物分解酶。SOD和GSH-Px對(duì)機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，它能清除體內(nèi)的超氧陰離子、自由基保護(hù)細(xì)胞免受損傷。MDA是氧化應(yīng)激和抗氧化劑狀態(tài)的標(biāo)志物，是一種強(qiáng)有力的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，通常被作為脂質(zhì)過(guò)氧化的判斷指標(biāo)。因此，同時(shí)提高SOD、GSH-Px活性和降低肝MDA能對(duì)抗氧化應(yīng)激狀態(tài)，提高肝臟抗氧化能力是防治肝損傷的有效途徑。本研究結(jié)果表明復(fù)方片仔癀肝寶可通過(guò)增加機(jī)體SOD和GSH-Px活性，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，加速自由基的清除，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，清除過(guò)量的MDA，從而保護(hù)肝臟結(jié)構(gòu)和功能。綜上所述，復(fù)方片仔癀肝寶能夠顯著改善ALD模型大鼠肝臟脂肪變性程度，降低血清ALT、AST、ALP、LDH水平，提示肝寶對(duì)ALD具有一定的防治作用，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其作用機(jī)制可能與通過(guò)增強(qiáng)抗氧化能力，降低肝內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，清除自由基有關(guān)。

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Compound Pien Tze Huang Ganbao Protects Against Alcohol-induced Chronic Liver Injury Caused by Oxidative Stress

CHEN Da-xin1，2，LIN Shan1，2，ZHAO Jin-yan1，2，ZENG Jian-wei1，2，HONG Zhen-feng1，2#
（1Academy of Integrative Medicine，F(xiàn)ujian University of Traditional Chinese Medicine，F(xiàn)uzhou350122；
2Fujian Key Laboratory of Integrative Medicine on Geriatric，F(xiàn)ujian University of Traditional Chinese Medicine，F(xiàn)uzhou350122）

Objective:To determine the protective effect of Compound Pien Tze Huang Ganbao（GB）in alcoholic liver disease （ALD）using a rat model of oxidative stress.Methods:60 SPF SD rats were randomly divided into control group，model group，positive control group，GB low，medium and high dose groups（n=10 for each group）.All groups except control group were fed an alcohol and high fat diet for two weeks，as a model for ALD，and rats were sacrificed following 4 weeks of feeding.The level of expression of serum alanine aminotransferase（ALT），aspartate aminotransferase（AST），alkaline phosphatase（ALP）and lactate dehydrogenase（LDH）were detected with automatic biochemical analyzer，as well as the expression of superoxide dismutase（SOD），malondialdehyde（MDA）and glutathione peroxidase（GSH-Px）in liver tissue.Using HE staining，pathological changes were observed in liver tissue.Results:In the ALD model group，the activity of ALT，AST，ALP and LDH significantly increased compared to the control group.In addition，in liver tissue the level of MDA significantly increased too，whereas levels of SOD and GSH-Px significantly decreased（P＜0.01）.Compared with the ALD model group，in GB treated group activity of ALT，AST，ALP，LDH and the expression of MDA significantly decreased，whereas SOD and GSH-Px levels significantly increased（P＜0.05）.HE staining showed that different doses of GB resulted in significant improvements in hepatic steatosis and hepatic lipid accumulation with a dose-response relationship.Conclusion:Complex prescription Pien Tze Huang Ganbao can significantly reduce fat and alcohol-induced liver damage，which may be beneficial in improving the antioxidant capacity of liver tissue.

Pien Tze Huang Ganbao；Alcoholic liver disease；Oxidative stress

R575.2

Bdoi:10.13638/j.issn.1671-4040.2016.07.002

2016-06-08）

·綜合報(bào)道·

福建省科技廳項(xiàng)目（編號(hào)：2010YZ0001-1）

洪振豐，E-mail：zfhong1953@163.com