黃芪多糖對(duì)小鼠卵母細(xì)胞體外成熟的影響

閆學(xué)花，王麗麗，張　銳，文　楊，李科瑛，楊　萌，雷安民，張為民

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

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黃芪多糖對(duì)小鼠卵母細(xì)胞體外成熟的影響

閆學(xué)花△，王麗麗△，張銳，文楊，李科瑛，楊萌，雷安民*，張為民*

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

采集未成熟小鼠卵母細(xì)胞添加不同濃度的黃芪多糖(APS)進(jìn)行體外成熟(IVM)培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)卵母細(xì)胞生發(fā)泡破裂(GVBD)發(fā)生率以及第一極體(first polarbody,PB1)排出率，并通過卵母細(xì)胞JC-1染色方法進(jìn)行線粒體膜電位檢測；進(jìn)一步在卵母細(xì)胞培養(yǎng)液中添加丙酮醛(MG)與黃芪多糖共培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)GVBD發(fā)生率及PB1排出率，檢測活性氧(ROS)產(chǎn)生情況，探討黃芪多糖在小鼠卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)及體外成熟中的作用。結(jié)果顯示,黃芪多糖對(duì)小鼠卵母細(xì)胞體外成熟，包括GVBD發(fā)生率和PB1排出率無顯著影響。添加丙酮醛與黃芪多糖共培養(yǎng)結(jié)果顯示，10 mg/mL+APS+MG試驗(yàn)組PB1排出率顯著降低,相應(yīng)的卵母細(xì)胞ROS產(chǎn)生量顯著升高，但對(duì)GVBD發(fā)生率則無顯著影響。

小鼠卵母細(xì)胞；黃芪多糖；體外培養(yǎng)

卵泡體外培養(yǎng)和卵母細(xì)胞體外成熟是獲得成熟卵母細(xì)胞的重要途徑，首個(gè)卵母細(xì)胞體外成熟的報(bào)道是在1939年[1-2]。卵母細(xì)胞成熟包括核成熟和質(zhì)成熟，自然情況下，哺乳動(dòng)物的卵母細(xì)胞成熟過程經(jīng)歷了一個(gè)不對(duì)等的減數(shù)分裂，形成一個(gè)大的單倍體卵子和一個(gè)小的極體，這對(duì)于受精是必不可少的。1983年，體外成熟(invitromaturation，IVM)技術(shù)首次成功應(yīng)用于臨床，目前IVM研究已由單純基礎(chǔ)研究擴(kuò)展到試管嬰兒、供卵、生殖保險(xiǎn)等多個(gè)領(lǐng)域[3]，有廣闊的應(yīng)用前景。大量試驗(yàn)證明，IVM是可行且安全的。體外成熟過程中卵母細(xì)胞的培養(yǎng)條件，包括溫度、氣體以及其他各種各樣的媒介，對(duì)胚胎生產(chǎn)的質(zhì)量和數(shù)量起到關(guān)鍵的作用[4]。因此，卵母細(xì)胞的體外培養(yǎng)條件的相關(guān)研究引起了越來越多學(xué)者的關(guān)注。

黃芪多糖(Atragaluspolysaccharides，APS)是黃芪的主要活性成分，是黃芪中含量最多、藥理作用最顯著的一類物質(zhì)。鑒于中藥在促細(xì)胞增殖、抗氧化、保胎及促精子活力[5-7]等方面的作用以及其能從整體性、多靶點(diǎn)、全方位改善機(jī)體的生理狀態(tài)等特點(diǎn)?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖具有清除自由基、抗氧化、改善微循環(huán)及免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)骨髓造血、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞功能等藥理作用，對(duì)各系統(tǒng)功能均有一定的影響[8]。已有研究證明，多種抗氧化劑對(duì)卵母細(xì)胞成熟以及胚胎發(fā)育有明顯的影響[9-13]。

氧化應(yīng)激是近幾年已被證實(shí)的參與誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的主要機(jī)制之一[14]。在卵母細(xì)胞成熟過程中，氧化應(yīng)激能夠抑制卵母細(xì)胞生發(fā)泡破裂(germinal vesicle breakdown,GVBD)及減數(shù)分裂紡錘體組裝和功能[15-16]。此外，活性氧(reactive oxygen species，ROS)的生成可以改變幾個(gè)氧化還原途徑并可能最終導(dǎo)致卵母細(xì)胞凋亡和胚胎死亡[17]。研究表明，一些化學(xué)試劑可以導(dǎo)致卵母細(xì)胞中活性氧水平升高[18-19]，而加入一些抗氧化劑，例如白藜蘆醇，可以顯著降低活性氧的產(chǎn)生[19]，進(jìn)而提高卵母細(xì)胞的成熟率。已有研究顯示，丙酮醛(methylglyoxal，MG)可導(dǎo)致卵母細(xì)胞自由基生成增加，引起氧化損傷，干擾紡錘體的正確組裝，導(dǎo)致成熟率降低[19]，可用于構(gòu)建卵母細(xì)胞氧化損傷模型。

