諾如病毒鎮(zhèn)江株全基因組序列測定與分析

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諾如病毒鎮(zhèn)江株全基因組序列測定與分析

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諾如病毒有高度變異性，序列分析對監(jiān)測病毒變異具有重要意義，而其全基因組序列依然有限，有鑒于此，本研究采用病毒宏基因組方法對鎮(zhèn)江一株諾如病毒進行了全基因組克隆與分析。結(jié)果顯示，除去5’非編碼區(qū)和3’poly（A）結(jié)構(gòu)，NOV/CHN/ZJ01毒株全長7 509 bp，含有3個開放式閱讀框（ORFs）。序列分析顯示，本毒株與一株日本人諾如毒株（AB972502）同源性最高，為99%?；谕鈿さ鞍缀蚏dRp核酸序列進化分析表明，NOV/CHN/ZJ01毒株與日本毒株AB972502同屬GII-4，然而，他們與其他毒株在GII-4里形成3個不同的Cluster。這表明，本毒株與這株日本毒株具有相同的進化起源。應加大對諾如病毒的監(jiān)測力度，避免新的流行。

諾如病毒；病毒宏基因組；全基因組

諾如病毒（Norovirus，NoVs）屬杯狀病毒科［1］，無包膜病毒?；蚪M為單股正鏈RNA，全長約7.7 kb，由3個開放閱讀框（open reading Frames，ORFs）組成，并在3'端含有一個多聚A結(jié)構(gòu)［2］。ORF1編碼一個大的多聚蛋白，經(jīng)蛋白酶水解后生成成熟的非結(jié)構(gòu)蛋白，其中包括RNA 聚合酶（RNA dependent RNA polymerase，RdRp），ORF2編碼主要的外殼蛋白VP1，和ORF3編碼小的外殼蛋白VP2［3］。VP1上有兩個主要區(qū)，外環(huán)區(qū)（shell domain，S區(qū)）和突起臂區(qū)（protruding arm，P區(qū)）［4］。

諾如病毒基因組高度變異，根據(jù)其RdRp和衣殼蛋白核苷酸序列差異，被分為5個基因群（Genogroup，GI-V）和至少45個基因型（Genogroup）［5］。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)23株毒株的RdRp和衣殼蛋白基因分屬于不同基因型，并且確定重組的斷點（Breakpiont）一般位于ORF1/ORF2重疊區(qū)［3］。GII.4毒株有較高的突變效率［6］。此文對鎮(zhèn)江地區(qū)一株諾如病毒全基因組（NVCHN/ZJ01）分析序列并與GII2.4群流行株進行對比研究。

1 材料與方法

本研究的3例糞便標本于2015年7～10月采自江蘇大學附屬醫(yī)院門診，患者為71～85歲老年男性急性腸胃炎患者。采用病毒宏基因組方法分析樣本中病毒組成。文庫構(gòu)建操作按照Nextera XT DNA Sample Preparation Kit說明書進行（Illumina）。深度測序由Illumina Miseq測序平臺進行。生物信息學分析參見Zhang等［7］。

序列拼接采用Geneious（4.8.2）軟件。將拼接序列應用BLAST軟件在GenBank同源性比對；應用Clustal X軟件（1.8）進行序列的多重比對和分析；應用MEGA 6軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。用于系統(tǒng)進化分析的諾如參考株來自于GenBank數(shù)據(jù)庫。

2 結(jié)果與分析

3份糞便樣本中有1份諾如病毒陽性。經(jīng)病毒宏基因組測序與拼接后，除去5’非編碼區(qū)和3’poly（A）結(jié)構(gòu)，NOV/ CHN/ZJ01毒株全長7 509 bp，含有3個開放式閱讀框（ORFs）（表1）。ORF1長5 100 bp，ORF2為1 623 bp，而ORF3為807 bp。基于全基因組的序列分析顯示，本毒株與一株日本人諾如毒株（AB972502）同源性最高，為99%。與其在ORF1、ORF2和ORF3序列上同源性最高的毒株分別是日本毒株AB972502、香港毒株KM268106和北京毒株KJ716363，同源性均為99%。上述3個毒株均為GII.4毒株。

表1 本研究NoV及參考毒株的基因組結(jié)果

圖1 基于外殼蛋白（B）核酸序列構(gòu)建的進化分析結(jié)果

基于外殼蛋白全序列的系統(tǒng)進化結(jié)果顯示，NOV/CHN/ ZJ01毒株與日本毒株AB972502聚在一起，核酸同源性為99%（圖1）。NOV/CHN/ZJ01毒株與日本毒株AB972502同為GII-4，然而，他們與其他毒株在GII-4里形成3個不同的Cluster?；赗dRp 區(qū)C-末端260個氨基酸的進化分析表明，NOV/CHN/ZJ01毒株在進化分類與外殼蛋白的進化分析相同（圖2），與AB972502毒株聚在一起同為GII-4下的一個分支，這也表明本毒株不是重組毒株。

諾如病毒高度變異，GII-4群毒株是流行的優(yōu)勢株［8］。本研究發(fā)現(xiàn)的鎮(zhèn)江毒株在系統(tǒng)進化上也屬于GII-4?；谌蛄械耐葱苑治鲲@示，本毒株與一株日本毒株同源性最高，達99%，這表明這兩個毒株具有相同的進化起源［7］。提示，衛(wèi)生防疫部門應該加大對諾如病毒的監(jiān)測力度，防范諾如病毒新的流行毒株的出現(xiàn)。

圖2 基于RNA依賴的RNA聚合酶（核酸序列構(gòu)建的進化分析結(jié)果）

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The Genomic Sequence Analysis of Human Norovirus Strain in Zhenjiang

HOU Li1ZHAI Wei1FU Xingli2GAO Fang1SHEN Quan2PENG Ying3RUI Zhilian31 Department of Geriatrics，Affiliated Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212000，China，2 School of Medicine in Jiangsu Univerisity，Zhenjiang Jiangsu 212000，China，3 Clinical Laboratory，People's Hospital of Liyang，Liyang Jiangsu 213300，China

【Abstract】

Noroviruses（NoV）is highly variable，sequence analysis has an important significance to the monitoring of viral variation，and the whole genome is still limited. In view of this this study using viral metagenomic methods of zhenjiang strain noroviruses were genome cloning and analysis. In the present study，the full-length genomes of human NoV from zhenjiang was determined and the genomic organization was analyzed by metagenomic method. This strain is 7 509 bp in length and had similar genome organization and contained three predicted ORFs with other GII stains. Phylogenetic analysis showed that this strain was divided into GII-4 and clustered with a japanese strian. They shared 99% identity in full length. This results showed that this two strains had the same orgination.

Norovirus，Genome，Metagenomic

R446

A

1674-9316（2016）15-0150-03

10.3969/j.issn.1674-9316.2016.15.088

常州市社會發(fā)展項目（編號：CY20130026）

1 江蘇大學附屬醫(yī)院老年科，江蘇 鎮(zhèn)江 212000；2 江蘇大學醫(yī)學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212000；3 溧陽市人民醫(yī)院檢驗科，江蘇 溧陽 213300