犬細(xì)小病毒單克隆抗體的制備及其在膠體金免疫層析試紙研發(fā)中的應(yīng)用

馬　輝,權(quán)國(guó)輝,喬宏興,鄭　鳴,趙緒永,王永芬*,邊傳周

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院生物工程學(xué)院,河南鄭州 450011；2.鄭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院材料工程系,河南鄭州 450121)

?

犬細(xì)小病毒單克隆抗體的制備及其在膠體金免疫層析試紙研發(fā)中的應(yīng)用

馬輝1,權(quán)國(guó)輝2,喬宏興1,鄭鳴1,趙緒永1,王永芬1*,邊傳周1

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院生物工程學(xué)院,河南鄭州 450011；2.鄭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院材料工程系,河南鄭州 450121)

為制備犬細(xì)小病毒膠體金免疫層析試紙，將F81細(xì)胞中分離的CPV免疫Balb/c小鼠，取其脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，建立間接ELISA方法篩選分泌CPV單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，獲得1株能穩(wěn)定分泌CPV單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為3E2。3E2的亞類(lèi)為IgG1型，腹水抗體效價(jià)為1.8×105，交叉試驗(yàn)表明,3E2可與CPV特異性結(jié)合，與其他犬常見(jiàn)病毒無(wú)交叉反應(yīng)。用3E2單克隆抗體制備的檢測(cè)CPV的膠體金免疫層析試紙條特異性良好，為診斷和研究CPV奠定了基礎(chǔ)。

犬細(xì)小病毒；病毒分離；單克隆抗體；膠體金免疫層析試紙

犬細(xì)小病毒病是由犬細(xì)小病毒(Canine parvovirus,CPV)所引起的傳染性疾病，可通過(guò)直接或間接接觸傳播，以劇烈的嘔吐、腹瀉和白細(xì)胞減少為主要特點(diǎn)，可引起犬急性心肌炎。犬細(xì)小病毒傳播性強(qiáng)，發(fā)病率和病死率較高，且可感染狐、貉、狼等動(dòng)物，對(duì)養(yǎng)犬業(yè)和皮毛動(dòng)物等經(jīng)濟(jì)動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)可造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[1]。1977年，美國(guó)科學(xué)家最先從患腸炎的犬糞便中分離出CPV。1983年，徐漢坤等首次報(bào)道了犬細(xì)小病毒病在我國(guó)的出現(xiàn)。

CPV在分類(lèi)上屬細(xì)小病毒科，病毒呈圓形或六邊形，無(wú)囊膜，直徑約25 nm。病毒顆粒具有球型的衣殼,衣殼內(nèi)包含單鏈線(xiàn)狀DNA，在DNA兩端各有一個(gè)發(fā)夾樣的回文結(jié)構(gòu)，DNA量占整個(gè)病毒粒子重量的25%～34%。CPV基因主要編碼結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2、VP3和非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、NS2。VP1和VP2構(gòu)成病毒的衣殼，其中VP2是主要結(jié)構(gòu)成分和免疫原性蛋白，能夠促使機(jī)體產(chǎn)生中和抗體[2]。VP1和VP2蛋白對(duì)病毒與宿主細(xì)胞之間的識(shí)別起重要作用，刪除VP1或VP2蛋白的突變體均失去了對(duì)宿主細(xì)胞的感染能力。近年來(lái)，CPV非結(jié)構(gòu)蛋白NS1被認(rèn)為在病毒的致病性和細(xì)胞毒方面起主要作用，并在體外可引起腫瘤細(xì)胞凋亡[3-5]。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)犬細(xì)小病毒的診斷主要通過(guò)臨床癥狀診斷、血常規(guī)檢查和試紙快速診斷等，前兩者存在著依賴(lài)臨床經(jīng)驗(yàn)、特異性低等缺點(diǎn)，難以達(dá)到對(duì)犬細(xì)小病毒病快速診斷的要求；而快速診斷試紙條主要被國(guó)外產(chǎn)品所壟斷[6]。本研究用F81細(xì)胞分離的CPV制備獲得了單克隆抗體，并用單克隆抗體，初步制備了CPV的膠體金層析快速檢測(cè)試紙條。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、細(xì)胞株及毒株貓腎細(xì)胞系細(xì)胞(F81)，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；犬細(xì)小病毒病料，河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)院提供；SP2/0多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞，河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院生物工程學(xué)院生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保存； Balb/c小鼠和日本長(zhǎng)耳大白兔，購(gòu)自河南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；含有CPV VP2基因的重組質(zhì)粒pGEX-6p-1-VP2,河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院生物工程學(xué)院生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存；犬瘟熱病毒(CDV)、犬冠狀病毒(CCV)和犬腺狀病毒(CAV),河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院生物工程學(xué)院生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室鑒定并保存。

