HPLC法測(cè)定豬體內(nèi)雙氯芬酸的血藥濃度

李宇琛，陳鴻雨，吳天興，陸小松，韓孝欣，劉　芳，王東亮，李龍飛，卜仕金

(揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院/江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚(yáng)州 225009)

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HPLC法測(cè)定豬體內(nèi)雙氯芬酸的血藥濃度

李宇琛△，陳鴻雨△，吳天興，陸小松，韓孝欣，劉芳，王東亮，李龍飛，卜仕金*

(揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院/江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚(yáng)州 225009)

建立豬血漿中雙氯芬酸含量的HPLC測(cè)定法。豬血漿中雙氯芬酸采用正己烷-異丙醇混合溶液(90∶10，V/V)提取，HPLC紫外檢測(cè)器檢測(cè)。色譜柱為C18柱，流動(dòng)相為甲醇-15 g/L乙酸水溶液(80∶20，V/V)，測(cè)定波長(zhǎng)為276 nm。外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，血漿中雜質(zhì)不干擾雙氯芬酸的測(cè)定，雙氯芬酸血藥濃度在0.025 μg/mL～20.0 μg/mL范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好(R2=1)，最低定量限為0. 05 μg/mL，高、中、低空白血漿添加樣品濃度的日內(nèi)變異系數(shù)和日間變異系數(shù)分別小于4%和6%，回收率為85%～97%。結(jié)果表明，該方法適用于豬血漿中雙氯芬酸含量的測(cè)定，可用于含雙氯芬酸鈉的制劑在豬體內(nèi)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)和生物利用度研究。

高效液相色譜；雙氯芬酸；血藥濃度；仔豬

雙氯芬酸鈉(diclofenac sodium)是第三代非甾體抗炎藥，具有解熱、鎮(zhèn)痛和抗炎的作用[1]。其作用機(jī)制為抑制環(huán)氧化酶的活性，從而阻斷花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素，同時(shí)它能促進(jìn)花生四烯酸與甘油三酯結(jié)合，降低細(xì)胞內(nèi)游離的花生四烯酸濃度，從而間接抑制白三烯的合成[2]，這使得雙氯芬酸鈉具有了較強(qiáng)的抗炎作用。在國(guó)內(nèi)外獸醫(yī)臨床實(shí)踐中，雙氯芬酸鈉用于治療各種炎癥和創(chuàng)傷性退化疾病以及馬、牛、狗、豬等跛行性疼痛、術(shù)前的白內(nèi)障切除方面均有良好的療效[3]。因其具有起效快、作用時(shí)間長(zhǎng)、療效好、副作用小、長(zhǎng)期應(yīng)用無(wú)積蓄性等特點(diǎn)，作為人類(lèi)藥物已經(jīng)應(yīng)用多年[4-6]，在獸醫(yī)中應(yīng)用則相對(duì)有限，特別是國(guó)內(nèi)缺乏靶動(dòng)物的藥物代謝動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)數(shù)據(jù)。雙氯芬酸鈉在血漿中的解離百分率可達(dá)99.96%，因此其血藥濃度測(cè)定的標(biāo)示物為雙氯芬酸。本研究在國(guó)內(nèi)外現(xiàn)有研究基礎(chǔ)上建立優(yōu)化了一種測(cè)定豬血漿中雙氯芬酸的高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)方法，用以獲得雙氯芬酸鈉單方或復(fù)方制劑在豬體給藥后的血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)，為雙氯芬酸鈉藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究和生物利用度評(píng)價(jià)提供了可靠的方法支持與技術(shù)保證。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1藥品與試劑雙氯芬酸鈉對(duì)照品(含量為99.9%，批號(hào)：100334-200302)，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇(色譜純)，美國(guó)TEDIA公司產(chǎn)品；乙酸(色譜純)，德國(guó)CNW公司產(chǎn)品；正己烷、異丙醇和鹽酸均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2主要儀器Agilent1260型高效液相色譜儀，配有紫外檢測(cè)器和色譜工作站，Agilent公司產(chǎn)品；UPH-11-20T型優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)，成都超純科技有限公司產(chǎn)品；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠(chǎng)產(chǎn)品；SHB循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司產(chǎn)品；101-2A型電熱鼓風(fēng)干燥箱，南通市滬通制藥機(jī)械設(shè)備廠(chǎng)產(chǎn)品；電子分析天平，感量0.000 1 g，德國(guó)塞多利斯天平公司產(chǎn)品；KS-250D超聲儀，寧波科生儀器廠(chǎng)產(chǎn)品；WH-1微型漩渦混合儀，上海滬西分析儀器廠(chǎng)有限公司產(chǎn)品；TGL-16C型高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)產(chǎn)品；LD5-2A型低速離心機(jī)，北京雷勃爾離心機(jī)有限公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1試液的配制

