Th17、Treg細(xì)胞頻數(shù)在核苷類似物抗HBV過程中的動(dòng)態(tài)變化

余永勤， 李　毅， 陳譚昇， 呂其軍， 周　芳

東營(yíng)市勝利油田中心醫(yī)院感染病科，東營(yíng)　257034

?

·論著·

Th17、Treg細(xì)胞頻數(shù)在核苷類似物抗HBV過程中的動(dòng)態(tài)變化

余永勤， 李毅， 陳譚昇， 呂其軍， 周芳

東營(yíng)市勝利油田中心醫(yī)院感染病科，東營(yíng)257034

目的： 探討輔助性T細(xì)胞17(T helper 17 cells, Th17)及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells, Treg)細(xì)胞頻數(shù)在核苷類似物治療慢性乙型肝炎患者過程中的動(dòng)態(tài)變化。方法： 選取30例乙型肝炎e抗原(hepatitis B e antigen, HBeAg) 陽(yáng)性的慢性乙型肝炎患者作為研究對(duì)象。所有患者均采用替比夫定治療。分析所有患者治療前及治療第4、8、12、24、36、48周的Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞頻數(shù)及Th17/Treg比值。比較治療前后患者血清總膽紅素(total bilirubin in serum,TBIL)、血清直接膽紅素(direct bilirubin in serum,DBIL)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine transaminase,ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspertate aminotransferase,AST)、乙型肝炎病毒DNA(hepatitis B virus DNA, HBV-DNA)、HBeAg水平，分析Treg、Th17細(xì)胞頻數(shù)與TBIL、DBIL、ALT、AST、HBV-DNA、HBeAg的相關(guān)性。結(jié)果： 替比夫定治療后，Treg細(xì)胞頻數(shù)先下降后上升，于治療第8周時(shí)達(dá)最低水平；Th17細(xì)胞頻數(shù)呈下降趨勢(shì)；Th17/Treg比值呈下降趨勢(shì)，于治療第24、36、48周時(shí)趨于穩(wěn)定。與治療前相比，治療后患者TBIL、DBIL、ALT、AST、HBV-DNA、HBeAg水平均顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Treg細(xì)胞頻數(shù)與HBV-DNA、HBeAg水平正相關(guān)(P<0.05)；Th17細(xì)胞頻數(shù)與TBIL、DBIL、ALT、AST水平正相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論： 核苷類似物治療慢性乙型肝炎患者過程中，Treg、Th17細(xì)胞頻數(shù)及Th17/Treg比值呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化，且與治療后肝功能指標(biāo)水平相關(guān)，為臨床治療及預(yù)后評(píng)估提供了依據(jù)。

慢性乙型肝炎；替比夫定；Th17細(xì)胞；Treg細(xì)胞

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)作為非侵襲性嗜肝病毒，其誘導(dǎo)的特異性免疫反應(yīng)對(duì)于控制HBV感染，消除HBV具有重要作用，且HBV誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生的一系列特異性免疫細(xì)胞、因子均參與肝臟的免疫過程[1-3]。對(duì)于乙型肝炎e抗原(hepatitis B e antigen, HBeAg) 陽(yáng)性慢性乙型肝炎患者，適當(dāng)?shù)拿庖叻磻?yīng)有利于病情的恢復(fù)及轉(zhuǎn)歸，而過度的免疫反應(yīng)是肝功能衰竭的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可進(jìn)一步惡化預(yù)后。

輔助性T細(xì)胞17(T helper 17 cells, Th17)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells, Treg)均作為介導(dǎo)核苷類似物抗HBV過程中的CD4+T細(xì)胞亞型，分別抑制及促進(jìn)免疫炎癥反應(yīng)[4-5]。Th17及Treg細(xì)胞頻數(shù)可能在核苷類似物抗HBV過程中存在不同程度的變化[5-6]，而Th17/Treg細(xì)胞免疫穩(wěn)態(tài)可作為HBeAg陽(yáng)性慢性乙型肝炎療效判斷及預(yù)后評(píng)估的潛在指標(biāo)。因此，本研究探討Th17及Treg細(xì)胞頻數(shù)在核苷類似物治療慢性乙型肝炎患者過程中的動(dòng)態(tài)變化，為后續(xù)研究提供參考。