1.1.2主要試劑與藥品dNTP、DNA提取試劑盒、瓊脂糖、DNA Marker DL 2 000 和蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等,寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；DMEM、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、50倍HAT貯存液，GIBCO公司產(chǎn)品；胎牛血清，Hyclone公司產(chǎn)品；HRP-羊抗鼠IgG、HRP-羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG抗體、PEG 4000、DMSO、BSA及氯金酸，Sigma公司產(chǎn)品；硝酸纖維素膜(NC膜)，Millipore公司產(chǎn)品；樣品墊和PVC底板，上海金標(biāo)生物科技有限公司產(chǎn)品；SBA Clonotyping System/HRP抗體亞類(lèi)鑒定試劑盒，Southern Biotechnology公司產(chǎn)品；引物合成和序列測(cè)定由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成；CPV多抗IgG由河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院生物工程學(xué)院生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室制備；犬細(xì)小病毒陰性血清由河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)院提供；其他常規(guī)用試劑為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2方法

1.2.1病毒的鑒定樣品由河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)院提供。采集出現(xiàn)血便、高熱等疑似CPV感染的犬糞便，加入適量磷酸鹽緩沖液，5 000 r/min離心10 min，收獲上清液。按常規(guī)DNA提取方法提取DNA，置于-20℃保存?zhèn)溆?。參照CPV基因序列(基因登錄號(hào): M19296.1)，設(shè)計(jì)引物序列為：上游引物P1：5′-AATCACAGCAAACTCAAGCAGAC-3′；下游引物P2：5′-TAGCAAATTCATCACCTGTTCTTAG-3′。以提取的DNA樣品為模板，使用Taq酶擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：94℃ 5 min;94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 60 s，共30個(gè)循環(huán);最后72℃ 10 min。取PCR反應(yīng)產(chǎn)物5 μL用 10 g/L瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果[7]。

1.2.2病毒的分離和抗原的制備將采集的病料加入含1 000單位/mL 青霉素和鏈霉素的DMEM細(xì)胞維持液(含20 mL/L胎牛血清)制成1∶9的懸液，混勻后5 000 r/min離心20 min，取上清，用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，置-20℃保存?zhèn)溆谩螌拥腇81細(xì)胞用胰蛋白酶消化，按1∶2傳代，按體積10%的病料上清同步接種F81細(xì)胞，置37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，設(shè)立陰性對(duì)照，同時(shí)逐日觀察細(xì)胞病變并進(jìn)行盲傳[8-9]。

待細(xì)胞病變達(dá)到80%以上時(shí)，反復(fù)凍融3次，10 000 r/min 4℃離心30 min，收獲上清，加入PEG 6000濃縮，經(jīng)過(guò)Sepharose 4FF凝膠柱層析，收集洗脫峰即為CPV抗原，紫外分光法檢測(cè)CPV濃度，保存于-80℃。

1.2.4小鼠的免疫將純化的CPV抗原加等體積弗氏完全佐劑初次免疫6周齡Balb/c小鼠，每隔2周分別再注射2次以加強(qiáng)免疫。細(xì)胞融合前3 d再加強(qiáng)免疫1次注射抗原。