1.2.1.11 mol/L鹽酸溶液的配制量取濃度為360 g/kg～380 g/kg的分析純濃鹽酸(摩爾濃度約為12 mol/L)41.6 mL，用458.4 mL雙純水稀釋并混勻即配成1 mol/L鹽酸溶液。

1.2.1.215 g/L乙酸水溶液的配制將色譜純乙酸和水按98.5∶1.5(m/m)的比例混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.1.3流動(dòng)相的配制將甲醇和15 g/L乙酸水溶液按80∶20(V/V)比例混勻，經(jīng)0.45 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾,并超聲脫氣20 min即可?，F(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.1.4雙氯芬酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和工作液的配制精密稱(chēng)取雙氯芬酸鈉對(duì)照品(經(jīng)105℃烘干至恒重)約21.5 mg于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，即配成濃度為2 000 μg/mL雙氯芬酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。置-20℃冰箱中保存。

準(zhǔn)確吸取適量雙氯芬酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用流動(dòng)相(甲醇∶15 L/g乙酸水溶液=80∶20，V/V)倍比稀釋成分別為一定濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液?，F(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.1.5正己烷-異丙醇溶液將正己烷和異丙醇按90∶10(V/V)的比例混勻即可，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.2豬空白血漿添加樣品的制備空白血樣來(lái)自未用雙氯芬酸等非甾體類(lèi)消炎藥的豬，血樣采集后用肝素抗凝，4 500 r/min離心10 min，分離血漿后于-20℃保存?zhèn)溆?。將保存的血漿經(jīng)自然(室溫)解凍后，加入一定量的雙氯芬酸標(biāo)準(zhǔn)工作液，渦旋混勻制得空白血漿添加藥物樣品。

1.2.3檢測(cè)

1.2.3.1色譜條件色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(250×4.6 mm，5 μm)柱；流動(dòng)相為甲醇-15 g/L乙酸水溶液(80∶20，V/V)；流速為0.9 mL/min；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為276 nm；柱溫25℃；進(jìn)樣量20 μL。

1.2.3.2豬血漿樣品的預(yù)處理準(zhǔn)確吸取500 μL血漿樣品加入1 mol/L鹽酸溶液0.1 mL后渦旋30 s，隨后加入2 mL正己烷-異丙醇(90∶10，V/V)渦旋5 min，16 000 r/min離心10 min。有機(jī)相移至25 mL雞心瓶中，45℃水浴條件下旋轉(zhuǎn)蒸干。殘?jiān)?00 μL流動(dòng)相渦旋5 min復(fù)溶， 12 000 r/min離心10 min。上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾，濾液供HPLC分析。

1.2.3.3標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制按1.2.2項(xiàng)下制備方法分別制得0.025、0.05、0.5、5、10、20 μg/mL系列空白血漿標(biāo)準(zhǔn)添加藥物濃度。將上述樣品按照1.2.3.2項(xiàng)下的血漿樣品處理方法處理后，進(jìn)行HPLC分析。采用外標(biāo)法計(jì)算，以雙氯芬酸峰面積對(duì)血藥濃度進(jìn)行加權(quán)線(xiàn)性回歸，得回歸方程，每個(gè)濃度重復(fù)3次。

1.2.4方法學(xué)驗(yàn)證

1.2.4.1檢測(cè)限(LOD)和定量限(LOQ)的測(cè)定 取信噪比S/N≥3時(shí)濃度為檢測(cè)限(LOD)，定量限(LOQ)結(jié)合精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果確定(信噪比S/N一般要≥10)。