1　資料與方法

1.1一般資料2013年5月-2015年5月，選取在我院治療的30例HBeAg陽(yáng)性慢性乙型肝炎患者作為研究對(duì)象。其中男性18例、女性12例；年齡24～51歲，平均(35.5±4.8)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)HBeAg陽(yáng)性慢性乙型肝炎初治患者；(2)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine transaminase,ALT)>2倍正常值上限；(3) HBV-DNA>105copies/mL。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他病毒性肝炎、重型肝炎、肝硬化、肝癌及腎功能不全者；(2)惡性腫瘤和妊娠者；(3)自身免疫性肝病、酒精性肝炎者。本研究通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核；所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2治療方法及觀察指標(biāo)所有患者均采用替比夫定治療，劑量600 mg/d，持續(xù)治療48周。在治療前和治療第4、8、12、24、36、48周時(shí)，采集外周靜脈血3 mL，分別用于檢測(cè)Treg、Th17細(xì)胞與血清總膽紅素(total bilirubin in serum，TBIL)、血清直接膽紅素(direct bilirubin in serum，DBIL)、ALT、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspertate aminotransferase,AST)、乙型肝炎病毒DNA(hepatitis B virus DNA，HBV-DNA)、HBeAg水平。1.3Treg細(xì)胞的檢測(cè)取100 μL 靜脈血，加入CD4和CD25單克隆抗體，各10 μL，混勻，避光放置20 min；加入2 mL紅細(xì)胞裂解液，混勻，避光放置20 min；加入2 mL破膜緩沖液，離心，棄上清；加入2.5 μL Foxp3抗體，避光放置2 h。加入1 mL 磷酸鹽緩沖液(PBS)，混勻，離心，棄上清。用300 μL在流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.4Th17細(xì)胞的檢測(cè)取外周靜脈血3 mL，加入分離液，離心，分離吸出單個(gè)核細(xì)胞，0.9%氯化鈉液多次洗滌，棄上清液，稀釋細(xì)胞，于5%CO2溫箱培養(yǎng)5 h，分為測(cè)定管和對(duì)照管；各加入2 mL PBS，離心，棄上清；加入各類型的單克隆抗體，混勻，避光放置20 min；以PBS多次洗滌，于測(cè)定管和對(duì)照管加入100 μL破膜劑，混勻，避光放置，離心，棄上清；于測(cè)定管、對(duì)照管加入20 μL 的IL-17A-FITC 20 μL，混勻，避光放置；加入3 mL的PBS，混勻，避光放置，離心，棄上清；加入0.5 mL的PBS，重懸細(xì)胞，混勻，避光放置，上機(jī)檢測(cè)。采用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清TBIL、DBIL、ALT、AST水平。1.5肝功能及病毒學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)采用熒光聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)定量核酸分析儀檢測(cè)HBV-DNA水平；釆用全自動(dòng)發(fā)光免疫分析儀檢測(cè)HBeAg水平；分析所有患者治療第4、8、12、24、36、48周的Treg細(xì)胞頻數(shù)、Th17細(xì)胞頻數(shù)及Th17/Treg比值。對(duì)比治療前后的TBIL、DBIL、ALT、AST、HBV-DNA、HBeAg，探討Treg細(xì)胞頻數(shù)、Th17細(xì)胞頻數(shù)與TBIL、DBIL、ALT、AST、HBV-DNA、HBeAg的相關(guān)性。

2 　結(jié)　果

2.1治療期間Treg、Th17細(xì)胞頻數(shù)的變化用替比夫定抗HBV過程中，患者Treg細(xì)胞頻數(shù)呈先下降后上升趨勢(shì)，于治療第8周時(shí)達(dá)最低水平；Th17細(xì)胞頻數(shù)呈下降趨勢(shì)；Th17/Treg比值呈下降趨勢(shì)，于治療24周后趨于穩(wěn)定(表1)。