1.2.5雜交瘤細(xì)胞的篩選和McAb腹水制備按常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合，使用建立的間接ELISA方法篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，有限稀釋法進(jìn)行克隆化培養(yǎng)，選擇能夠穩(wěn)定分泌、效價(jià)較高的單個(gè)克隆進(jìn)行培養(yǎng)。按常規(guī)方法制備腹水，并采用辛酸-硫酸銨鹽析法和親和層析法純化腹水中的McAb[12]。

1.2.6McAb亞型鑒定及染色體計(jì)數(shù)①采用SBA Clonotyping System/HRP抗體亞類(lèi)鑒定試劑盒測(cè)定制備的CPV McAb的Ig亞類(lèi)。②選擇生長(zhǎng)良好的雜交瘤細(xì)胞，用秋水仙素阻斷法進(jìn)行染色體核型分析，在顯微鏡下選擇染色體分散良好的細(xì)胞觀察計(jì)數(shù)。

1.2.7McAb的特異性分析將犬細(xì)小病毒(CPV)、犬瘟熱病毒(CPV)、犬冠狀病毒(CPV)和犬腺病毒Ⅱ型(CAV)作為包被抗原進(jìn)行間接ELISA，檢測(cè)該單克隆抗體的特異性。

1.2.8膠體金抗體的制備將 200 mL 0.1 g/L氯金酸溶液，攪拌加熱至沸騰，迅速加入2 mL 10 g/L檸檬酸三鈉溶液，溶液顏色從淺黃逐漸變黑，然后變紅，繼續(xù)煮沸10 min，溶液冷卻后微孔濾膜過(guò)濾，4℃下保存?zhèn)溆?。將制備的膠體金，調(diào)整pH至8.0后加純化后的3E2單抗攪拌，室溫靜止5 min，經(jīng)低溫高速離心法純化獲得膠體金抗體[13]。

1.2.9免疫試紙條的制備和初步鑒定在玻璃纖維上噴涂膠體金抗體。取蛋白濃度為1.5 mg/mL 的CPV多抗IgG標(biāo)記在硝酸纖維素膜上，設(shè)為檢測(cè)線(xiàn)；取蛋白濃度為1.0 mg/mL 的羊抗鼠IgG抗體噴在離檢測(cè)線(xiàn)5 mm處，即為質(zhì)控線(xiàn)；將噴有檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)的硝酸纖維素膜與樣品墊、膠體金墊、NC膜、吸水紙組裝成試紙條。取PCR和ELISA鑒定的犬細(xì)小病毒(CPV)、犬瘟熱病毒(CDV)、犬冠狀病毒(CCV)和犬腺病毒Ⅱ型(CAV)，用制備的膠體金試紙條進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證其特異性。

2　結(jié)果

2.1PCR鑒定

通過(guò)PCR擴(kuò)增，得到608 bp左右的預(yù)期大小目的片段，經(jīng)測(cè)序與預(yù)期序列一致，證明樣品中含有CPV(圖1)。

2.2病毒的分離

從第3代開(kāi)始一般會(huì)出現(xiàn)規(guī)律性細(xì)胞病變，接種病料上清液后約24 h～36 h，細(xì)胞出現(xiàn)彌散性顆粒，胞漿收縮，細(xì)胞變圓；約48 h病變細(xì)胞開(kāi)始逐漸拉網(wǎng)、崩解、脫落；約72 h～96 h，細(xì)胞病變達(dá)80%以上時(shí)，收毒，置-80℃保存?zhèn)溆?圖2)。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.陰性對(duì)照;2.目的片段;3.陰性對(duì)照

M.DNA Marker DL 2 000;1.Negative control;2.PCR products of CPV;3.Negative control

圖1CPV PCR檢測(cè)結(jié)果

Fig.1Detection of CPV by PCR

2.3間接ELISA方法建立

采用方陣滴定確定抗原的最佳包被濃度和陽(yáng)性血清最佳稀釋度，陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)為OD待檢血清>0.4,且OD待檢血清/OD標(biāo)準(zhǔn)陰性值≥2.1，當(dāng)抗原的稀釋濃度為1∶160，血清的稀釋度為1∶80，陰性與陽(yáng)性血清的OD 450 nm值相差最大(P/N=9.253)。建立了篩選犬細(xì)小病毒 McAb的間接ELISA方法(表1)。