1.2.4.2回收率測(cè)定按1.2.2項(xiàng)下制備方法分別制得0.05、5、20 μg/mL 3個(gè)雙氯芬酸空白血漿添加濃度。按1.2.3.2項(xiàng)下的血漿樣品預(yù)處理方法處理后，取上清液20 μL作HPLC分析。將測(cè)得雙氯芬酸峰面積，代入當(dāng)天的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)求得實(shí)測(cè)濃度。實(shí)測(cè)濃度與添加的真實(shí)濃度之比值乘以百分?jǐn)?shù)即為相對(duì)回收率。每個(gè)濃度重復(fù)3次。

1.2.4.3精密度測(cè)定按照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備方法分別制備0.05、5、20 μg/mL 3個(gè)濃度的空白血漿添加樣品及一條隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，按1.2.3.2項(xiàng)下血漿樣品處理方法操作。每批每個(gè)濃度制備5份平行樣品，連續(xù)3 d，共做3個(gè)批次。將測(cè)得雙氯芬酸峰面積，代入當(dāng)天的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得到實(shí)測(cè)濃度，據(jù)此分別計(jì)算批內(nèi)和批間變異系數(shù)。

1.2.5穩(wěn)定性考察

1.2.5.1室溫放置下的穩(wěn)定性制備濃度為0.05、5、20 μg/mL的5個(gè)平行樣品，考察存儲(chǔ)期間血漿內(nèi)雙氯芬酸的穩(wěn)定性。首先按照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備方法分別制備上述3個(gè)濃度的空白血漿添加樣品后立刻對(duì)樣品進(jìn)行分析，得到0時(shí)數(shù)據(jù)，之后在室溫(約22℃)下放置2 h后進(jìn)行樣品分析。通過(guò)與0時(shí)測(cè)定的數(shù)據(jù)比較，考察室溫下放置時(shí)血樣中雙氯芬酸的穩(wěn)定性。

1.2.5.2反復(fù)凍融條件下的穩(wěn)定性制備濃度為0.05、5、20 μg/mL的5個(gè)平行樣品，考察存儲(chǔ)期間血漿內(nèi)雙氯芬酸的穩(wěn)定性。首先按照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備方法分別制備上述3個(gè)濃度的空白血漿添加樣品后立刻對(duì)樣品進(jìn)行分析，得到0時(shí)數(shù)據(jù)。在-20℃下至少儲(chǔ)存1 d后取出解凍，之后再次冷凍、解凍，反復(fù)共進(jìn)行3次凍融循環(huán)處理。兩次凍融間隔時(shí)間至少為5 h。通過(guò)與0時(shí)測(cè)定的數(shù)據(jù)比較考察反復(fù)凍融下血樣中雙氯芬酸的穩(wěn)定性。

1.2.5.3凍存期間的穩(wěn)定性制備濃度為0.05、5、20 μg/mL的5個(gè)平行樣品，考察存儲(chǔ)期間血漿內(nèi)雙氯芬酸的穩(wěn)定性。首先按照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備方法分別制備上述3個(gè)濃度的空白血漿添加樣品后立刻對(duì)樣品進(jìn)行分析，得到0時(shí)數(shù)據(jù)，之后分別于凍存(約-20℃)1周和1月后進(jìn)行樣品分析。通過(guò)與0時(shí)測(cè)定的數(shù)據(jù)比較考察樣品貯存期間的穩(wěn)定性。

2　結(jié)果

2.1分離效果

由雙氯芬酸對(duì)照品、空白血漿、空白添加樣品的分離圖譜可知，雙氯芬酸的色譜峰分離效果良好，空白血清及其他雜質(zhì)對(duì)其無(wú)影響，保留時(shí)間為7.1 min左右(圖1～圖3)。

圖1　雙氯芬酸(0.05 μg/mL)對(duì)照品色譜圖Fig.1　HPLC chromatograms of diclofenac standard at 0.05 μg/mL

圖2　空白血漿色譜圖Fig.2　HPLC chromatograms of blank plasma

圖3　空白血漿添加雙氯芬酸標(biāo)準(zhǔn)品(0.05 μg/mL)色譜圖Fig.3　HPLC chromatograms of spiked diclofanac standard in plasma at the level of 0.05 μg/mL