本試驗(yàn)通過收集GV期小鼠卵母細(xì)胞，培養(yǎng)液中分別添加不同濃度的黃芪多糖進(jìn)行體外培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)卵母細(xì)胞成熟率，檢測卵母細(xì)胞線粒體膜電位變化；進(jìn)一步添加丙酮醛與黃芪多糖對(duì)小鼠卵母細(xì)胞共培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)卵母細(xì)胞成熟率，同時(shí)檢測活性氧水平，旨在研究黃芪多糖對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟的影響及其可能機(jī)制，以期為哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)條件提供借鑒，也為黃芪多糖在生殖生物學(xué)方面的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6周齡～8周齡昆明白雌性小鼠，購自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)過程中的保持規(guī)律的光照周期(12/12h光照/黑暗)，溫度保持在23℃～27℃，相對(duì)濕度在40%～70%，小鼠自由采食和飲水。

1.1.2藥品與試劑黃芪多糖(Z20040086)，天津賽諾制藥有限公司產(chǎn)品；DPPH、Hoechst33342、M2培養(yǎng)基、礦物油、丙酮醛(MG)、線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)等，美國Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；活性氧檢測試劑盒，碧云天生物技術(shù)研究所產(chǎn)品；孕馬血清(PMSG)，寧波三生藥業(yè)有限公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1清除DPPH自由基能力的測定稱取適量DPPH溶于無水乙醇，配制成0.2 mmol/L的DPPH溶液。分別向6個(gè)不同濃度(5、10、15、20、25、30 mg/L)的黃芪多糖待測溶液2.0 mL，加入0.2 mmol/L的DPPH溶液2.0 mL，搖勻，靜置100 min，以無水乙醇調(diào)零，測定在517 nm處的吸光度A0，同時(shí)測定2.0 mL DPPH溶液與2.0 mL無水乙醇混勻后在517 nm處的吸光度Ai，計(jì)算公式為：清除率(inhibition percent), I=[1(A0-Ai/A0]×100%，以維生素C作為黃芪多糖抗氧化能力的陽性對(duì)照。

1.2.2卵母細(xì)胞的收集和試驗(yàn)處理選取6周齡～8周齡的雌鼠，經(jīng)腹腔注射10 IU的PMSG進(jìn)行超數(shù)排卵處理，并刺激卵泡的生長，44 h～46 h后斷頸處死小鼠，取出卵巢放入含有2.5 μmol/L米力農(nóng)的MEM培養(yǎng)液，在體視顯微鏡下用針壓破卵泡，挑選GV期卵母細(xì)胞,清洗后，將其移入預(yù)先平衡過的、植物油覆蓋的M2培養(yǎng)基液滴中，放入37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，17 h后統(tǒng)計(jì)GVBD發(fā)生率和PB1排出率。

1.2.3卵母細(xì)胞的體外培養(yǎng)分組按照以上方法采集小鼠卵母細(xì)胞，按以下分組進(jìn)行培養(yǎng)。A，添加黃芪多糖組：空白對(duì)照組,0.1、1、10 mg/mL黃芪多糖培養(yǎng)組。B，添加黃芪多糖與丙酮醛共培養(yǎng)組：空白對(duì)照組,丙酮醛組,0.1 mg/mL APS+ MG組、1 mg/mL APS + MG組、10 mg/mL APS + MG組，MG濃度均為75 μmol/L。每個(gè)培養(yǎng)滴中加入20個(gè)～30個(gè)卵母細(xì)胞，于上述條件中培養(yǎng)，17 h后，統(tǒng)計(jì)PB1排出率，PB1排出率=17 h發(fā)生PBE1的卵母細(xì)胞數(shù)/發(fā)生GVBD的卵母細(xì)胞數(shù)，同時(shí)進(jìn)行卵母細(xì)胞標(biāo)記物免疫熒光染色。

1.2.4小鼠卵母細(xì)胞線粒體膜電位測定參照文獻(xiàn)[20]，將成熟培養(yǎng)17 h的卵母細(xì)胞進(jìn)行JC-1染色。卵母細(xì)胞用PBS洗3遍，置于1 mmol/L JC-1的培養(yǎng)液中，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2中孵育20 min。后用預(yù)冷的1×JC-1 staining buffer清洗卵母細(xì)胞，最后在熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5卵母細(xì)胞活性氧熒光探針標(biāo)記用無血清培養(yǎng)液MEM按照1∶1 000稀釋DCFH-DA，使其終濃度為10 μmol/mL，將培養(yǎng)17 h的卵母細(xì)胞置于此溶液中，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2中孵育20 min，用MEM清洗卵母細(xì)胞，最后在熒光顯微鏡下觀察。