2.4雜交瘤細(xì)胞株的篩選

經(jīng)脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0細(xì)胞融合并篩選，獲得1株能高效分泌抗CPV單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為3E2。間接ELISA檢測(cè)，3E2腹水效價(jià)為1∶1.8×105。

2.5McAb的Ig亞類(lèi)鑒定

檢測(cè)抗體的Ig亞類(lèi)，結(jié)果表明，3E2亞類(lèi)為IgG1型。

A.F81細(xì)胞;B.病變F81細(xì)胞

A.F81 cells;B.CPE of F81 cells

圖2　CPV病毒的分離

2.6雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)目

Balb/c小鼠脾細(xì)胞的染色體為40條，SP2/0骨髓瘤細(xì)胞的染色體為62條。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，該細(xì)胞株染色體數(shù)介于90條～100條，大約為小鼠脾細(xì)胞和SP2/0骨髓瘤細(xì)胞染色體數(shù)目之和，說(shuō)明為兩者融合產(chǎn)生(圖3)。

2.7McAb的特異性檢測(cè)

將3E2分別與犬細(xì)小病毒(CPV)、犬瘟熱病毒(CDV)、犬冠狀病毒(CCV)和犬腺病毒Ⅱ型(CAV)包被的ELISA板進(jìn)行交叉反應(yīng)試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn),3E2與CPV可發(fā)生陽(yáng)性反應(yīng)，與CDV、CCV和CAV不發(fā)生反應(yīng)，表明制備的McAb與其他犬常見(jiàn)病毒沒(méi)有交叉反應(yīng)，制備的3E2單克隆抗體有良好的特異性(表2)。

2.8膠體金溶液的制備

制成的膠體金溶液日光下肉眼觀察透明清亮、顏色為酒紅色、無(wú)沉淀。經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其最大吸收波長(zhǎng)為525 nm。

圖3　雜交瘤細(xì)胞的染色體分析Fig.3　Analysis of chromosones of hybridoma cells

2.9膠體金免疫層析試紙的特異性

特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示犬瘟熱病毒(CDV)、犬冠狀病毒(CCV)和犬腺病毒Ⅱ型(CAV)在膠體金免疫層析試紙檢測(cè)線(xiàn)上均無(wú)條帶，為陰性。犬細(xì)小病毒(CPV)在檢測(cè)線(xiàn)上均出現(xiàn)特異性條帶，為陽(yáng)性(圖4)。

表2　McAb交叉反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果

1.犬細(xì)小病毒;2.犬瘟熱病毒;3.犬冠狀病毒;4.犬腺病毒Ⅱ型;5.陰性對(duì)照

1.CPV;2.CDV;3.CCV;4.CAV;5.Negative control

圖4膠體金試紙條特異性檢測(cè)

Fig.4Specificity test of colloidal gold test strip detection

3　討論

犬細(xì)小病毒病傳播性強(qiáng)，發(fā)病率和病死率較高，且一年四季都有發(fā)生，絕大多數(shù)年齡、品種的犬類(lèi)都可被傳染，但幼犬和純種犬更易被感染，病死率也高[14-15]。細(xì)小病毒感染犬類(lèi)后，一旦發(fā)病治愈率特別低，沒(méi)有特效藥，早期確定犬細(xì)小病毒病并予以抗病毒、消炎、補(bǔ)液和止嘔等治療，可以提高療效和存活率，因此，對(duì)CPV的早期檢測(cè)就非常關(guān)鍵[16-19]。膠體金免疫層析試紙檢測(cè)方法只需將待測(cè)溶液加入試紙條中，靜止后一段時(shí)間觀察結(jié)果，不需要儀器設(shè)備來(lái)讀取結(jié)果，不需要操作者有專(zhuān)業(yè)技能，能減少很大檢測(cè)工作量和節(jié)省大量檢測(cè)費(fèi)用，敏感性高，特異性好[20]。但目前我國(guó)市場(chǎng)上部分CPV試紙條主要以國(guó)外進(jìn)口為主，價(jià)格較為昂貴，市場(chǎng)較為廣闊。