2.2治療前后各項(xiàng)指標(biāo)的對(duì)比結(jié)果(表2)表明：核苷類似物治療48周后，TBIL、DBIL、ALT、AST、HBV-DNA、HBeAg水平均顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1　治療過程中Treg、Th17細(xì)胞頻數(shù)與Th17/Treg比值的變化　n=30，

表2　治療前后各項(xiàng)指標(biāo)的比較　　n=30，

2.3Treg、Th17細(xì)胞與臨床療效指標(biāo)的相關(guān)性分析Th17/Treg比值在治療第4周開始下降，在第12周達(dá)最低值(表1)。在治療第12周時(shí)，Treg細(xì)胞頻數(shù)與HBV-DNA、HBeAg水平正相關(guān)(P<0.05)，Th17細(xì)胞頻數(shù)與TBIL、DBIL、ALT、AST水平正相關(guān)(P<0.05；表3)。

表3　Treg、Th17細(xì)胞與臨床療效指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)　n=30，

*P<0.05

3　討　論

HBeAg陽(yáng)性慢性乙型肝炎的損傷性免疫反應(yīng)中有多種免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子參與，其中Treg/Th17平衡狀態(tài)被打破是HBV感染發(fā)病的關(guān)鍵[6-7]。Th17、Treg細(xì)胞均作為CD4+T細(xì)胞亞型在HBeAg陽(yáng)性慢性乙型肝炎中發(fā)揮重要的免疫損傷作用。在病情發(fā)展的不同階段，存在不同水平的Th17及Treg細(xì)胞頻數(shù)，Treg/Th17失衡程度也不同。有研究[8]認(rèn)為，Treg/Th17失衡作為免疫功能紊亂的重要指標(biāo)，會(huì)導(dǎo)致HBV的持續(xù)感染，使病情持續(xù)發(fā)展及惡化。

研究[9]表明，Treg細(xì)胞作為導(dǎo)致免疫耐受的主要細(xì)胞，可維持機(jī)體的免疫耐受和免疫平衡，參與HBeAg陽(yáng)性慢性乙型肝炎的免疫耐受。Th17細(xì)胞作為導(dǎo)致免疫炎癥損傷的主要細(xì)胞，可分泌多種因子，激發(fā)組織炎癥，導(dǎo)致肝損傷。有研究[10-11]認(rèn)為，HBeAg陽(yáng)性慢性乙型肝炎患者Treg/Th17失衡，Th17及Treg細(xì)胞顯著增加，以Treg細(xì)胞增加為主。對(duì)此，維持Treg/Th17平衡，維持Th17及Treg細(xì)胞頻數(shù)處于合理水平，有利于提高對(duì)HBV-DNA、HBeAg的清除率，改善肝功能，促進(jìn)HBeAg陽(yáng)性慢性乙型肝炎的轉(zhuǎn)歸。

替比夫定作為強(qiáng)效的核苷類似物，廣泛用于抗HBV，具有強(qiáng)效抑制HBV復(fù)制及HBeAg血清轉(zhuǎn)換率高的特點(diǎn)。本研究中，治療后TBIL、DBIL、ALT、AST、HBV-DNA、HBeAg水平均顯著下降，提示核苷類似物抗HBV的效果確切，可顯著改善肝功能、抑制病毒復(fù)制及清除病毒。有報(bào)道[12-13]指出，核苷類似物抗HBV過程中，快速抑制病毒復(fù)制與Treg細(xì)胞頻數(shù)下降密切相關(guān)。由于Treg細(xì)胞頻數(shù)與Th17細(xì)胞頻數(shù)負(fù)相關(guān)，持續(xù)性Treg細(xì)胞頻數(shù)下降，可導(dǎo)致Th17細(xì)胞頻數(shù)出現(xiàn)短暫性升高，有利于進(jìn)一步增強(qiáng)對(duì)HBV的消除能力。