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)、檢測(cè)限及定量限

空白血漿添加濃度在0.025 μg/mL～20.0 μg/mL范圍內(nèi)，線(xiàn)性關(guān)系良好(R2=1)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為y=50.896x+0.322 2(圖4)。雙氯芬酸在豬血漿中的最低檢測(cè)限為0.025 μg/mL，最低定量限為0.05 μg/mL。

2.3準(zhǔn)確度和精密度

豬血漿中雙氯芬酸測(cè)定方法回收率測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，豬空白血漿添加樣品在0.05 μg/mL～20 μg/mL時(shí)，回收率大于85%。豬血漿中雙氯芬酸測(cè)定方法精密度測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn)，豬空白血漿添加樣品在0.05 μg/mL～20 μg/mL時(shí)，日間變異系數(shù)和日內(nèi)變異系數(shù)分別小于4%和6%。

圖4　雙氯芬酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖Fig.4　Standard working curve of diclofenac表1　血漿中空白添加雙氯芬酸相對(duì)回收率Table 1　The recovery of spiked diclofenac in plasma

添加濃度/(μg·mL-1)Addedconcentration檢出的加標(biāo)濃度回收率a/%Recovery標(biāo)準(zhǔn)差SD平行數(shù)n變異系數(shù)/%RSD0.0585.102.8953.40596.550.5150.532093.753.0153.21

注：a表示基于檢出的平均濃度進(jìn)行計(jì)算。

Note：a means the calculation based on detected average concentration.

表2　血漿樣品精密度測(cè)定

注：n為樣本數(shù)；a表示基于檢出的平均濃度進(jìn)行計(jì)算。

Note：n is the number of samples;a means the calculation based on detected average concentration.

2.4豬血漿中雙氯芬酸測(cè)定方法的穩(wěn)定性

2.4.1室溫放置下的穩(wěn)定性對(duì)于豬血漿中的雙氯芬酸而言，放置室溫條件(約22℃)可保持穩(wěn)定達(dá)2 h(表3)。

2.4.2反復(fù)凍融下的穩(wěn)定性對(duì)于豬血漿中的雙氯芬酸而言，在3個(gè)循環(huán)凍融后仍可保持較好的穩(wěn)定(表4)。

2.4.3樣品存儲(chǔ)期間的穩(wěn)定性對(duì)于豬血漿中的雙氯芬酸而言，于-20℃條件下凍存時(shí)能夠保持穩(wěn)定1個(gè)月(表5)。

表3　室溫放置2 h后豬血漿中雙氯芬酸測(cè)定的穩(wěn)定性

注：a表示基于檢出的平均濃度進(jìn)行計(jì)算。

Note：a means the calculation based on detected average concentration.

表4　3個(gè)凍融循環(huán)后豬血漿中雙氯芬酸測(cè)定的穩(wěn)定性

注：a表示基于檢出的平均濃度進(jìn)行計(jì)算。

Note：a means the calculation based on detected average concentration.

表5　-20℃條件下凍存后血漿中雙氯芬酸測(cè)定的穩(wěn)定性

注： a表示基于檢出的平均濃度進(jìn)行計(jì)算。

Note: a means the calculation based on detected average concentration.

3　討論

在流動(dòng)相的選擇方面，文獻(xiàn)報(bào)道以乙腈-磷酸緩沖液[7]或甲醇-水[8]作為流動(dòng)相均不能獲得理想的分離效果，故本研究選擇甲醇和15 g/L乙酸水溶液作為流動(dòng)相，且以甲醇為主要流動(dòng)相,具有毒性低、成本低，每次試驗(yàn)后色譜系統(tǒng)沖洗時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)[7]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)提高甲醇在流動(dòng)相中的比例，可以極大程度地減少雙氯芬酸的保留時(shí)間，當(dāng)甲醇在流動(dòng)相中的比例達(dá)到80%時(shí)，雙氯芬酸在7.1 min左右出峰，儀器的分析周期為10 min，節(jié)約了樣品的分析時(shí)間，適合大量樣本分析的需要。鐘劍珊等[9]通過(guò)對(duì)雙氯芬酸對(duì)照品進(jìn)行紫外測(cè)定，發(fā)現(xiàn)其在276 nm處有最大吸收，因此，本研究亦選擇276 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。雙氯芬酸在本試驗(yàn)確定的色譜條件下具有較好的保留特性和分離度，提示本方法具有良好的特異性。