我們以分離得到并純化的CPV為抗原，多次腹腔注射免疫小鼠獲得了能夠分泌抗CPV McAb的脾細(xì)胞，ELISA試驗(yàn)結(jié)果表明該雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的McAb只與CPV發(fā)生特異性反應(yīng)，與CDV、CCV和CAV無(wú)明顯的交叉反應(yīng)，表明制備的3E2單克隆抗體有良好的特異性。另外，經(jīng)間接ELISA檢測(cè)，3E2腹水效價(jià)為1∶1.8×105。

本試驗(yàn)確定了標(biāo)記的最佳條件，設(shè)定3E2為金標(biāo)抗體、取蛋白濃度為1.5 mg/mL 的CPV多抗IgG標(biāo)記為檢測(cè)線(xiàn)，蛋白濃度為1.0 mg/mL的兔抗鼠IgG高免血清標(biāo)記為質(zhì)控線(xiàn)，初步建立了膠體金免疫層析方法。本試驗(yàn)建立的診斷方法特異性強(qiáng)，與其他3種犬常見(jiàn)病毒抗原無(wú)交叉反應(yīng)，具有較好的重復(fù)性，與ELISA方法結(jié)果一致，可用于CPV的快速檢測(cè)。下一步我們將在反應(yīng)條件、穩(wěn)定性及工藝上進(jìn)一步改進(jìn)，以期進(jìn)一步提高檢測(cè)靈敏度。

本研究分離并純化了CPV，經(jīng)免疫Balb/c小鼠后，通過(guò)雜交瘤技術(shù)獲得了1株高親和力和高特異性的雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)鑒定制備出的McAb效價(jià)高、特異性強(qiáng)。并在此基礎(chǔ)上研發(fā)了膠體金免疫層析檢測(cè)試紙條，快捷準(zhǔn)確，在臨床上具有很好的應(yīng)用前景，有一定的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，并為犬細(xì)小病毒的深入研究奠定了基礎(chǔ)。

[1] 趙建軍,閆喜軍,吳威.犬細(xì)小病毒:從起源到進(jìn)化[J].微生物學(xué)報(bào),2011,51(7): 869-875.

[2]Decaro N,Buonavoglia C.Canine parvovirus-a review of epidemiological and diagnostic aspects, with emphasis on type 2c [J].Vet Microbiol,2012,155(1):1-12.

[3]Santra L,Rajmani R S,Ravi Kumar G V,et al.Non-structural protein 1 (NS-1) gene of canine parvovirus-2 regresses chemically induced skin tumors in Wistar rats [J].Res Vet Sci,2014,97(2):292-296.

[4]Gupta S K,Sahoo A P,Rosh N,etal.Canine parvovirus NS1 induced apoptosis involves mitochondria,accumulation of reactive oxygen species and activation of caspases [J].Virus Res,2016,213(2):46-61.

[5]Gupta S K,Yadav P K,Gandham R K,et al.Canine parvovirus NS1 protein exhibits anti-tumor activity in a mouse mammary tumor model [J].Virus Res,2016, 213(2):289-298.

[6]Wang J,Liu L,Li R,et al.Rapid and sensitive detection of canine parvovirus type 2 by recombinase polymerase amplification [J].Arch Virol,2016,213(2):289-298.

[7]J薩姆布魯克，D W拉塞爾.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M]．3版.黃培堂,等,譯.北京:科學(xué)出版社,2002．

[8]周云朵,康真玉,陳月平,等.犬細(xì)小病毒的分離鑒定與生物學(xué)特性分析[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2011,42(10):1402-1408.

[9]孟凡進(jìn),于志海,邱昌偉,等.犬細(xì)小病毒地方株的分離與生物學(xué)特性分析[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2014,35(9):15-19.