本研究顯示，HBeAg陽(yáng)性慢性乙型肝炎患者采用替比夫定抗HBV過程中， Treg細(xì)胞頻數(shù)呈先下降，后上升趨勢(shì)，于治療第8周時(shí)達(dá)最低水平；Th17細(xì)胞頻數(shù)呈下降趨勢(shì)；Th17/Treg比值呈下降趨勢(shì)，于治療24周后趨于穩(wěn)定，提示核苷類似物治療使患者機(jī)體免疫狀態(tài)激活，而病情穩(wěn)定后機(jī)體進(jìn)入免疫控制狀態(tài)。TBIL、DBIL、ALT、AST均為肝功能指標(biāo)。HBeAg陽(yáng)性慢性乙型肝炎患者的TBIL、DBIL、ALT、AST水平均高于健康者。HBV-DNA、HBeAg為HBeAg陽(yáng)性慢性乙型肝炎的預(yù)后指標(biāo)。在核苷類似物抗HBV治療前后，HBV-DNA、HBeAg水平的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究中TBIL、DBIL、ALT、AST、HBV-DNA、HBeAg治療前后的變化與研究[14-15]相似。在本研究中，Treg細(xì)胞頻數(shù)與HBV-DNA、HBeAg水平正相關(guān)(P<0.05)，Th17細(xì)胞頻數(shù)與TBIL、DBIL、ALT、AST水平正相關(guān)(P<0.05)，進(jìn)一步提示Treg細(xì)胞參與免疫耐受狀態(tài)，與病情嚴(yán)重程度正相關(guān)，而Th17細(xì)胞參與免疫損傷過程。

綜上所述，核苷類似物抗HBV的效果確切，可顯著改善肝功能、抑制病毒復(fù)制及清除病毒。Th17/Treg比值作為肝功能監(jiān)測(cè)指標(biāo)，為慢性乙型肝炎的治療及預(yù)后評(píng)估提供了依據(jù)。

[1]Chen Y,Fang J,Chen X,et al.Effects of the Treg/Th17 cell balance and their associated cytokines in patients with hepatitis B infection[J].Exp Ther Med,2015,9(2):573-578.

[2]Liang XS,Li CZ,Zhou Y,et al.Changes in circulating Foxp3(+) regulatory T cells and interleukin-17-producing T helper cells during HBV-related acute-on-chronic liver failure[J].World J Gastroenterol,2014,20(26): 8558-8571.

[3]Li J,Shi J,Ren W,et al.Regulatory role of CD4(+)CD25 (+)Foxp3 (+) regulatory T cells on IL-17-secreting T cells in chronic hepatitis B patients[J].Dig Dis Sci,2014,59(7):1475-1483.

[4]Niu YH,Yin DL,Liu HL,et al.Restoring the Treg cell to Th17 cell ratio may alleviate HBV-related acute-on-chronic liver failure[J].World J Gastroenterol,2013,19(26):4146-4154.

[5]Zhang GL,Xie DY,Lin BL,et al.Imbalance of interleukin-17-producing CD4 T cells/regulatory T cells axis occurs in remission stage of patients with hepatitis B virus-related acute-on-chronic liver failure[J].J Gastroenterol Hepatol,2013,28(3):513-521.

[6]Xue-Song L,Cheng-Zhong L,Ying Z,et al.Changes of Treg and Th17 cells balance in the development of acute and chronic hepatitis B virus infection[J].BMC Gastroenterol, 2012, 12:43.

[7]Zhai S,Zhang L,Dang S,et al.The ratio of Th-17 to Treg cells is associated with survival of patients with acute-on-chronic hepatitis B liver failure[J].Viral Immunol,2011,24(4):303-310.

[8]Cheng LS,Liu Y,Jiang W.Restoring homeostasis of CD4+T cells in hepatitis-B-virus-related liver fibrosis[J].World J Gastroenterol,2015,21(38):10721-10731.

[9]Li J,Qiu SJ,She WM,et al.Significance of the balance between regulatory T (Treg) and T helper 17 (Th17) cells during hepatitis B virus related liver fibrosis[J].PLoS One,2012,7(6):e39307.