1.2.6數(shù)據(jù)分析每個(gè)統(tǒng)計(jì)至少3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)是由一個(gè)獨(dú)立的試驗(yàn)在不同的時(shí)間完成。試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Graphpad Prism 5.0進(jìn)行方差分析，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。熒光強(qiáng)度用Image J進(jìn)行分析。

2　結(jié)果

2.1DPPH自由基清除測定

如圖1所示，VC作為陽性對(duì)照，黃芪多糖的清除率為30%左右，DPPH自由基清除隨著黃芪多糖濃度增大變化不明顯。

圖1　不同濃度黃芪多糖對(duì)自由基的清除能力Fig.1　The scavenging ability of free radix by different concentrations of Astragalus polysaccharide

2.2黃芪多糖對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟的影響

卵母細(xì)胞在加有黃芪多糖的M2培養(yǎng)基中培養(yǎng)17 h后，對(duì)生發(fā)泡破裂(GVBD)率和第一極體排出(PBE1)率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)(圖2和圖3)?？梢钥闯?，各組GVBD率為90%左右，各組間無顯著性差異；PBE1率分別為76.91%(對(duì)照組)，63.62%(0.1 mg/mL)，47.70%(1.0 mg/mL)，65.14%(10 mg/mL)，添加黃芪多糖后，小鼠卵母細(xì)胞GVBD發(fā)生率以及PB1排出率無顯著性變化，并且PB1排出率還有輕微降低，但與對(duì)照組相比差異不顯著。

圖2　添加黃芪多糖對(duì)卵母細(xì)胞GVBD發(fā)生率的影響Fig.2　Effect of addition of Astragalus polysaccharides on GVBD rate in mouse oocytes

2.3黃芪多糖對(duì)卵母細(xì)胞線粒體膜電位的影響

線粒體膜電位與線粒體ATP的產(chǎn)生直接相關(guān)，成熟培養(yǎng)卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)17 h后同時(shí)進(jìn)行線粒體膜電位檢測，在熒光顯微鏡下卵母細(xì)胞顯示出紅色和綠色2種顏色，紅色熒光代表較高的線粒體膜電位，主要分布于卵母細(xì)胞外圍，綠色熒光代表較低的膜電位，在卵母細(xì)胞中散在分布，黃芪多糖對(duì)卵母細(xì)胞膜電位的影響如圖4所示，可以看出，對(duì)照組、0.1、1、10 mg/mL黃芪多糖組紅色熒光強(qiáng)度/綠色熒光強(qiáng)度的比值分別是1.6、1.2、1.4、1.5，與對(duì)照組相比，黃芪多糖處理組卵母細(xì)胞線粒體膜電位略有下降，但無顯著差異。

圖3　添加黃芪多糖對(duì)卵母細(xì)胞PB1排出率的影響Fig.3　Effect of addition of Astragalus polysaccharides on PBE1 rate in mouse oocytes

A.綠色熒光；B.紅色熒光；C.各組紅色熒光/綠色熒光強(qiáng)度比

A.Green fluorescence;B.Red fluorescence;C.Red fluorescence/green fluorescence

圖4黃芪多糖對(duì)卵母細(xì)胞線粒體膜電位的影響

Fig.4The influence ofAstragaluspolysaccharides on mitochondrial membrane potential of oocytes

2.4丙酮醛和黃芪多糖對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟的影響

添加丙酮醛和黃芪多糖共培養(yǎng)小鼠卵母細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)GVBD發(fā)生率(圖5)和PBE1排出率(圖6)，由圖可以看出，各組GVBD發(fā)生率為95%左右，各組間無顯著差異 ；PBE1排出率分別為71.54%、48.40%、 67.41%、62.49%和 20.88%。結(jié)果表明，10 mg/mL黃芪多糖與MG共培養(yǎng)則會(huì)造成PBE1%顯著降低(P<0.05)。

2.5丙酮醛和黃芪多糖對(duì)卵母細(xì)胞ROS水平的影響

運(yùn)用ROS檢測試劑盒檢測處理后卵母細(xì)胞內(nèi)ROS含量，結(jié)果如圖7所示，可以看出，僅MG+10 mg/mL黃芪多糖組ROS含量明顯升高，與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)。

3　討論

黃芪粉或以黃芪為主的中藥組方可提高畜禽的生產(chǎn)性能及飼料報(bào)酬率，黃芪多糖作為免疫增強(qiáng)劑的應(yīng)用很多，但其應(yīng)用于卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)和成熟方面的研究較少。黃芪作為扶本固正類中草藥飼料添加劑已開始應(yīng)用于畜牧業(yè)生產(chǎn)。研究證實(shí)，作為黃芪中發(fā)揮作用的主要成分，黃芪多糖對(duì)睡眠剝奪小鼠損傷的雄性生殖器官以及精子冷凍后DNA片段的完整性具有明顯的保護(hù)作用[21-22]，能提高產(chǎn)蛋后期母雞的生殖激素水平，有利于改善產(chǎn)蛋后期的卵巢功能，促進(jìn)卵泡發(fā)育與排卵[23]，這些資料提示，黃芪多糖在雌性動(dòng)物生殖方面可能發(fā)揮一定作用。