[10]馬輝, 趙緒永.犬細(xì)小病毒VP2主要抗原表位區(qū)的原核表達(dá)載體構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá)[J].鄭州牧業(yè)工程高等專(zhuān)科學(xué)校學(xué)報(bào),2012,32(2):9-11.

[11]汪家政,范明．蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)[M].北京：科學(xué)出版社,2000．

[12]Coligan J E.Current protocol in immunology[M].New York:Associates,2003.

[13]錢(qián)紅,石峰,陳創(chuàng)夫,等.伯氏疏螺旋體外膜蛋白OspA膠體金免疫層析法快速檢測(cè)技術(shù)的建立[J] .中國(guó)病原生物學(xué)雜志,2014,9(12):1075-1083.

[14]Zhong Z,Liang L,Zhao J,et al.First isolation of new canine parvovirus 2a from Tibetan mastiff and global analysis of the full-length VP2 gene of canine parvoviruses 2 in China [J].Int J Mol Sci,2014,15(7):12166-12187.

[15]張仁舟,楊松濤,馮昊,等.中國(guó)國(guó)內(nèi)首次檢測(cè)到犬細(xì)小病毒CPV-2c[J].中國(guó)病原生物學(xué)雜志,2010,5(4):246-249.

[16]Sun Y L,Yen C H,Tu C F.Visual detection of canine parvovirus based on loop-mediated isothermal amplification combined with enzyme-linked immunosorbent assay and with lateral flow dipstick [J].J Vet Med Sci,2014,76(4):509-516.

[17]Zhang C,Yu Y,Yang H,et al.Development of a PCR-RFLP assay for the detection and differentiation of canine parvovirus and mink enteritis virus[J].J Virol Meth,2014,210C:1-6.

[18]劉俊瑋,劉娟,杜林林,等.復(fù)方參芩對(duì)犬細(xì)小病毒致心肌組織Bcl-2和Bax mRNA的影響[J] .畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2013,44(1):122-128.

[19]Mila H,Grellet A,Desario C,et al.Protection against canine parvovirus type 2 infection in puppies by colostrum-derived antibodies [J].J Nutr Sci,2014,3(11):1-4.

[20]樊淑華,王永立.膠體金免疫層析技術(shù)應(yīng)用研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2014，35(10):99-103.

Development of Monoclonal Antibody and Colloidal Gold Immunochromatographic Assay for Detecting CPV

MA Hui1,QUAN Guo-hui2,QIAO Hong-xing1,ZHENG Ming1,ZHAO Xu-yong1,WANG Yong-fen1,BIAN Chuan-zhou1

(1.College of Biotechnology,Henan University of Animal Husabandry and Economy,Zhengzhou,Henan,450046,China;2.DepartmentofMaterialsScienceandEngineering,ZhengzhouTechnicalCollege,Zhengzhou,Henan,450121,China)

The canine arvovirus (CPV) isolated from dog feces was cultured and purified.SP2/0 myeloma cells SP2/0 were fused with spleen cells from CPV immunized Balb/c mice.Positive cells producing antibodies were screened by indirect ELISA,and a monoclonal antibody against CPV was generated and designated as 3E2.The monoclonal antibody belongs to IgG1.The titer of ascites was 1.8×105as detected by ELISA.No cross-reactions were observed between the McAb prepared and other canine viruses and the McAb could recognize CPV.Based on the McAb,the GICA was established by purified and gold labeled McAb 3E2.It could detect the CPV specifically.Therefore,the results indicated that the method had high specificity.It could serve as effective detection measure for clinic and further research of CPV.

CPV;virus isolation;monoclonal antibody;colloidal gold immune chromatography

2016-03-01

鄭州市科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(121PPTGG463)；河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目(142102310034)；河南省高等學(xué)?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(HUAHE2015001)

馬輝(1980-)，男，河南許昌人，講師，博士，從事動(dòng)物病原生物學(xué)研究。*通訊作者

S854.43;S852.659.2

A

1007-5038(2016)09-0026-05