[10]Li J,Wang FP,She WM,et al.Enhanced high-mobility group box 1 (HMGB1) modulates regulatory T cells (Treg)/T helper 17 (Th17) balance via toll-like receptor (TLR)-4-interleukin (IL)-6 pathway in patients with chronic hepatitis B[J].J Viral Hepat,2014,21(2):129-140.

[11]Su ZJ,Yu XP,Guo RY,et al.Changes in the balance between Treg and Th17 cells in patients with chronic hepatitis B[J].Diagn Microbiol Infect Dis,2013,76(4):437-444.

[12]Li J,Wu W,Peng G,et al.HBcAg induces interleukin-10 production, inhibiting HBcAg-specific Th17 responses in chronic hepatitis B patients[J].Immunol Cell Biol,2010,88(8):834-841.

[13]Zhang L,Wang Q,Zhao P,et al.Effects of entecavir on peripheral blood lymphocyte profiles in chronic hepatitis B patients with suboptimal responses to adefovir[J].Clin Exp Pharmacol Physiol,2014,41(7):514-523.

[14]Ge J,Wang K,Meng QH,et al.Implication of Th17 and Th1 cells in patients with chronic active hepatitis B[J].J Clin Immunol,2010,30(1):60-67.

[15]Wu W,Li J,Chen F,et al.Circulating Th17 cells frequency is associated with the disease progression in HBV infected patients[J].J Gastroenterol Hepatol,2010,25(4):750-757.

[本文編輯]葉婷， 曉璐

Dynamic change of Th17 and Treg cells frequency in nucleoside analogues anti-HBV treatment

YU Yong-qin, LI Yi, CHEN Tan-sheng, Lü Qi-jun, ZHOU Fang

Department of Infectious Diseases, Central Hospital of Dongying Shengli Oil Field, Dongying 257034, Shandong, China

Objective： To investigate dynamic change of T helper 17 cells (Th17) and regulatory T cells(Treg) frequency in hepatitis B e antigen(HBeAg) positive chronic hepatitis B patients receiving nucleoside analogues treatment. Methods： A total of 30 chronic hepatitis B patients with positive HBeAg were enrolled. All the patients received telbivudine antiviral treatment. The peripheral blood Treg cell frequency, Th17 cell frequency and Th17/Treg ratio were detected before treatment and at 4th, 8th, 12th, 24th, 36th, 48thweeks after treatment. The total bilirubin in serum (TBIL), direct bilirubin in serum (DBIL), alanine transaminase (ALT), aspertate aminotransferase (AST), hepatitis B virus DNA (HBV-DNA) and HBeAg level were detected and compared between before and after treatment. The correlations of Treg cell frequency and Th17 cell frequency with the indexes of TBIL, DBIL, ALT, AST, HBV-DNA, HBeAg were analyzed, respectively. Results： Treg cell frequency was decreased then increased and reached the minimum point at 8thweeks after treatment. Th17 cell frequency decreased during treatment; and Th17/Treg ratio decreased and was stable at 24th, 36th, 48thweek after treatment. The levels of TBIL, DBIL, ALT, AST, HBV-DNA and HBeAg were significantly decreased after treatment (P<0.05). Treg cell frequency was positively correlated with HBV-DNA and HBeAg levels (P<0.05). Th17 cell frequency was positively correlated with TBIL, DBIL, ALT and AST levels (P<0.05). Conclusions： Treg cell frequency, Th17 cell frequency and Th17/Treg ratio shows dynamic changes during nucleoside analogues treatment for HBeAg positive chronic hepatitis B patients. They are correlated with liver function indexes after treatment; they can provide evidence for clinical treatment and prognosis evaluation.

chronic hepatitis B; telbivudine; Th17 cell; Treg cell

2016-01-13[接受日期]2016-04-08

余永勤,主任醫(yī)師.E-mail: yuyong_qin@sina.com

10.12025/j.issn.1008-6358.2016.20160286

R 512.6

A