雙氯芬酸為弱酸性藥物(pH7.68，pKa4)，在提取過(guò)程中，先用1 mol/L HCL酸化血漿，有利于雙氯芬酸的萃取[10]。本研究對(duì)比考察了文獻(xiàn)報(bào)道中提取率較高的3種樣品前處理方法，即在酸化血漿的前提下，分別用乙腈[11]、乙腈-乙酸乙酯-異丙醇[12]、正己烷-異丙醇[13-14]處理血漿樣品。結(jié)果表明，正己烷-異丙醇作為提取溶劑干擾峰相對(duì)較少，靈敏度高，基線(xiàn)噪音小，對(duì)血漿中的雙氯芬酸的回收率滿(mǎn)足本試驗(yàn)需求，且以正己烷-異丙醇混合溶液為萃取劑，在45℃水浴條件下很快揮干，亦減少了樣品處理時(shí)間；同時(shí)正己烷-異丙醇可以克服部分血漿樣品中有溶血現(xiàn)象的問(wèn)題，萃取液澄清透明、無(wú)絮狀沉淀物，保證了樣品分析的準(zhǔn)確性。本試驗(yàn)樣品處理方法相對(duì)簡(jiǎn)單，快捷，回收率高，重復(fù)性好。

從準(zhǔn)確度、精密度和穩(wěn)定性試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果可以看出，試驗(yàn)誤差相對(duì)較小，采用外標(biāo)法可滿(mǎn)足本試驗(yàn)需求。本研究建立的雙氯芬酸血漿濃度測(cè)定方法，具有操作簡(jiǎn)便、專(zhuān)屬性強(qiáng)、靈敏度高等特點(diǎn)，可滿(mǎn)足豬體內(nèi)藥物濃度測(cè)定，適用于雙氯芬酸鈉藥物代謝動(dòng)力學(xué)和生物利用度的研究。

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Determination of Diclofenac in Pig Plasma with HPLC

LI Yu-chen,CHEN Hong-yu,WU Tian-xing,LU Xiao-song,HAN Xiao-xin,LIU Fang,WANG Dong-liang,LI Long-fei,BU Shi-jin

(Veterinary Medicine College,Yangzhou Univercity/Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and ControlofImportantAnimalInfectiousDiseasesandZoonoses,Yangzhou,Jiangsu，225009,China)

In order to establish a HPLC method for the determination of plasma concentrations of diclofenac in piglets,hexane-isopropanol solution (90∶10,V/V) was used for extracting diclofenac of plasma.The plasma concentrations of diclofenac were measured by HPLC UV-Detector.The chromatography was carried on a C18column,the mobile phase was composed of methanol-15 g/L acetic acid (20∶80, V/V),the detection wavelength was set at 276 nm for diclofenac,and analysis based on the external standard method.Under the condition of this test,diclofenac in plasma was well separated,and no interference from plasma matrix was observed.The linear ranges for diclofenac were 0.025 μg/mL-20.0 μg/mL(R2=1),the lowest limit of quantitation was 0.05 μg/mL,and the ingredients showed good relationships between the peak area and the concentration.The inter-day and intra-day RSD was less than 4% and 6%.The recovery was between 85% and 97%.The method could be used for the determination the diclofenac levels of piglets,and applied to study on the pharmacokinetics and bioavailability researches of the preparation containing diclofenac sodium.

HPLC;diclofenac;plasma drug concentration;piglet

2016-02-22

江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目(PAPD)；江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(SJLX15-0675)；揚(yáng)州大學(xué)“新世紀(jì)人才工程”資助項(xiàng)目

李宇琛(1990-)，男，內(nèi)蒙古包頭人，碩士研究生，主要從事獸醫(yī)臨床藥理學(xué)研究?！魍蓉暙I(xiàn)作者。*通訊作者

S859.7

A

1007-5038(2016)09-0058-05