本研究采集小鼠卵母細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，對(duì)其進(jìn)行不同濃度黃芪多糖處理，結(jié)果表明，黃芪多糖對(duì)小鼠卵母細(xì)胞的體外成熟無明顯影響，反而與對(duì)照組相比有些許降低，其原因可能是原有培養(yǎng)基M2已含有卵母細(xì)胞體外成熟所需多糖，導(dǎo)致多糖作用占主導(dǎo)，從而影響其抗氧化作用的發(fā)揮，這與以往的抗氧化劑促進(jìn)卵母細(xì)胞體外成熟及進(jìn)一步發(fā)育不符[23-24]，有待本課題組后續(xù)研究。已有研究結(jié)果證實(shí)丙酮醛(MG)可引起卵母細(xì)胞氧化損傷[19]，可用于建立小鼠卵母細(xì)胞體外氧化損傷模型。我們采用丙酮醛與黃芪多糖共培養(yǎng)以觀察黃芪多糖對(duì)氧化損傷卵母細(xì)胞的作用，結(jié)果顯示，試驗(yàn)濃度的丙酮醛并不能造成小鼠卵母細(xì)胞體外成熟率的顯著下降，但是試驗(yàn)組中黃芪多糖(10 mg/mL)與MG共培養(yǎng)可引起卵母細(xì)胞成熟率(PBE1)顯著降低，而對(duì)GVBD的發(fā)生率沒有影響；進(jìn)一步檢測這些卵母細(xì)胞中ROS的含量，與成熟率結(jié)果一致，由此推測卵母細(xì)胞中自由基濃度升高導(dǎo)致成熟率降低，而高濃度的黃芪多糖并沒有起到清除自由基的作用，其原因有待于進(jìn)一步研究。

圖5添加黃芪多糖和丙酮醛共培養(yǎng)對(duì)卵母細(xì)胞GVBD發(fā)生率的影響

Fig.5Effect of addition ofAstragaluspolysaccharides and MG on GVBD rate in mouse oocytes

圖6　黃芪多糖和丙酮醛共培養(yǎng)對(duì)小鼠卵母細(xì)胞 PB1排出率的影響Fig.6　Effect of addition of Astragalus polysaccharides and MG on PBE1 rate in mouse oocytes

A.ROS含量測定熒光圖;B.ROS產(chǎn)生量

A.ROS content detected by fluorescence;B.ROS relative content

圖7黃芪多糖和丙酮醛共培養(yǎng)對(duì)卵母細(xì)胞ROS水平的影響

Fig.7Effects of MG andAstragaluspolysaccharides treatment on ROS level in mouse oocytes

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Effects of Astragalus Polysaccharides on in Vitro Maturation of Mouse Oocytes

YAN Xue-hua,WANG Li-li,ZHANG Rui,WEN Yang,LI Ke-ying,YANG Meng,LEI An-min,ZHANG Wei-min

(College of Veterinary Medicine,Northwest A&F University,Yangling,Shaanxi,712100,China)

In order to explore the effect ofAstragaluspolysaccharides(APS) in the process ofinvitromaturation (IVM) on mouse oocytes， immature mouse oocytes were collected from 6-8 week old mice and culturedinvitrowith APS( 0.1 mg/mL,1.0 mg/mL,10 mg/mL),and the rates of germinal vesicle breakdown (GVBD) and first polar body (PB1) elimination of oocytes were counted by statistics.The mitochondrial membrane potential in each group was detected.Simultaneously，the mouse oocytes were cultured with methylglyoxal (MG) and APS,and the production of ROS (reactive oxygen species) was detection.The results showed that addition of APS had no significant effects on mouse oocytes' maturation,including the rates of GVBD and PBE1.The result of addition of APS and MG for coculture of oocytes showed that the rate of PB1 elimination was significantly reduced in the group MG+10 mg/mL APS,and the ROS contents of oocyts increased significantly,but had no significant effect on GVBD rate.

mouse oocyte;Astragaluspolysaccharide;invitromaturation

2016-03-15

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31172280)

閆學(xué)花(1987-)，女，陜西延安人，碩士研究生，主要從事動(dòng)物胚胎工程研究。王麗麗(1986-)女，河北滄州人，博士研究生，主要從事動(dòng)物胚胎工程研究?！魍蓉暙I(xiàn)作者。*通訊作者

S852.165

A

1007-5038(2016)09-0079-05